超高效液相色谱法测定水发食品中甲醛残留量
杜艳丽+向仲朝+杨文婉
甲醛是具有刺激性臭味的无色液体，极易溶于水，35—40%的水溶液称福尔马林，在医学上用作杀菌、防腐和消毒。甲醛是一种原生质毒物，能使细胞质的蛋白质发生不可逆凝固；甲醛还是一种可疑潜在性的致癌物质。
近年来，不法商贩常用甲醛溶液加工或浸泡毛血旺、黄喉、毛肚、海参、鱿鱼、鲜鸭肠等水发食品，以改变其感官性状在市场上销售，严重危害了人们的身心健康，已经引起社会的广泛关注。在我国，食品卫生法明确规定，甲醛或含甲醛的化合物禁止作为食品添加剂使用，并且对部分包装材料中甲醛的允许残留量作了明确的规定，因此，甲醛的监测是一项非常重要的工作。
甲醛的定量分析有乙酰丙酮法、苯肼法、酚试剂法、柱前紫外衍生、气相色谱法、示波极谱法等。这些方法对品种繁多的水发食品的分析，各有千秋。本文采用2，4—二硝基苯肼衍生，二氯甲烷（或正己烷）振摇萃取，直接进样（必要时过滤，或脱水分离），用超高效液相色谱测定，具有简便、快速、灵敏、精密度好、准确度高、抗干扰能力强的特点；可以排除比色法的假阳性样品。经实际应用，结果令人满意。
实验部分
仪器及工作参数。Agilent 1290 Infinity II液相色谱仪；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 （4.6×250mm，5μm）； UV—可见紫外检测器，在线脱气；流动相：甲醇+0.02mol/L乙酸铵（65+35）；检测波长365nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；进样量20ul。
试剂。0.1% 2，4—二硝基苯肼：称0.10g 2，4—二硝基苯肼溶于24ml浓盐酸中，加水定容至100ml。甲醛标准液：取甲醛36～38%（V/V）2.8ml，用水稀释至1L，约为1.0mg/ml，标定[3]。0.02mol/L乙酸铵：称1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000ml，经滤膜（0.45um）过滤。甲醇（色谱级）。
样品和标准的测定。称样品适量，加水浸泡或直接取水发食品浸泡液1.00ml。另取0.010mg/ml甲醛标准应用液 0，0.050，0.10，0.50，1.00ml以及0.10mg/ml甲醛标准应用液0.50，1.00ml，加水至1.00ml，配成甲醛标准系列（ug/ml）0，0.50，1.00，5.00，10.0，50.0，100，于样品和标准液中加0.1%2，4—二硝基苯肼0.50ml，混匀，60o水浴20min，冷却后，加2.00ml二氯甲烷振摇提取2min，取下层二氯甲烷，20ul进样分析。甲醛的保留时间（tR）约为5.5min。
结果分析及讨论
检测波长的选择。衍生试剂2，4—二硝基苯肼的最大吸收波长在260nm左右，经实验，与甲醛反应生成的2，4—二硝基苯腙的最大吸收波长在365nm左右。对甲醛的紫外衍生测定，本文选用365nm波长。
流动相的选择。用甲醇+水作流动相，低浓度甲醛的色谱分离图有拖尾现象。选用甲醇+0.02mol/L乙酸铵（65+35）作流动相，从水发毛肚样品的色谱分离图（图1）可以看出，色谱图基线平直，色谱峰型对称，未被衍生的2，4—二硝基苯肼与甲醛反应生成的2，4—二硝基苯腙能完全分离。空白对照（图2），无2，4—二硝基苯腙形成。
萃取液的选择及保存时间。甲醛浓度较高时，用2，4—二硝基苯肼衍生后溶液中有棕色沉淀物生成，浓度越高，生成的沉淀物越多。实验证实，不经萃取直接测定，色谱峰型不对称，且灵敏度极低。本文选用2.0ml二氯甲烷一次萃取，即能满足0～100mg/L甲醛衍生物的萃取。萃取液在室温下放置72小时不影响结果测定。实验证实，如改用正己烷萃取，甲醛浓度偏高时，萃取不完全，线性范围变窄。
衍生试剂的选择及使用量的确定。衍生试剂可选择硫酸阱或2，4—二硝基苯肼。硫酸阱形成的衍生物分子量小，出峰时间快，检测的灵敏度低，抗干扰能力差； 2，4—二硝基苯肼的紫外衍生反应，能迅速定量的进行，只生成一种衍生物，即相应的2，4—二硝基苯腙，并且，过量的衍生试剂不干扰甲醛的测定。衍生试剂的使用量，应根据样品中甲醛的含量决定。经实验，浸泡液中甲醛在0～100mg/L范围内，只需加入0.1% 2，4—二硝基苯肼0.5ml即可，如果甲醛浓度≥100mg/L可以加入1.0ml以上。衍生试剂的用量随甲醛浓度的增大而增加，甲醛浓度越高，剩下的衍生试剂越少。如果样品中甲醛浓度过高，可以考虑增加衍生试剂的加入量或稀释样品提取液。
