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正交实验法优化地龙粉混合酶酶解工艺

范文

吕迎兰田玉婷毛会秀刘金虎陶然方园毕建云王集会

摘 ?????要：探索了地龙粉混合酶（弹性蛋白酶和胰蛋白酶）酶解最佳工艺。在单因素实验基础上，采取正交实验对地龙粉进行酶解。以酶解时间、酶解温度、pH、加酶量为自变量，以地龙粉水解度为因变量，采用L9（43）正交实验表进行实验。各因素对实验结果影响顺序为：C>B>D>A。最佳酶解工艺条件为酶解时间8 h，酶解温度55 ℃，pH=8，加酶量3 000 U，水解度达52.96%。

关 ?键 ?词：地龙粉;正交实验;弹性蛋白酶;胰蛋白酶;水解度

中图分类号：O657.3 ??????文献标识码： A ??????文章编号： 1671-0460（2019）06-1174-04

Abstract： In order to explore the optimum enzymatic hydrolysis process of earthworm powder mixed enzymes （elastase and trypsin），on the basis of single factor experiment， the enzymatic hydrolysis of earthworm powder was carried out by orthogonal experiment. Taking enzymolysis time，enzymolysis temperature，pH and enzymes amount as independent variables， and taking the DH of earthworm powder as dependent variable， L9（43） orthogonal experimental table was used to carry out the experiment. The results showed that the influence degree of those factors to DH of earthworm powder in turn was： pH> enzymolysis temperature> enzymolysis time> enzymes amount. The best process condition was as follows： the enzymolysis time 8 h， the enzymolysis temperature 55 ℃， pH=8， and enzymes amount 3 000 U. Under above conditions， the DH was up to 52.96%.

Key words： Earthworm powder; Orthogonal experiment; Elastase; Trypsin; DH

地龙，又名蚯蚓、曲蟮，为蚯蚓的干燥体。地龙是我国重要的传统中药材，古典中记载其有平肝息风、通经活络、平喘、利尿等作用[1，2]。近年研究表明，中药地龙的化学成分有蚓激酶、蛋白质、氨基酸等，其中包括了人体必需的8种氨基酸[3]。现代研究指出，地龙具有抗凝血、抗血栓、解热、抗炎、镇痛等作用[4]，其抗肿瘤作用成为研究热点之一。

从古至今，地龙的炮制方法有酒制法、滑石粉炒制、蛤粉炒制、醋制等，临床所用煎煮液存在服用量大、易被污染等不足[5]。有研究表明，动物类药材有效活性成分主要为小肽[6]。且从蛋白质中得到的小肽，可作为研发和开发新药的先导物[7]。有实验结果证明地龙粉酶解最佳用酶为弹性蛋白酶和胰蛋白酶混合使用[8]。本实验拟采用此两种酶混合使用，以温度、时间、pH和酶用量为变量因素，以水解度为指标设计正交实验优化地龙粉酶解工艺。

1 ?实验部分

1.1 ?仪器[8]

FA1204B电子天平（上海天美天平仪器有限公司）;远红外辐射干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司）;PHS-25pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）;HH-4数显恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;ST 16R高速冷冻离心机[赛默飞世尔科技（中国）有限公司];UV9100B型紫外可见分光光度计（北京莱伯泰仪器有限公司）;KQ-500GVDV型双频恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 ?试剂

乙醇（无水乙醇）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司）;D-果糖（北京西中化工厂）;水合茚三酮（上海源聚生物科技有限公司）;弹性蛋白酶（上海源叶生物科技有限公司）;甘氨酸、胰蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 ?供試品

地龙粉（批号：20180201），购自安徽亳州。

2 ?实验技术路线

2.1 ?标准曲线的绘制

2.1.1 ?茚三酮显色剂的配制[9]

分别精密称取磷酸二氢钾6.00 g，茚三酮0.50 g，磷酸氢二钠10.00 g， D-果糖0.30 g，加蒸馏水置于烧杯中溶解，再定容至100 mL，得新鲜茚三酮显色剂以备用。

2.1.2 ?甘氨酸标准曲线的绘制

精密称取干燥至恒重的甘氨酸0.100 0 g，用蒸馏水溶解后转移至100 mL容量瓶定容，用移液枪精准取出2.00至100 mL容量瓶中定容，得20 ?g/mL 的溶液，分别从中取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL定容至10 mL，配成浓度为0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 ?g/mL的标准溶液，分别取2.00 mL稀释液于干燥洁净的具塞试管中，分别加入1.00 mL已配制好的新鲜茚三酮显色剂，混匀后于100 ℃水浴锅中加热15 min，取出后放冷至室温，分别加入5.00 mL配制好的 40%乙醇溶液（现配现用）混匀，放置15 min，置于紫外可见可见分光光度计中，设定波长570 nm处测定吸光度A，再绘制标准曲线。

2.2 ?地龙粉水提液的制备

精密称取1.000 0 g地龙粉，置于100 mL干燥洁净的具塞锥形瓶中，加30 mL蒸馏水，置于超声提取器中，进行超声30 min，按照实验方案所设条件处理。酶解过程中保持温度和pH值的恒定，pH值每隔1 h调1次。酶解结束，在4 ℃，3 000 r/min条件下离心10 min后进行抽滤。所得滤液定容至100 mL，得供试品溶液。将供试品溶液按照2.1.2项方法测定水解度。

