| 标题 | 法医病理学中二代测序技术的应用 |
| 范文 | 黄桂炀 褚旭峰 熊博 摘 要 二代测序技术在近十年发展迅速，从临床和基础实验室走向了各个应用领域。本文总结阐述了其在法医病理学中关键问题的应用进展，包括死亡时间推断，土壤来源鉴定以及年龄推断等等，并分析比较了通过新旧方法解决这些问题各自的优缺点。最后，讨论了二代测序技术对未来法医科研与数据库建立的影响及作用，以供法医行业研究者参考。 关键词 法医 法医病理学 二代测序技术 作者简介：黄桂炀、褚旭峰、熊博，华中科技大学同济医学院法医学系。 中图分类号：D919 ???????????????????????????????????????????????????????????文献标识码：A ???????????? ???????????DOI：10.19387/j.cnki.1009-0592.2019.04.226 一、背景介绍 法医病理学研究涉及法律有关的伤、残、病、死的变化及发展规律 。这是一门为司法服务的科学，其运用相关的医学专业知识来为侦查提供线索，为审判提供证据。具体地说，法医病理学主要的任务是解决死亡的原因、方式、时间、地点，个人识别和致伤物的推断。传统上对这些问题的鉴定主要依靠一些宏观的表现来进行判断，如尸体现象、骨骼形态、牙齿磨损等，但这其中存在一个主观性的影响。寻找一个好的客观的鉴定方法可以使结果更加可靠，更好地维护司法公正。基于个体遗传信息的测序技术是一个值得尝试的方法。 在人类基因组计划中科学家运用第一代测序技术完成了人类基因组草图的构建。该项目当时耗时10余年，花费金额近30亿美元，损耗的人力物力巨大。这使得这项技术难以被应用到实践中去。于是科学家开始了对新一代测序技术的研究和开发。近些年来，测序技术快速发展，以illumina为首的二代测序技术被广泛应用于生命科学领域。与一代测序技术相比，其测序的通量有了极大地提高，使得成本大幅下降的同时效率增加。本文将回顾法医病理学中的一些主要问题，并阐述二代测序技术的引入对解决这些问题带来的新手段，新思考。 二、死亡原因的推断 在过去有很多死亡通过传统的尸检手段无法找到特征性的症状或器质性的损伤，被定为死因不明或无法给出明确诊断，使得对死亡方式和案件性质的判断产生困难。随着二代测序技术的发展，分子检测的成本降低。研究人员开始对死者的基因信息进行研究，并借此对这部分死因不明的案件给出解释。分子解剖的概念随即被提出，个别案例中研究人员通过对死者进行分子解剖发现了可能与死因相关的遗传学证据 。这些个案由于样本数过少，所获得的结论缺乏说服力。另外一些团队收集了过去几年中死因不明的案例，进行分子解剖。Bagnall RD等通过对2005-2009年间的28例不明原因猝死个体的样本进行全外显子组测序，发现了位于QT间期延长综合征相关基因KCNH2上的2个罕见突变以及位于心律失常和心肌病相关的基因上的6个罕见突变。Narula N等对14例不明死因的猝死个体的样本进行全外显子组测序，发现七个错义突变以及一个框內插入突变，其中两个被预测为有害突变。尽管多样本研究的结果更加有可信度，但直接以此来解释这类的死亡原因依旧充满风险。 行之有效的方案是不明原因死亡案例数据库的建立，此数据库可以筛选，汇总由不明原因死亡案例进行分子解剖后获得的测序数据。这使得研究者有足够大的样本量来对这些风险因素做明确的评估。 三、死亡时间的推断 死亡时间是确定案件侦破方向，筛选排查犯罪嫌疑人的重要依据。死亡时间推断也经历了很多发展阶段，拥有很多成果。如通过早期尸体现象如尸僵程度，尸冷现象;胃内容物消化程度;法医昆虫学证据;玻璃体液钾离子浓度等方法判断死亡时间。但在某些环境复杂的案件中，难以加以应用。 近年来，随着二代测序技术的发展，微生物组群的研究被广泛地开展。由于微生物可以生存在各个季节以及各种极端环境中，并且随着环境呈现可预测的菌群变化，所以其可以作为推断死亡时间的工具。最近基于二代测序的研究表明，在动物死后腹腔，皮肤及尸体下的土壤中的微生物菌群结构存在演替 ，Jessica L Metcalf等通过二代测序对死后48天内的小鼠不同部位的组织和周围土壤的微生物16SrRNA和18SrRNA进行测序获得相对丰度信息，并使用随机森林法构建预测模型，结果显示0-34天的小鼠头部皮肤的微生物信息拥有3.30？.52天的最高预测精度。目前人类尸体肠道，皮肤，周围土壤中微生物的菌群演替也被证实，但适用于人体死亡时间推断的模型还尚有待完善。除此之外，在人体死后RNA的表达水平会发生剧烈的变化。Pedro G. Ferreira等利用二代测序技术对死亡时间分布在17-1739分钟的540个供体的7105份样本进行RNA-seq分析，并通过梯度提升树建立PMI回归模型，该模型的预测精度可达63.75？.45 分钟。 二代測序技术的应用使得死亡时间推断从宏观水平逐渐向着分子水平发展，从基于经验规律的判断转向基于分子生物学基础的客观分析。未来研究人员有望通过低成本，高通量的二代测序技术快速地累积大量相关数据，并结合机器学习算法建立出精度更高的预测模型。 四、死亡地点的推断 土壤具有地域差异性、样本易获得以及接触易沾染的特点。对其来源的鉴定可以帮助办案人员更精确地推断死亡地点的范围。传统土壤来源鉴定方法主要是通过地质分析（粒度分析、颜色分析、X射线衍射分析、偏光显微镜分析等）、t-RFLP、ARDRA以及RISA。