特殊样品处理。实验中发现，毛血旺、鸭肠、鹅肠等样品，按方法操作，加二氯甲烷振摇后下层整体凝结成团，二氯甲烷分层困难，遇到此种情况可先静置一段时间，待上层分出大部分水后，用吸管除去，加适量无水Na2SO4，轻摇，即可分出澄清的二氯甲烷层，供进样测定用。二氯甲烷分层清楚的样品，可直接吸取二氯甲烷层进样测定。
萃取次数问题。经实验确认，按本法操作，样品和标准一次萃取即可；这样可省去多次萃取、分离、挥干等烦琐步骤，从而减少工作强度，降低工作量。
线性范围与最低检出量。甲醛在0～100mg/L范围内，浓度C与峰面积（Area）呈直线相关关系，n=7，r=0.9992，a=150.1，b=244.1。方法最低检出量，以Area=10，进样量20ul计为1.0ng，提取液的最低检出浓度为0.050mg/L。
方法的精密度和准确度。对样品进行了6次测定，浓度为0.56 mg/L，RSD=14%，浓度为1.1 mg/L，RSD=11%，濃度为4.56 mg/L，RSD=3.9%，浓度为10.4 mg/L，RSD=7.6%，浓度为55.6 mg/L，RSD=4.0%，浓度为100 mg/L，RSD=2.9%；对毛肚、黄喉、海参等样品进行加标回收实验，加标量1.5-85mg/L，回收量为1.4-90mg/L，回收率为93.3-110%，平均回收率为96.5-106%。
样品的保存时间。样品低温保存7天，一般浓度无变化。样品采集后，应在3日内测定完毕。
方法应用
我们于2014年至2016年，对绵阳市内农贸集市销售的部分水发玉兰片、香菇、黄喉、毛肚、章鱼、海蛰丝、鲜鸭肠、鲜鹅肠、猪血等67个样品的浸泡液进行抽样检测，其中3个检出甲醛，浓度为0.18-8.2mg/L。其中毛肚阳性样品1个，浓度8.2mg/L；香菇阳性样品1个，浓度为0.85mg/L；鲜鸭肠1个，浓度为0.47mg/L。同时与比色法作了对比实验分析，共排除比色法的假阳性或弱阳性样品2个。
甲醛是具有刺激性臭味的无色液体，极易溶于水，35—40%的水溶液称福尔马林，在医学上用作杀菌、防腐和消毒。甲醛是一种原生质毒物，能使细胞质的蛋白质发生不可逆凝固；甲醛还是一种可疑潜在性的致癌物质。
近年来，不法商贩常用甲醛溶液加工或浸泡毛血旺、黄喉、毛肚、海参、鱿鱼、鲜鸭肠等水发食品，以改变其感官性状在市场上销售，严重危害了人们的身心健康，已经引起社会的广泛关注。在我国，食品卫生法明确规定，甲醛或含甲醛的化合物禁止作为食品添加剂使用，并且对部分包装材料中甲醛的允许残留量作了明确的规定，因此，甲醛的监测是一项非常重要的工作。
甲醛的定量分析有乙酰丙酮法、苯肼法、酚试剂法、柱前紫外衍生、气相色谱法、示波极谱法等。这些方法对品种繁多的水发食品的分析，各有千秋。本文采用2，4—二硝基苯肼衍生，二氯甲烷（或正己烷）振摇萃取，直接进样（必要时过滤，或脱水分离），用超高效液相色谱测定，具有简便、快速、灵敏、精密度好、准确度高、抗干扰能力强的特点；可以排除比色法的假阳性样品。经实际应用，结果令人满意。
实验部分
仪器及工作参数。Agilent 1290 Infinity II液相色谱仪；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 （4.6×250mm，5μm）； UV—可见紫外检测器，在线脱气；流动相：甲醇+0.02mol/L乙酸铵（65+35）；检测波长365nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；进样量20ul。
试剂。0.1% 2，4—二硝基苯肼：称0.10g 2，4—二硝基苯肼溶于24ml浓盐酸中，加水定容至100ml。甲醛标准液：取甲醛36～38%（V/V）2.8ml，用水稀释至1L，约为1.0mg/ml，标定[3]。0.02mol/L乙酸铵：称1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000ml，经滤膜（0.45um）过滤。甲醇（色谱级）。
