| 标题 | 苯并[α]芘降解菌群BaP1的富集筛选与降解特性研究 |
| 范文 | 季宇琪 王慧 梁承月 何加林 摘要：苯并[α]芘（BaP）是一种广泛分布且具有极强致癌、致畸、致突变的高环多环芳烃类物质。为获得苯并芘的高效降解菌群，本实验从长期受石油污染的土壤中富集驯化得到能以苯并[α]芘为唯一碳源生长的高效降解菌群BaP1。该菌群在30℃、150r/min震荡培养条件下，对20mg/LBaP30d降解率达62.8%。为优化降解条件，本实验探究环境因子中温度、pH值及营养物添加对BaP最终降解的影响。结果表明，在温度为25℃～37℃，pH值在6.0～8.0的范围内，BaP1始终有高效降解能力；随着温度升高，BaP1降解能力先增高后降低，最适温度为30℃；30d时降解率高达72.95%。随着pH值的增高，BaP最终降解率升高；在pH=8.04体系中，30d降解率为77.93%。酵母提取物或白胨的添加（5mg/L）同样显著提高降解菌群的最终降解率，后者促进作用更明显，达73.8%。研究发现，降解菌群BaP1对苯并[α]芘降解能力较高，降解周期短，具有较高的开发利用价值。 关键词：对苯并[α]芘；降解菌群BaP1；降解效率；环境因子 多环芳烃（PAHs）是一类广泛分布并稳定存在于自然环境中的含两个以上苯环的有毒有机污染物，具有三致作用——致癌、致畸、致突变，对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害[1]，因而PAHs污染成为一个全球迫切需要解决的环境问题。研究表明，微生物降解是环境中PAHs消失的最主要的途径[2]。 对苯并[α]芘（BaP）是一种含5个环的PAH类物质，具有极强的三致效应，而且其结构更为复杂，疏水性更强，更难直接被微生物利用。同时，它与其它多环芳烃的含量有一定的相关性，被认为大气致癌物的代表，是国内外检测污染的重要指标。因此，研究对苯并[α]芘污染的微生物修复具有重要意义。 目前，从自然界分离得到的降解BaP的微生物主要有降解细菌及少量的真菌和藻类。其中分离得到的BaP降解菌主要来自变形菌纲和放线菌纲。如Walteretal.[3]分离的Rhodococcussp.UW1在芘存在的条件下，在2周内将250mg/L的BaP降解11%；Mycobacteriumsp.strainRGJH135可以在酵母提取物或蛋白胨存在的条件下，32天后能将0.4mg/LBaP降解40%[4]；而Burkholderiacepacia在有芘存在的条件下，即使在56天后，对50mg/L的BaP的降解率仅为1.46.2%[5]；李艳秋等[6]从石油污染土壤中筛选出一株BaP高效降解菌SL1，该菌株鉴定为假单胞菌（Pseudomonassp.），28℃培养10d后，菌株SL1对BaP（5mg/L）的降解率为35.7%。从上述的研究中，我们可以看到目前分离的BaP降解菌的降解效率普遍偏低，而且通常需要有其他的底物或营养物质，以共代谢的方式降解BaP。而且单一的降解菌株作为一种生物强化的手段添加至污染环境中时，往往竞争不过土著的非降解菌，成不了优势菌属，也就无法强化修复效果。经过单一底物富集驯化的高效降解菌群BaP1，降解效率普遍增高且稳定，菌群中的细菌互相协作，往往更易形成共代谢，对于BaP这种难降解物质更具优势。因而，富集筛选高效的BaP降解菌群BaP1将为BaP的污染修复提供重要的技术支撑。 除此之外，BaP的降解还与许多环境因子相关。当缺乏必要营养物质如（N、P、K）或生长底物、適宜温度及pH值、合适的供氧量时，BaP的降解都有可能不发生。目前已有的生物修复强化方法包括提高BaP浓度，但当浓度超过阈值时，会对降解菌株产生毒性，减缓BaP的降解。还可以寻找合适温度、调节PH、添加碳源和氮源、葡糖糖等添加剂和重金属离子等强化微生物修复能力。但这些影响因子与降解菌密切相关，不能一概而论，需要逐一验证。如盛下放等[7]发现Zn2+、Cd2+和Pb2+的存在基本不影响降解菌JL14对对苯并[α]芘的降解效能，而Cu2+（50mg·L1）、Cr2+（50mg·L1）对JL14降解对苯并[α]芘有很强的抑制作用。 