凯氏定氮法测定地龙冻干粉总氮量[10]。

2.3 ?水解度的计算

按照2.1项及2.2项方法可计算地龙粉中游离氨基含量，可得出地龙粉中总氮量，再换算为氨基含量。按照下列公式计算水解度（DH）。

水解度（DH）%=肽键数已水解/总肽键数原料中×100%=（B-C）/（A-C）×100%

式中：A为地龙粉中总氮数;B为地龙粉经蛋白酶酶解后的游离氨基氮数;C为地龙粉水提液中游离的氨基氮数。

2.4 ?单因素实验

2.4.1 ?pH对地龙粉水解度的影响

以地龙粉经酶解后的水解度为参考标准，在固定酶解时间4 h，固定酶解温度35 ℃，固定加酶量2 000 U的条件下，测定不同pH（6，7，8，9，10）水平下地龙粉的水解度。

2.4.2 ?温度对地龙粉水解度的影响[11，12]

以地龙粉经酶解后的水解度为参考标准，在固定pH=8，固定加酶量2000 U，固定酶解时间4h的条件下，测定不同温度（40，45，50℃，55，60 ℃）水平下地龙粉的水解度。

2.4.3 ?时间对地龙粉水解度的影响

以地龙粉经酶解后的水解度为参考标准，在固定酶解温度35 ℃，固定加酶量2 000 U，固定pH=8的条件下，测定不同时间（4，5，6，7，8 h）水平下地龙粉的水解度。

2.4.4 ?加酶量对地龙粉水解度的影响

以地龙粉经酶解后的水解度为参考标准，在固定酶解时间4 h，固定pH=8，固定酶解温度35 ℃的条件下，测定不同加酶量（1 500，2 000，2 500，3 000 U，3 500 U）水平下地龙粉的水解度。

2.5 ?正交实验

通过单因素实验，各个因素筛选出三个水平，采用L9（43）正交实验表设计四因素三水平的正交实驗。

2.6 ?数据处理

使用spss软件处理正交实验数据结果。

3 ?实验数据分析

3.1 ?标准曲线

以甘氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标所得标准曲线为Y=0.467X+0.001 9（r2=0.998 6）。

用凯氏定氮法测得1.000 0 g地龙粉中总含氮量为52.048 mg。

3.2 ?单因素实验结果

3.2.1 ?酶解时间对水解度的影响

据图1可知，在4～6 h范围内，水解度呈现先升高，在6 h达最大，而后持平的趋势。原因可能是在一定酶解时间内，底物水解度与酶解时间呈正相关，在6 h时达到饱和。由于时间延长，地龙粉逐渐被转化，其中大分子蛋白质被分解为小分子物质[13];同时也与蛋白酶自身寿命有关[16]，两者综合影响导致水解度下降。因此选定6、7、8 h作为正交实验中地龙粉酶解时间的三个水平。

3.2.2 ?酶解温度对水解度的影响

从图2中可看出在35～60 ℃范围内，35～55 ℃时持续上升，55 ℃时水解度达最大，据此可推测弹性蛋白酶与胰蛋白酶混合后在55 ℃时的体外活性最佳。原因可能是温度较低时酶的活力较低，而温度过高酶的空间结构会遭到永久性破坏，致使水解度降低[16]。因此选定50、55、60 ℃为正交实验中地龙粉酶解温度的三个水平。

3.2.3 ?pH对水解度的影响

从图3可看出在pH=6～10的这段范围里，水解度先上升，到pH=8时达到最大，然后下降。有研究也表明弹性蛋白酶和胰蛋白酶的适宜pH为弱碱性环境[14-16]。因此选定pH=7、8、9为正交实验中地龙粉酶解所用pH的三个水平。

3.2.4 ?加酶量对水解度的影响

据图4可知，在1 500～3 500 U范围内，水解度呈现先升高而后持平的趋势，在3 000 U时达持平。表明在3 000 U时1.000 0 g地龙粉所需蛋白酶用量达到饱和。因此选定2 500、3 000、3 500 U为正交实验中地龙粉酶解所用加酶量的三个水平。

在单因素实验基础上，选取四个因素（时间、温度、pH、加酶量），每个因素选取三个水平，如表1所示。

3.4 ?最佳工艺条件的验证[17]

根据所筛选的最佳工艺条件（8 h，55 ℃，pH=8，3 000 U），在此条件下进行三次平行实验，实验结果分别为53.46%、52.76%、52.66%，平均值为52.96%。

4 ?讨论

地龙是传统的虫类中药，其主要成分为蛋白质、氨基酸等。经酶解工艺处理的蛋白质，可降解成小分子肽和氨基酸[18]，具有毒性低、靶向性高、易吸收等优势[16]。在之前的研究工作中用五种蛋白酶对地龙粉进行酶解，经过筛选最终确定地龙粉酶解用佳酶为弹性蛋白酶和胰蛋白酶。据此本实验采取弹性蛋白酶和胰蛋白酶混合使用来对地龙粉进行酶解且对酶解条件进行优化。

经过单因素实验及正交实验优选出最佳酶解工艺为A3B2C2D3，即酶解时间8 h，酶解温度55 ℃，pH=8，加酶量为3 000 U，在此条件下水解度高达52.96%。且经过方差分析，温度、pH、加酶量、时间四种因素均为地龙粉酶解工艺的主要影响因素，这将为下一步制备新药、抗肿瘤研究提供依据。

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