一株血鹦鹉迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及药敏试验

    徐赟霞　王禹　韩进刚　陈浩楠　冯守明

    

    

    

    摘要：为确定天津市某养殖场血鹦鹉（Cichlasoma var.）发病死亡的原因，并对其进行有效的预防与治疗，本试验对患病的血鹦鹉进行病原的分离鉴定、回归感染及药敏试验。从病灶处分离出一株疑似病原菌命名为XYW-1，经人工感染后具有致病性，临床症状与自然发病症状一致，半致死浓度为4.75×10 5 CFU/mL;经生化鉴定和16S rDNA序列分析，XYW-1为迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）;以18种抗生素对迟缓爱德华氏菌进行了药物敏感性测定，结果显示迟缓爱德华氏菌仅对头孢噻肟、头孢吡肟、阿莫西林、氨曲南、多西环素、氟苯尼考、氯霉素7种药物敏感。

    关键词：血鹦鹉（Cichlasoma var.）;迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）;分离鉴定;药敏试验

    迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）为肠杆菌科爱德华菌属的革兰氏阴性短杆菌，有鞭毛，无荚膜，也不形成芽孢，广泛存在于溪水、湖泊和海洋等水环境中，能感染鱼类、两栖类、爬行类、鸟类甚至哺乳类动物[1-2]，迟缓爱德华氏菌是爱德华氏菌属中唯一能够感染人的致病菌，它能引起人的肠胃炎、腹泻等，较严重的还可以引起脑膜炎和败血症等疾病[3]。近年来迟缓爱德华氏菌对鱼类健康的危害越来越严重，研究者们在斑马鱼[1]、大菱鲆[4]、斑点叉尾鮰、鲤鱼、日本鳗鲡、尼罗罗非鱼、漠斑牙鲆[5]、鳜鱼[6]、杂交鳢[7]、黄鳝[8]等中都发现有迟缓爱德华氏菌感染。

    血鹦鹉（Cichlasoma var.）又名红财神、发财鱼和财神鱼，属于淡水热带观赏鱼，由于其颜色鲜艳，形态可爱、抗病力强，对温度适应能力强等特点深受天津市市民喜爱，成为天津地区主要观赏鱼养殖品种。但是随着养殖密度的不断提高，病害也逐年增加，给养殖户造成经济损失，有报道血鹦鹉感染嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌[9-10]等，但至今尚未见有血鹦鹉感染迟缓爱德华氏菌的报道。本研究通过对患病血鹦鹉进行病原菌分离鉴定及药敏试验，以期能够找出血鹦鹉发病原因并提供用药指导，为水产养殖生产中防治迟缓爱德华菌病提供参考依据。

    1材料与方法

    1.1试验材料

    患病的和健康的血鹦鹉均来自天津市宝坻区某观赏鱼养殖场，脑心浸液肉汤培养基（BHI）、营养琼脂（NA）、水解酪蛋白培养基（MH）、药敏纸片均购自Oxoid公司;VITEK GN鉴定卡购自法国梅里埃生化公司;PCR所用的试剂购于普洛麦格（Promega）生物技术有限公司。

    1.2病原菌的分离与纯化

    在无菌条件下，从患病的血鹦鹉肝脏、脾脏、肾脏中取样，划线接种于BHI琼脂培养基上，置于培养箱内28 ℃培养24 h后，选择从肾脏中分离的优势菌落，在营养琼脂上划线纯化，直至获得纯培养的菌株，转接到营养琼脂斜面上，备用。

    1.3人工感染试验

    将健康的鹦鹉鱼（体长8.76 cm±0.64 cm，体重47.21 g±2.67 g）暂养1周，水温保持在27～28 ℃，无异常情况后进行人工感染试验。将50尾健康的鸚鹉鱼平均分成5组，将XYW-1菌株用生理盐水洗脱分别制成3×108、3×107、3×106、3×105 CFU/mL的菌悬液，取以上4个浓度的菌悬液，按照0.1 mL/尾的剂量用无菌注射器对血鹦鹉进行腹腔注射，对照组注射0.1 mL的生理盐水，持续观察5 d，并记录好死亡情况，对患病的血鹦鹉进行病原菌的分离鉴定，根据寇氏法[11]计算半致死剂量。

    1.4生理生化鉴定

    将病原菌接种在营养琼脂上，对其进行革兰氏染色，镜下观察其形态特征。在无菌条件下挑取单个菌落制成菌悬液，采用VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统和VITEK GN鉴定卡对其进行生理生化特性测定。