因此，本实验从石油污染土壤中富集筛选以对苯并[α]芘为唯一碳源和能源的高效降解菌群BaP1并研究其降解特性，以期对对苯并[α]芘污染的微生物修复提供重要的理论基础与技术支撑。 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1土样 本研究所用的土壤来自山东省胜利油田（黄海岸边）受到石油污染土壤。 1.1.2主要试剂 酵母提取物、牛肉膏、苯并[α]芘（98%纯，SigmaAldrichCo.，USA）、矿物培养基试剂（MgSO4·7H2O，CaCl2·6H2O，KH2PO4，Na2HPO4·7H2O，NaCl，NH4Cl，超纯水）、丙酮；以上均为分析纯。 1.1.3主要仪器与器材 可见光分光光度计（V1100D，美谱达，上海）；灭菌锅；超净台；生化培养箱（上海）；恒温振荡培养箱（HZQF160，上海）；100μL微量进样器（上海）；电子天平；凝胶成像系统（SOP04402，伯乐）；微滤膜（0.22μm）；台式冷冻离心机（日立，CR22G）；高效液相色谱（HPLC，岛津10Avp，日本）；5mL玻璃注射器（上海）；移液管（10mL）；锥形瓶（250mL）；离心管等。 1.1.4主要培养基及其配制 5×盐溶液的配制（200mL）：分别称取3.0gKH2PO4，12.8gNa2HPO4·7H2O，0.5gNaCl，1.0gNH4Cl，加入超纯水定容至200mL，高压灭菌待用。 矿物盐培养基的配制：分别配制5×盐溶液、1MCaCl、1MMgSO4，置于高压灭菌锅中121℃，30min，进行高压灭菌，然后在超净台中往已灭菌干燥的容量瓶中，依次加入200mL5×盐溶液、2mL1MMgSO4、适量体积的超纯水，然后再加入0.1mL1MCaCl，最终加入超纯水定量至1L。 苯并[α]芘母液的配制：称取20mg对苯并[α]芘加入20mL丙酮溶解，配制成浓度为10mg/mL的苯并[α]芘母液，过滤除菌待用。 1.2实验方法 1.2.1苯并[α]芘降解菌群BaP1的富集 向添加有100mL矿物盐培养基的250mL锥形瓶加入苯并[α]芘母液至最终苯并[α]芘浓度为10mg/L，于30℃，150rpm恒温振荡培养箱过夜，使丙酮挥发至尽。称取10g石油污染土壤和适量的玻璃珠加入该锥形瓶中，30℃，150rpm恒温振荡培养箱富集驯化，15天后，取10mL上清菌液于新鲜MSM中传代，如此3代以后，提高苯并[α]芘终浓度为20mg/L，继续如上进行传代富集驯化，直至得到稳定降解菌群BaP1（测定各代的苯并[α]芘降解率，至前后两代的降解效率相近为止） 1.2.2苯并[α]芘降解菌群BaP1群落结构分析 收集足够量的稳定降解菌群BaP1的菌悬液，离心去上清收集菌体，利用FastDNAR1SPINKitforSoil试剂盒按照其操作流程提取菌群的全基因组，由测序公司对其16SrRNA基因扩增，然后进行二代测序分析。 1.2.3菌悬液的制备 无菌条件下，降解菌群BaP1培养物接种到含苯并[α]芘无机盐培养基中，在30℃，150rpm条件下培养6d，5000rpm离心5min，去除上清液，用适量新鲜无机盐培养基（已灭菌）重悬，重复上述步骤2次，最后定容到OD600=0.425。所有降解实验均以此菌悬液为初始接种物。 1.2.4降解菌群BaP1苯并[α]芘降解曲线 将过滤除菌的苯并[α]芘母液添加到200mL经121℃，高温灭菌20min的矿物盐培养基中至苯并[α]芘的初始浓度为20mg/L，将其放置于恒温振荡培养箱中过夜以确保丙酮挥发尽。取5mL2.2.3中的菌悬液接种至上述培养基中，30℃，150rpm振荡培养。设置接种灭活菌液为对照组。在第0d、3d、6d、15d、20d、30d取样。二个对照平行样，测定苯并[α]芘残余量及OD600值。 1.2.5环境因子对苯并[α]芘降解菌群BaP1降解苯并[α]芘的影响 选择T和pH作为环境因子代表，探究其对降解菌群BaP1对苯并[α]芘降解的影响。其中温度设置为25℃、30℃、37℃三个处理，每个处理两个平行；pH值分為6.03、7.13、8.04三个处理，通过HCl和NaOH进行调节，每个处理两个平行。其它操作同2.24。在0d、15d、30d取样测定芘残余量。 1.2.6营养添加物对苯并[α]芘降解菌群BaP1降解苯并[α]芘的影响 蛋白胨和酵母粉分别溶解于高纯水，经0.22μm滤膜除菌后备用。