克氏原螯虾消化道一种新型抗菌物质的分离与鉴定
黄畅+高建军
摘要：克氏原螯虾（Procambarus clarkii ）俗称口味虾，是我国南方的著名食用虾，也是目前全世界养殖范围最广的淡水螯虾。我们选择活体克氏原螯虾肠道组织为材料，经过超声破碎、高效液相色谱分离、质谱和光谱分析、抗菌活性检测。发现螯虾肠道含有一种相对分子质量为245.17的新型化合物PC245，其最大吸收波长237nm，同时对嗜水气单孢菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的抑菌作用。实验结果表明：该抗菌活性物质是一种广谱、高效的新型抗菌天然产物，
具有潜在的开发利用价值。
关键词：克氏原螯虾；消化道；抑菌活性；分离；鉴定
人类为了预防、治疗微生物引起的疾病传播，发明了多种有效抗菌物质，并将它们添加到食品、日用品和保健品中，其中使用最广泛的就是抗生素。然而由于抗生素类药物的大量长期使用，导致了耐药细菌甚至超级细菌的出现，给动植物细菌病的防治带来了严重的挑战[1]。因此开发新的抗菌药物，突破抗生素耐药性难题，已经成为当今世界关注的焦点和研究的热点。
从动植物和微生物中提取天然抗菌活性物质是寻找新型抗菌药物的重要途径，因为天然抗菌活性物质具有高效、低毒、无污染和来源广等特点，可以有效抑制细菌的生长，同时也不会对环境造成污染，产生抗药性[2]。
克氏原螯虾属甲壳纲，十足目，蝲蛄科，螯虾亚科，原螯虾属，体黑红色；原产于美国、墨西哥以及古巴的淡水中[3]。日本在1918年作为牛蛙饵料从美国引入，1929年从日本引入我国南京地区，现主要分布于长江中下游各水域，并成为我国淡水虾类养殖的一种重要资源；同时又是生态竞争优势而导致破坏性危害的外来物种[4]。螯虾可以在满布细菌、比较肮脏、受污染的水体中生活，同时靠水中腐败的植物和动物尸体为食的独特食性，这为研究抗菌肽的多样性和适应性提供了理想的材料，本文以克氏原螯虾为材料，从消化道分泌物中分离新型抗菌活性化合物，并对其结构和抑菌活性进行研究。
1 材料
1.1 材料。克氏原螯虾从湖南岳阳乡下购得。嗜水氣单胞菌（Aeromonas hydrophila）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由中南林业科技大学提供。
1.2 试剂与仪器。三氟乙酸（TFA），Sigma 公司生产；乙腈，Merck公司生产；HCCA（-氰基- 4-羟基肉桂酸） ，美国ICN 生物医学公司生产；高效液相色谱仪（Alliance 2695与1525），美国Waters公司；C- 18色谱柱（250mm×20.00mm和250mm×4.60mm），美国菲罗门公司；质谱仪（MALDI- TOF/ TOF），德国Bruker公司；高速冷冻离心机（5804R），美国Eppendorf公司；高压灭菌锅（HVE- 50）美国HIRAYAMA公司。
1.3 培养基。LB液体培养基： 称取LB固体培养基1.8 g溶于100 mL蒸馏水中，煮沸至完全溶解，分装于试管，121℃高压灭菌20 min，备用。
MH固体培养基（MH琼脂平板） ： 称取Mueller- Hinton琼脂（MHA） 3.8 g溶于100 mL蒸馏水中，煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌20 min，冷却至55℃倾注平板，备用。
2 方法
2.1 螯虾肠道抗菌活性物质提取。选择新鲜的克氏原螯虾，在虾头部剪一个口子，然后从该开口处沿虾背部剪开至虾尾，得到虾肠，清除脂肪、肠道内容物后剪碎。先用组织捣碎机捣碎，再用超声波细胞粉碎机破碎10次，每次3s。加入超纯水4℃搅拌过夜。次日将混合物于4℃、8000r/min离心30min，取上清液冷冻干燥即为抗菌活性物质粗提物。
2.2 反相高效液相色谱纯化。第一次反相色谱纯化在配备1525泵和2487双波长检测器的高效液相色谱系统上进行；收集各洗脱峰，并经冷冻干燥后，保存备用。目的组分第二次反相色谱纯化在配备2489双波长检测器的Alliance 2695系统上进行；流动相采用二元梯度：A液含0.1%三氟乙酸水溶液，B液含0.1%三氟乙酸的乙腈；检测波长为280nm与215nm双波长；柱温箱为35℃；分析型C- 18色谱柱为（250mm×4.60mm美国菲罗门公司的Lunar柱）。洗脱梯度见表1。
2.3 质谱分析。质谱分析在Bruker公司Micro- TOF QII上进行。对筛选得到的目标样品用50%蒸馏水与50%的乙腈溶解后，加入0.1%的甲酸混匀，进样；雾化气为氮气，正离子模式下测定目标组分的相对分子质量。
2.4光谱分析。在日立UV2300紫外/可见分光光度仪上进行。波长范围：200～1100nm；扫描速度：100nm/min；自动切换波长为340nm。将筛选得到的样品体积100L进行全波长扫描，测定目标组分的吸收波长。
