血凝（HA）—血凝抑制（HI）试验操作要点

    黄艳羚+孙淑兰

    摘要：兽医实验室检测禽流感和鸡新城疫抗体采用血凝（HA）-血凝抑制（HI）试验。该试验有些因素会影响试验结果，是试验的关键环节，如配制1%鸡红细胞时其浓度的高低会影响抗体滴度的高低；4单位抗原的配制需要回滴正确；试验的反应时间和温度也要符合要求。只有掌握好试验的关键点，才能得出准确无误的试验结果。对该试验的操作要点及注意事项进行了介绍。

    关键词：禽流感抗体检测；鸡新城疫抗体抗体检测；血凝（HA）-血凝抑制（HI）试验；操作要点

    中图分类号：S851.3 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2016）12-0022-01

    实验室检测禽流感及鸡新城疫抗体滴度采用血凝（HA）—血凝抑制（HI）试验，是利用了禽流感病毒、鸡新城疫病毒的血凝素能凝集鸡红细胞的特性。现将HA-HI试验操作步骤及注意事项介绍如下，供参考。

    1 试剂配制

    1.1 阿氏液配制

    称量葡萄糖2.05 g、柠檬酸钠0.80 g，柠檬酸0.055 g、氯化钠0.42 g，加蒸馏水至100 mL，加热溶解后调pH至6.1，高压灭菌，4 ℃保存备用。

    1.2 1%鸡红细胞液的制备

    因为每只鸡的血红细胞的结合性不一样，所以要取3～4只公鸡血，要求是SPF鸡，每3个月换一次鸡。采血与等量阿氏液混合均匀，放入离心管中。鸡红细胞的洗涤：将离心管中的血液经2 500 r/min离心5 min，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，用生理盐水配成1%红细胞悬液，4 ℃保存备用，不超过5 d。离心的时间、转速不一样，紅血球压积不一样。红血球浓度低，检测出的抗体效价就低，反应时间变长。红血球浓度高，检测出的抗体效价就高，会偏离正常值。转速不能超过3 000 r/min，不然红细胞易破碎。洗红血球时需要用和稀释液一样的液体。

    2 操作步骤

    2.1 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）

    在一次性微量反应板的1～12孔均加入25 μL的生理盐水，吸取25 μL抗原加入第一孔，混匀。从第一孔倍比稀释至第11孔，从第11孔弃25 μL，每孔再加入25 μL生理盐水，每孔均加入25 μL 1%鸡红细胞悬液，振荡混匀，室温，25 min观察结果，使红细胞完全凝集的抗原最高稀释度为1个血凝单位。

    2.2 血凝抑制（HI）试验（微量法）

    4单位抗原配制：终点稀释倍数除以4即为含4 HAU的抗原的稀释倍数。4单位抗原在使用前最好做回滴试验，以确保配制的抗原正好为4单位抗原。具体操作方法如下：在微量反应板的1～6孔均加入25 μL生理盐水，吸取25 μL配好的4单位抗原，分别加入第1孔和第2孔，混匀，从第2孔倍比稀释至第5孔，从第5孔弃25 μL，2～6孔再加入25 μL生理盐水，1～6孔均加入25 μL1%鸡红细胞悬液，室温静置30 min，判断结果。将板倾斜，1～3孔红细胞全部凝集，第4孔显泪滴状流淌，则配液正确。调整抗原浓度，直到回滴正确。配好的抗原使用时间不超过4 h。4单位抗原配制是否正确，对试验结果影响很大。抗原-20 ℃保存，用时恢复至室温。抗原应分装，避免反复冻融，否则会降低效价。

    在微量反应板的第1～11孔加入25 μL生理盐水，第12孔加入50 μL生理盐水。吸取25 μL待检血清加入第1孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25 μL弃去。第1～11孔均加入4HAU混匀的抗原液25 μL，室温静置30 min，每孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液，混匀，室温静置30 min。结果判定：以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI效价≤3log2判定HI试验阴性，HI效价=4log2为可疑，HI效价≥5log2为阳性。

    注意，稀释液的pH应在7.0～7.2，pH低时，看不见效价，pH大于7.8时，容易溶脱。反应时，室温高于37 ℃时，血细胞易脱落，4 ℃以下会自凝。温度24～25 ℃反应效果最好。稀释溶液时，用10～100 μL量程多道移液器，每孔反复吹吸6次，动作应均匀一致。常用96孔V型板，一次性微量反应板，沉降快，清晰、易判。用鸡红细胞检测鸭血清时，会出现非特异性凝集，最好用同源动物红血球。