向反应体系分别添加酵母粉和蛋白胨，至各自的终浓度为5.0mg/L。其它操作同2.24。在0d、15d、30d取样测苯并[α]芘残余量。设置只添加苯并[α]芘的矿物盐培养基为对照组，每个处理两个平行。 1.2.7实验分析方法 OD600测定：利用分光光度计，测定600nm波长下菌液吸光度。 PAHs测定：向2mL样品中加入5mL二氯甲烷，全部转移至20mL萃取瓶中，20rpm旋转萃取1.0h，5mL玻璃注射针吸取有机相经0.22um滤头过滤至棕色进样瓶，进行HPLC测定； HPLC（岛津，日本）测定条件：参考文献[8]的条件设置； 实验初始制作苯并[α]芘的浓度与峰面积的标准曲线：称取一定量的苯并[α]芘，以二氯甲烷为溶剂，制定梯度浓度的标准溶液，对PAHs标准浓度与HPLC获得的色谱峰值进行拟合，即获得各PAHs标准曲线，结果显示拟合度均在0.996以上。 1.3数据分析 数据的分析使用OriginPro9.0。 2结果与讨论 2.1苯并[α]芘降解菌群BaP1的群落结构（测序公司尚未将测序结果返回） 2.2苯并[α]芘降解菌群BaP1的降解曲线 图1显示的是苯并[α]芘降解菌群BaP1的降解曲线及其生长曲线。从图中可以看出，降解菌群BaP1接种到新鲜培养基中，仍保持较强的活力，无延滞期，菌株快速生长，细胞数急剧增加，苯并[α]芘也在被利用。第10d时，OD600达到最大值（OD600=0.825），而降解菌群BaP1在第610天降解速率达到最大值，在第2030天几乎不再降解苯并[α]芘。经过30d的培养，苯并[α]芘的终浓度为12.39mg/L，总降解率为62.8%。对照组菌群OD600和苯并[α]芘浓度几乎保持不变，即无降解无生长。 由于苯并[α]芘的难降解性，目前分离得到的苯并[α]芘降解菌群BaP1较少。如与郑天凌等[1]自热带太平洋中部和东部的多金属结核区深海沉积物中分离得到几组苯并[α]芘降解深海微生物群DS2、DS10（60d后分别对BaP代谢了40.87%、41.39%），另外还有多组混合菌DS8、DS24、DS26（降解率都接近40%）。而近期费莹莹等[9]检测发现新疆煤炭污染土壤中重度污染样品中的群体微生物对苯并[α]芘的降解率明显高于轻度和中度污染样品，达到78.4%，轻度（L）、中度（M）、重度（H）煤炭污染土样菌群在胁迫培养第1代后，对苯并[α]芘的降解率达到65.8%、81.9%、54.7%。比较而言，本研究富集得到苯并[α]芘降解菌群BaP1降解效率虽然较新疆煤炭污染土壤中重度污染样品降解菌群BaP1的低，但是降解周期短，仍具有较好的应用价值。 2.3环境因子对苯并[α]芘降解菌群BaP1降解苯并[α]芘的影响 温度会影响降解菌群BaP1对苯并[α]芘的降解（图2），随着温度的升高，苯并[α]芘的降解率也增加。在低温时，T=25℃，降解菌群BaP1的降解率明显降低，培养30天后，降解率仍不足40%。当温度提升至T=30℃，培养30天后，降解菌群BaP1的降解率高达72.95%，相较于T=25℃（36.16%），降解率约提升了一倍。而当温度继续升高时，温度对降解菌群BaP1的降解效率的影响就不是那么显著了，T=37℃时，最终降解效率约提升了10%左右（相较于T=30℃）。温度对微生物降解效率的促进，往往主要有两个可能，一是促进了微生物的生长，大多数的微生物最适温度约为30℃左右；二是提高酶活，在达到酶的最适温度之前，温度每升高10℃，降解速率提高二到四倍。 不同pH条件下降解菌群BaP1也显示出不同的苯并[α]芘降解能力（图3），随着pH的升高，降解率略有升高。培养30天后，pH=6.03，7.13，8.04体系中降解菌群BaP1的降解率依次为：63.01%，73.05%，77.93%。而在最初的过程中（前10天），体系呈酸性（pH=6.03）或碱性（pH=8.04）都对降解菌群BaP1的降解存在抑制作用，很有可能是酸性或碱性环境使得降解菌群BaP1的延滞期加长，而在20天以后，随着pH的升高，降解菌群BaP1降解率升高。 pH是改变环境中污染物的水溶性和控制将胞外化合物转运到胞内这一过程的关键因素之一。通常认为，碱性环境比酸性环境更适合污染物生物降解。