2.5 抑菌活性分析。采用纸片扩散法测定抑菌效果。将试验菌复苏，按0.1%的接种量摇菌培养14- 16h；然后按每平板100- 200 L均匀涂布于营养琼脂平板（ 9 cm），待稍干后贴上无菌滤纸片（6 mm），在各个滤纸片上分别滴加10、20、30、40L各洗脱峰冻干样品（40 mg/ml）；同时设置滴加无菌生理盐水（20 L）为空白对照；4℃静置3h，37℃恒温培养24 h，测定抑菌圈的大小，以判断目标样品的抑菌效果。
3 结果与分析
3.1螯虾肠道组织样品制备。螯虾肠道组织经超声波破碎提取后，离心并取上清冷冻干燥，粗提样品为淡黄色粘稠状的固态物质。粗提样品的检测、纯化、活性分析，每次用50ml蒸馏水溶解，0.22μm针式过滤头过滤后待用。
3.2反相高效液相色谱纯化。螯虾肠道组织粗提样品经HPLC分离，在280nm和215nm双波长检测条件下，螯虾肠道组织粗提样品得到10个比较大的吸收峰，其中保留时间最短为4.75分钟，最长为30.42分钟。抑菌试验筛查实验显示色谱纯化中保留时间为4.75分钟的洗脱峰对嗜水气单孢菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具明显的抑菌效果。因此，选择该洗脱峰作为目标组分进行二次纯化（见图1）。
从图1可看到带星号的洗脱主峰是目标峰，旁边还有几个小峰，洗脱溶液无色透明，说明目标组分通过二次纯化后变得更纯了。
3.3 质谱分析。目标组分经质谱分析结果见图2。从图可知：目标组分主峰的相对分子质量为246.17（M+H+），据此，将该样品组分命名为PC245；同时，质谱分析图上没有出现其它较大的分子离子峰，说明二次反相纯化后，目标组分样品非常纯。
3.4光谱分析。目标组分经UV2300紫外/可见分光光度仪分析结果见图3。从图3可知：目标组分在237 nm波长处有最大吸收峰，峰值为0.419。
3.5抑菌活性测定。将目标组分PC245对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌的抑菌实验数据进行统计，见图4、图5、图6的抑菌效果。
圖4 PC245对大肠杆菌的抑制作用
图4沿顺时针方向滴加样品体积数分别为10、20、30、40 μL，平板中间的滤纸片滴加无菌生理盐水作对照。
图5沿顺时针方向滴加样品体积数分别为10、20、30、40μL，平板中间的滤纸片滴加无菌生理盐水作对照。
图6沿逆时针方向滴加样品体积数分别为10、20、30、40 μL。平板中间的滤纸片滴加无菌生理盐水作对照。
从图4、5、6可看到：在滤纸片的周围出现透明抑菌圈，且抑菌圈的大小随样品体积的增加而增大，说明有量、效关系；同时也可看到PC245对嗜水气单胞菌的抑菌圈比大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的更大、更清晰、更透明，说明PC245对嗜水气单胞菌的抑菌效果更好。
4 讨论
提取天然抗菌活性物质来防治细菌病已经成为动植物抗菌制剂开发的新趋势。从克氏原螯虾消化道提取抗菌活性物质是找寻抗菌活性化合物的一种新思路[5]。
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单孢菌是三种常见的致病菌，其中嗜水气单胞菌广泛存在于水体环境中，是造成淡水虾、鱼类出现败血症的病原菌[6]。
本项目将从活体克氏原螯虾获得的肠道组织进行超声破碎提取，经高效液相色谱分离纯化，得到一种新型化合物PC245；紫外/可见分光光度扫描显示PC245在237nm波长处的紫外区具最大吸收波长，分子量比较小，亲水性强，推测是一种小分子有机化合物；抑菌实验证明PC245对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单孢菌均具有抑制效果，而且在相同浓度下，PC245对嗜水气单孢菌抑制作用更明显，但是PC245的化学结构还需进一步确认，其完整生物学活性也有待更深入的研究。
参考文献
[1] 马苏，高艳美.动物源细菌耐药性对动物细菌传染性疾病防治的影响[J].中国兽药杂志， 2012，（2）：50-52.
[2] 操庆国，国钦，黄敏等.天然抗菌物质研究进展[J].保鲜与加工.，2006，（3）：10-12.
[3] 王顺昌.克氏螯虾的生物学和生态养殖模式[J].淡水渔业， 2003， 33（4）： 59-61.
[4]徐加涛等.克氏原螯虾产业发展背景、现状与展望[J].水产科技情报，2011，38（4）：172-180.
[5] 苏建明等.草鱼肠道抗菌肽的提取及体外抑菌效果初步研究[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版）.2009，35（2）：162-165.
[6] 刘振兴等.嗜水气单胞菌对克氏原螯虾免疫相关因子活性的影响[J].华中农业大学学报， 2011， 30（3）： 358～363.