    1.516S rDNA基因序列鉴定及发育树构建

    挑取单个菌落于30 μL去离子水中，100 ℃金属浴10 min后，12 000 r/min离心1 min后取上清作为PCR模板。16S rRNA序列扩增引物27 F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1 492 R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。扩增条件：94 ℃预变性 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 20 s，30 个循环，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。扩增产物经电泳检测后送金唯智生物科技（天津）有限公司测序。测序结果通过NCBI中BLAST检索系统进行在线比对，选取与其同属的细菌16S rDNA基因序列，用MEGA7软件构建系统发育树。选用邻位相连法（Neighbor-joining）获得系统发育树，通过自举分析（Bootstraping）进行系统进化树的评估自举数据集为1 000次。

    1.6药敏试验

    将菌株用生理盐水稀释到0.5麦氏浓度，用无菌的棉拭子蘸取稀释好的菌悬液均匀涂布于MH平板上，待平板表面干燥后，用镊子将药敏纸片轻轻放置在平板表面并压紧，放置在28 ℃培养箱内培养24 h后用直尺量取抑菌圈直径，试验结果判断参照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）标准[12]。

    2结果

    2.1临床症状及病原菌形态特征

    患病的血鹦鹉主要表现为体表出血、溃烂，鳞片脱落，胸鳍基部肿胀，剖开鱼腹，病鱼肝脏、肾脏明显肿大，脾脏失血呈粉红色。从肾脏中分离获得的优势菌株XYW-1为革兰氏阴性短杆菌，在营养琼脂培养基上28 ℃培养24 h后，菌落为正圆形、灰白色、表面湿润、边缘整齐、凸起。

    2.2人工感染试验结果

    经人工感染发病血鹦鹉的主要临床症状与自然感染菌株的症状相似，其体表出血，鳃丝充血、有明显的溃烂。从死亡的血鹦鹉的肾脏中分离到的菌株经鉴定后与XYW-1一致，而注射无菌生理盐水的对照组无死亡现象，外观特征无明显变化，由此可以说明菌株XYW-1是引起血鹦鹉发病死亡的病原菌。根据寇氏法计算可知菌株对血鹦鹉的半致死剂量为4.75×105 CFU/mL（表1）。

    2.3病原菌的生化特征

    使用VITEK GN鉴定卡对其进行生理生化鉴定，生理生化反应见表2。XYW-1符合迟缓爱德华氏菌生理生化特性，结合细菌形态和生理生化结果可初步判定分离菌XYW-1为迟缓爱德华氏菌。

    2.416S rDNA基因序列分析结果

    病原菌XYW-1所扩增的16SrDNA基因序列长度为1 389 bp，以 NCBI 的 Blast 检索系统对其进行序列同源性分析，构建系统进化树，结果表明，XYW-1与爱德华氏菌属自然聚类，并与检索出的迟缓爱德华氏菌聚为一支，同源性高达99%以上。综合生理生化鉴定结果和16S rDNA基因序列分析结果，确定菌株XYW-1为迟缓爱德华氏菌。

    2.5药敏试验结果

    从表3可以看出，菌株XYW-1对头孢类的头孢噻肟、头孢吡肟，内酰胺类的阿莫西林、氨曲南，四环素类的多西环素和氯霉素类的氟苯尼考、氯霉素敏感;对头孢呋辛、链霉素、新霉素和利福平中度敏感;而對环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、阿奇霉素、红霉素、四环素和磺胺甲恶唑耐药。

    3讨论

    近年来，国内学者关于血鹦鹉细菌性疾病也有相关报道： 钱晓宇等[9]发现嗜水气单胞菌感染血鹦鹉，临床表现为体表出血，腹部肿大，鳃丝充血肿胀，肝脏肿大糜烂。梁利国等[10]发现铜绿假单胞菌感染血鹦鹉后，病鱼眼球肿大、突出，眼睑呈溃烂状，肝脏呈黑红色，胆囊肿大。本研究中对天津某观赏鱼养殖场病死的血鹦鹉进行了较系统的病原研究，从发病血鹦鹉肾脏分离到优势菌并作分离纯化培养，人工感染试验证实分离菌能引起健康血鹦鹉发病与死亡，再分离的细菌经细菌学鉴定为同源感染菌，经生物学及分子生物学鉴定，分离菌为迟缓爱德华氏菌。这也是首次在血鹦鹉中分离到迟缓爱德华氏菌。