样品和标准的测定。称样品适量，加水浸泡或直接取水发食品浸泡液1.00ml。另取0.010mg/ml甲醛标准应用液 0，0.050，0.10，0.50，1.00ml以及0.10mg/ml甲醛标准应用液0.50，1.00ml，加水至1.00ml，配成甲醛标准系列（ug/ml）0，0.50，1.00，5.00，10.0，50.0，100，于样品和标准液中加0.1%2，4—二硝基苯肼0.50ml，混匀，60o水浴20min，冷却后，加2.00ml二氯甲烷振摇提取2min，取下层二氯甲烷，20ul进样分析。甲醛的保留时间（tR）约为5.5min。
结果分析及讨论
检测波长的选择。衍生试剂2，4—二硝基苯肼的最大吸收波长在260nm左右，经实验，与甲醛反应生成的2，4—二硝基苯腙的最大吸收波长在365nm左右。对甲醛的紫外衍生测定，本文选用365nm波长。
流动相的选择。用甲醇+水作流动相，低浓度甲醛的色谱分离图有拖尾现象。选用甲醇+0.02mol/L乙酸铵（65+35）作流动相，从水发毛肚样品的色谱分离图（图1）可以看出，色谱图基线平直，色谱峰型对称，未被衍生的2，4—二硝基苯肼与甲醛反应生成的2，4—二硝基苯腙能完全分离。空白对照（图2），无2，4—二硝基苯腙形成。
萃取液的选择及保存时间。甲醛浓度较高时，用2，4—二硝基苯肼衍生后溶液中有棕色沉淀物生成，浓度越高，生成的沉淀物越多。实验证实，不经萃取直接测定，色谱峰型不对称，且灵敏度极低。本文选用2.0ml二氯甲烷一次萃取，即能满足0～100mg/L甲醛衍生物的萃取。萃取液在室温下放置72小时不影响结果测定。实验证实，如改用正己烷萃取，甲醛浓度偏高时，萃取不完全，线性范围变窄。
衍生试剂的选择及使用量的确定。衍生试剂可选择硫酸阱或2，4—二硝基苯肼。硫酸阱形成的衍生物分子量小，出峰时间快，检测的灵敏度低，抗干扰能力差； 2，4—二硝基苯肼的紫外衍生反应，能迅速定量的进行，只生成一种衍生物，即相应的2，4—二硝基苯腙，并且，过量的衍生试剂不干扰甲醛的测定。衍生试剂的使用量，应根据样品中甲醛的含量决定。经实验，浸泡液中甲醛在0～100mg/L范围内，只需加入0.1% 2，4—二硝基苯肼0.5ml即可，如果甲醛浓度≥100mg/L可以加入1.0ml以上。衍生试剂的用量随甲醛浓度的增大而增加，甲醛浓度越高，剩下的衍生试剂越少。如果样品中甲醛浓度过高，可以考虑增加衍生试剂的加入量或稀释样品提取液。
特殊样品处理。实验中发现，毛血旺、鸭肠、鹅肠等样品，按方法操作，加二氯甲烷振摇后下层整体凝结成团，二氯甲烷分层困难，遇到此种情况可先静置一段时间，待上层分出大部分水后，用吸管除去，加适量无水Na2SO4，轻摇，即可分出澄清的二氯甲烷层，供进样测定用。二氯甲烷分层清楚的样品，可直接吸取二氯甲烷层进样测定。
萃取次数问题。经实验确认，按本法操作，样品和标准一次萃取即可；这样可省去多次萃取、分离、挥干等烦琐步骤，从而减少工作强度，降低工作量。
线性范围与最低检出量。甲醛在0～100mg/L范围内，浓度C与峰面积（Area）呈直线相关关系，n=7，r=0.9992，a=150.1，b=244.1。方法最低检出量，以Area=10，进样量20ul计为1.0ng，提取液的最低检出浓度为0.050mg/L。
方法的精密度和准确度。对样品进行了6次测定，浓度为0.56 mg/L，RSD=14%，浓度为1.1 mg/L，RSD=11%，濃度为4.56 mg/L，RSD=3.9%，浓度为10.4 mg/L，RSD=7.6%，浓度为55.6 mg/L，RSD=4.0%，浓度为100 mg/L，RSD=2.9%；对毛肚、黄喉、海参等样品进行加标回收实验，加标量1.5-85mg/L，回收量为1.4-90mg/L，回收率为93.3-110%，平均回收率为96.5-106%。
样品的保存时间。样品低温保存7天，一般浓度无变化。样品采集后，应在3日内测定完毕。
方法应用
我们于2014年至2016年，对绵阳市内农贸集市销售的部分水发玉兰片、香菇、黄喉、毛肚、章鱼、海蛰丝、鲜鸭肠、鲜鹅肠、猪血等67个样品的浸泡液进行抽样检测，其中3个检出甲醛，浓度为0.18-8.2mg/L。其中毛肚阳性样品1个，浓度8.2mg/L；香菇阳性样品1个，浓度为0.85mg/L；鲜鸭肠1个，浓度为0.47mg/L。同时与比色法作了对比实验分析，共排除比色法的假阳性或弱阳性样品2个。