本研究中的苯并[α]芘降解菌群BaP1也表现出相似的降解现象。Pseudoxanthomonassp.DMVP2也是在碱性条件下获得最高的菲降解率[10]。M.vanbaaleniiPYR1则通过将酸性代谢产物芘二氢二醇更多地转化为甲基化衍生物来减轻酸性环境对其产生的压力[11]。 2.4营养添加物对苯并[α]芘降解菌群BaP1降解苯并[α]芘的影响 酵母提取物和蛋白胨对降解菌群BaP1降解苯并[α]芘的影响呈相似的规律（图4）。在初始10d内，外加酵母提取物、蛋白胨均抑制降解菌群BaP1对苯并[α]芘的降解，降解效率分别为25.3%和23.1%，显著低于未添加组（36.39%）。可能原因是酵母提取物和蛋白胨的生物可利用性比苯并[α]芘高，降解菌群BaP1优先利用它们生长。随着营养物不断被消耗，降解菌群BaP1转而利用苯并[α]芘为生长底物，20d后，添加酵母提取物的实验组中苯并[α]芘降解率升高至68.2%，而添加蛋白胨实验组的降解率也增加为61.3%，都显著高于未添加组的53.3%。培养30天后，酵母提取物与蛋白胨均促进了降解菌群BaP1的苯并[α]芘降解，其中蛋白胨的促进作用更明显一些，降解率高达73.8%，未添加组约为62.95%。一般而言，对于高分子量的PAHs即四环以上的，由于其化学结构的复杂性以及在水环境中的低溶解度，难以被微生物直接降解。研究表明，大多数微生物对4环以上的高分子量PAHs的降解是以共代谢的方式进行的[1]。共代谢的存在大大促进了一些难降解物质在环境中被微生物降解的可能性[12]。如ChenandAiken[13]在预先培养的PseudomonassacchaiophilaP15降解BaP体系添加菲或水杨酸时，48h后，BaP的矿化率分别是未添加组的22倍和33倍。周海燕等[14]则表示向盐环境中添加酵母粉、蛋白胨等微量营养物能克服环境中高盐度和营养不足等极端影响因素，促进微生物生长和加快底物利用，酵母粉能明显促进海旋菌TSL51对芘和苯并[α]芘的降解，而蛋白胨能使得原本不能利用苯并[α]芘为唯一碳源和能源生长的海旋菌TSL52利用苯并[α]芘，并且在25天后对苯并[α]芘的降解率达到38%。 3结论 （1）通过以苯并[α]芘为唯一碳源从石油污染土壤中富集驯化得到一个能高效降解苯并[α]芘的菌群BaP1。菌群16SrRNA基因高通量测序结果表明，该菌群主要以…… （2）在以苯并[α]芘（20mg/L）为唯一碳源的矿物盐培养基中，降解菌群BaP1BaP1几乎没有延滞期，在10d内OD600达到最大值0.825，而降解菌群BaP1在第610天降解速率達到最大值，在第2030天几乎不再降解苯并[α]芘，30天后，苯并[α]芘总降解率约为62.8%。与其他苯并[α]芘降解菌群BaP1的降解效率相比，菌群BaP1表现出较高的苯并[α]芘降解能力，具有一定的开发利用价值。 （3）降解菌群BaP1BaP1对苯并[α]芘的降解受温度与pH的影响。当温度由30℃降低至25℃，降解菌群BaP1的降解率明显降低，培养30天后，降解率不足40%（T=25℃），相较于T=30℃（降解率为72.95%）约降低了一倍。而当温度继续升高时，温度对降解菌群BaP1的降解效率的影响就不是那么显著了，T=37℃时，最终降解效率约提升了10%左右（相较于T=30℃）。在pH=6.08.0的范围内，随着pH的升高，降解菌群BaP1最终降解率升高。但在培养初期，酸性条件与碱性条件均不利于苯并[α]芘的降解。 （4）酵母提取物或白胨的添加，均在初期抑制菌群对苯并[α]芘的降解，而后促进菌群对苯并[α]芘的降解。在初始10d内，外加酵母提取物或蛋白胨的实验组中苯并[α]芘的降解效率分别为25.3%和23.1%，显著低于未添加组（36.39%）。培养30天后，外加酵母提取物或蛋白胨的实验组中苯并[α]芘的降解效率均显著高于未添加组（62.95%），其中蛋白胨的促进作用更明显一些，降解率高达73.8%。 参考文献： [1]郑天凌，骆苑蓉，曹晓星，等.高分子量多环芳烃苯并[a]芘的生物降解研究进展，应用与环境生物学报，2006，12（6），884890. 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