    在天津市水产养殖动物发生细菌性疾病的时候大多仍采用抗菌药物来控制其发生和流行，有效合理地应用抗生素是防治鱼类细菌性疾病的重要措施之一。鱼类迟缓爱德华菌病具有流行范围广、发病率和病死率高等特点[13]，目前已有20多种鱼类可感染迟缓爱德华氏菌并致病。抗菌药物的广泛使用，导致其对多数抗生素产生耐药性，本试验中以18种抗生素对迟缓爱德华氏菌进行了药物敏感性测定，结果显示迟缓爱德华氏菌仅对头孢噻肟、头孢吡肟、阿莫西林、氨曲南、多西环素、氟苯尼考、氯霉素7种药物敏感，对其他药物都产生了不同程度的耐药，出现这种情况究其原因多半与滥用抗生素有关，另外观赏鱼在防治病害时，不需要考虑药物残留的因素，对抗菌药物使用剂量和使用频率问题也没有限制，也是造成XYW-1对抗菌药物敏感性低的原因。本研究试验结果可作为由该菌引起的血鹦鹉疾病防治选药时的参考，在生产养殖中可以使用头孢噻肟、多西环素等高敏感药物进行治疗。

    参考文献：

    [1] WANG L M，XIAO J F，CUI S L，et al.HU-induced polymorphous filamentation in fish pathogen Edwardsiella tarda leading to reduced invasion and virulence in zebrafish[J].Veterinary Microbiology，2014，171（1-2）：165-174.

    [2] SU Y B，PENG B，HAN Y，et al.Fructose restores? susceptibility? of? multidrug-resistant? Edwardsiella tarda to kanamycin[J].Journal of Proteome Research，2015，14（3）：1612-1620.

    [3] 程俊茗，万明月，周晋扬，等.鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测[J].微生物学通报，2017，44（10）：2380-2390.

    [4] HUO H H，YIN S T，JIA R，et al.Effect of crowding stress on the immune response in turbot（Scophthalmus maximus）vaccinated with attenuated Edwardsiella tarda[J].Fish & Shellfish Immunology，2017，67：353-358.

    [5] 孙莉娜.迟钝爱德华氏菌生物被膜状态下耐药相关基因与蛋白的研究[D].福州：福建农林大学，2016.

    [6] 吴勇亮，苗鹏飞，于辉，等.鳜鱼致病性迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及药敏试验[J].南方农业学报，2018，49（4）：794-799.

    [7] 陈言峰，周爱国，陈冠锋，等.养殖杂交鳢迟缓爱德华菌的分离鉴定[J].南方水产科学，2014，10（5）：1-7.

    [8] 邵建春.黄鳝源迟缓爱德华氏菌的鉴定、分型及全基因组测序[D]武汉：华中农业大学，2016.

    [9] 钱晓宇，陈成勋，丁亦屿，等.一株血鹦鹉嗜水气单胞菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2015，37（8）：604-607.

    [10] 梁利国，秦国民，张晓君，等.血鹦鹉铜绿假单胞菌病原菌鉴定和药敏试验[J].淡水渔业，2010，40（6）：50-55.

    [11] 李翠萍，吴民耀，王宏元.3种半数致死浓度计算方法之比较[J].动物医学进展，2012，33（9）：89-92.

    [12] National Committee for Clinical Laboratory Standards.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing，29th informational supplement Nccls document [M].100-S15.Wayne：NCCLS，2019：1-243.

    [13] 郑大海，麦康森.迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）研究概況[J].海洋湖沼通报，2004，26（1）：52-59.

    Isolation， identification and drug sensitivity test of a strain of Edwardsiella tardata from Cichlasoma var.

    XU Yunxia， WANG Yu， Han Jingang ，Chen Haonan，FENG Shouming

    （Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center， Tianjin 300402，China）

    Abstract：In order to determine the causes of the disease and death of Cichlasoma var.in Tianjin， and to effectively prevent and treat them， the pathogen isolation and identification， regression infection and drug sensitivity tests were carried out on Cichlasoma var.in this study.A pathogenic bacteria named XYW-1 was isolated from the affected Cichlasoma var.， the artificial infection was pathogenic， and produced the similar clinical symptoms in artificially infected Cichlasoma var.as the naturally infected cases， and LCD was 4.75×105 CFU/mL. By physiological and biochemical analysis and 16S rDNA sequence analysis， XYW-1 was Edwardsiella tarda. In this experiment， 18 antibiotics were used to test the drug sensitivity of Edwardsiella tarda，and the results showed that Edwardsiella tarda was only sensitive to 7 of them， including cefotaxime， cefepime， amoxicillin， amtronam， doxycycline， florfenicol and chloramphenicol.

    Key words：Cichlasoma var.; Edwardsiella tarda; isolation and identification; drug sensitivity test

    （收稿日期：2021-05-08）