二代测序技术出现后，宏基因组测序 、DNA宏条形码分析 等技术被相继应用于土壤来源鉴定。SandrineDeman鑓he等通过二代测序技术对三个已知来源的土壤进行宏基因组分析，通过生物信息学分析成功地将其区分，并在此基础上对两个来源于上述三个地区的土壤样本进行盲测，分析结果与这两个土壤样本的来源基本吻合。Jennifer M.Young等通过二代测序技术对相距14公里的两地采集的8个土壤样本进行DNA宏条形码分析，并比较4种分子标记（18SrRNA，16SrRNA， ITS1， plant trnL）在土壤鉴定中的效能，结果证明DNA宏条形码技术可用于土壤来源鉴定，并ITS1具有最高的85.6%的差异度。 获得更多地区的微生物菌群结构有助于土壤来源的鉴定。地球微生物组计划提供了这样的一个数据获取平台 ，但目前仍在起步阶段，更多的土壤微生物数据有待研究人员通过二代测序等高通量技术获取分享。 五、年龄的推断 年龄推断可以有效的排查死者或犯罪嫌疑人的范围，提供正确的侦查方向。在过去法医人类学年龄推断的方法如牙齿磨损程度等太过主观。随后又出现了端粒长度，端粒酶活性，线粒体DNA突变等方法，但缺乏可重复性没有用于实践。 DNA甲基化作为表观遗传学标记在不同的年龄阶段存在差异。研究人员建立了一系列基于DNA甲基化的年龄推断体系，并创建了一系列对应的算法成功地将年龄推断的精度不断提高。2016年Cheng Xu等对8对同卵双胞胎进行检测，筛选出了11个年龄相关CpG位点，建立并优化了计算模型，且在49个无关个体中进行验证，结果显示其推断的MAD为2.8年。随后Jana Naue等通过二代测序技术检测208名个体中13个CpG位点的信息，并通过随机森林法建立了一年龄推断模型，在104名个体中进行验证，证明其年龄推断的MAD为3.16年。还有研究发现miRNA与年龄变化具有密切的关系 。2015年，Zhang等通过二代测序技术对173名个体进行检测，将其分为平均年龄为22、40、59、70的四组进行研究，发现了与年龄相关的10个microRNA。microRNA具有用于年龄推断的潜力，但目前基于microRNA的年龄推断方法还尚未在文献中报道。 在二代测序平台的支持下，更多相关位点被筛选，且年龄推断模型也在不断完善。年龄推断的精准度和可靠性相信在未来也会达到一个令人满意的程度。 六、总结与展望 二代测序技术的出现给生命科学领域提供了一个有效的工具，使很多此前无法实现甚至难以想象的研究得以完成。其中法医病理学领域对于二代测序技术的应用仍处于起步阶段，未能真正地运用到实践当中，但其已经为一些传统重难点问题的解决指出了新的前进方向。本文主要总结了当前法医病理学对二代测序技术的一些应用探索。在回顾这些实际问题的传统应对手段的基础上，分析比较了二代测序技术的优势，并举例阐述了在现阶段所能达到的应用水平，最后提出了一些对未来研究的展望。总的来说，二代测序技术所能获得的信息量是巨大的，其中可能存在大量未被利用的数据，通过建立数据库来统筹共享这些信息有助于整个领域的研究。并且，数据库汇集更多的样本，有利于建立更加精准的推断模型。 注释： 丛斌.法医病理学（第5版）.北京：人民卫生出版社.2016. 许传超，白云志，许心舒，等.全外显子组测序对肥厚型心肌病猝死者的基因分析.法医学杂志.2017，33（4）：339-343. METCALF J L， XU Z Z， WEISS S， et al. Microbial community assembly and metabolic function during mammalian corpse decomposition. Science， 2016，351（6269）：158-162. DEMANECHE S， SCHAUSER L， DAWSON L， et al. Microbial soil community analyses for forensic science： Application to a blind test. Forensic Sci Int， 2017，270：153-158. YOUNG J M， WEYRICH L S， COOPER A. Forensic soil DNA analysis using high-throughput sequencing： A comparison of four molecular markers. Forensic Science International： Genetics， 2014，13：176-184. GILBERT J A， JANSSON J K， KNIGHT R. The Earth Microbiome project： successes and aspirations. Bmc Biol， 2014，12（1）：69. IBANEZ-VENTOSO C， YANG M， GUO S， et al. Modulated microRNA expression during adult lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell， 2006，5（3）：235-246. |
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