养殖盐度对凡纳滨对虾抗氧化酶及免疫相关酶活力的影响
鲁耀鹏 钱坤 汪蕾 张秀霞 王冬梅 李军涛 冼健安 王安利
摘 要：为比较不同养殖鹽度下凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）抗氧化活力及非特异性免疫状态，将平均体长为（10.6±1.7）cm的对虾分为高盐度组（20‰）和低盐度组（5‰），饲养2周后，测定肝胰腺和血清中的抗氧化酶及免疫相关酶活力。结果显示，凡纳滨对虾在低盐度下肝胰腺中谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）活力及总抗氧化能力（T-AOC）均显著低于高盐度组，丙二醛（MDA）含量高于高盐度组;在低盐度下，血清中GPx活力、T-AOC显著低于高盐度组，MDA含量高于高盐度组;低盐度下，对虾肝胰腺谷丙转氨酶（GOT）和谷草转氨酶（GPT）活力显著下降，而血清GOT和GPT活力显著升高;低盐度下，血清和肝胰腺中的酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）活力均显著低于高盐度组。结果表明，低盐度条件下凡纳滨对虾血清和肝胰腺的抗氧化活力和免疫酶活力均受到抑制，脂质过氧化程度升高，肝胰腺受到一定程度的损伤。
关键词：凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）;盐度;非特异性免疫;抗氧化酶
凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是世界上主要的经济虾类之一[1]，占我国对虾养殖总产量比重大[2]。其对盐度有较好的适应性，能存活于1‰的微咸水和40‰的海水之间[3]，最适生存盐度为20‰左右[4-5]。盐度作为水产养殖中的重要环境因子，对虾类的生长、呼吸代谢、存活、渗透压及免疫力和氧化功能均会造成不同程度的影响[6-8]。由于凡纳滨对虾对盐度的广适应性以及内陆地区海水运输困难，海水淡化养殖已经成为内陆地区的主要养殖模式。但近年来，低盐度凡纳滨对虾养殖也出现了诸多问题。生长缓慢、成活率低、易爆发疾病等问题严重制约了对虾养殖产业的发展，造成了巨大的经济损失。已有研究报道，不同盐度对凡纳滨对虾的生长、代谢、体组成等均造成不同程度的影响[9-14]。李雪鹤等[10]的研究结果显示12‰盐度组凡纳滨对虾的生长性能要优于30‰盐度组，且盐度变化可显著影响糖类的代谢。沈敏等[11]研究发现，高盐突变幅度越大，凡纳滨对虾存活率越低，生长越缓慢，但渗透调节能力增强。Cheng等[12]和曹梅等[13]研究证明盐度变化后，对虾产生应激反应，免疫力下降，易感染疾病。李二超[14]报道了高、中、低（320、17.0和3.0‰）盐度下凡纳滨对虾肌肉和肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的变化，发现低盐度下抗氧化酶活力被诱导升高。本研究以20‰适宜盐度作为对照，探讨低盐度下对虾肝胰腺和血清抗氧化活力和免疫相关酶活力的变化，以期进一步探讨低盐度对虾类肝胰腺和血清生理生化状态的影响及作用机制，为凡纳滨对虾在低盐度环境下的健康养殖提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验动物
凡纳滨对虾购自广东省广州市番禺区某养殖场，平均体长为（10.6±1.7）cm。对虾暂养在温度为22～24 ℃、pH为7.9～8.0、盐度为5 ‰的水体中，一周后选取附肢完整、健康状况良好、处于蜕皮期的对虾进行试验。
1.2 试验设计
试验对虾在实验室养殖系统进行养殖，设计低盐度（5‰）和高盐度（20‰）两组，每组三个平行，每个平行30尾虾。养殖水体初始盐度为5‰，20‰组水体用日晒海盐进行调节，每天进行2‰的盐度提升，使对虾适应水体盐度，直至达到20‰为止。在驯化对虾至高盐度后再养殖两周以保证对虾完全适应盐度环境。试验养殖过程中水体保持曝气并进行循环过滤，每天按对虾体重的3%投喂某品牌商业饲料。
1.3 样品的制备
1.3.1 血清的制备 在养殖试验结束后进行取样，用1.5 mL一次性注射器吸取200 μL预冷的抗凝剂（葡萄糖20.5 g/L，柠檬酸钠8 g/L，氯化钠4.2 g/L，pH 7.5），然后从对虾的围心腔抽取等量的血淋巴。置入离心管中并用离心机离心（3 000 r/min，4 ℃，10 min），取上清待测。
1.3.2 肝胰腺组织匀浆的制备 养殖试验结束后取对虾肝胰腺，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存待测。检测前，取肝胰腺称重（0.2～1 g），用预冷的生理盐水漂洗，去除血液，在滤纸上吸干水分并称重。称重后量取9倍组织重量的预冷生理盐水，用剪刀剪碎组织块，倒入玻璃匀浆器中，冰浴状态下进行匀浆。待组织充分匀浆后离心（4 ℃、3 000 r/min、10 min），取上清液待测。
1.4 指标测定
本试验测定的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、过氧化氢酶（CAT）、碱性磷酸酶（AKP）、谷丙转氨酶（GOT）和谷草转氨酶（GPT）活力以及总抗氧化活力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量、蛋白质含量均使用南京建成生物工程研究所试剂盒，测定方法均按照试剂盒说明书步骤进行。
1.5 统计分析
用SPSS 19.0对试验数据进行统计分析，结果用平均值±标准误（Mean±SE）表示，P<0.05确认为差异性显著，P<0.01确认为差异性极显著。
2 结果
2.1 养殖盐度对凡纳滨对虾抗氧化活力的影响
盐度对凡纳滨对虾抗氧化系统酶活力的影响如表1所示。除CAT酶无显著变化外（P>005），肝胰腺中GSH-Px、SOD酶活力和T-AOC在20‰盐度组均显著高于5‰盐度组（P<0.01）。与5‰盐度组相比，20‰盐度组血清中GSH-Px酶活力和T-AOC均显著上升（P<0.01），而SOD和CAT酶活力无显著变化（P>0.05）。5‰盐度组肝胰腺和血清中的MDA含量均显著高于20‰盐度组（P<0.05）。
2.2 养殖盐度对凡纳滨对虾转氨酶活力的影响
盐度对凡纳滨对虾肝胰腺和血清转氨酶活力的影响如表2所示。5‰盐度组肝胰腺中的GOT和GPT酶活力均显著低于20‰盐度组（P<005），而血清中的GOT和GPT酶活力均显著高于20‰盐度组（P<0.05）。
2.3 养殖盐度对凡纳滨对虾免疫相关酶活力的影响
盐度对凡纳滨对虾肝胰腺和血清免疫相关酶活力的影响如表3所示。与5‰盐度组相比，20‰盐度组的ACP、AKP酶活力均显著上升（P<0.01）。
3 讨论
3.1 盐度对虾类抗氧化活力的影响
抗氧化系统对水产动物具有至关重要的作用。正常情况下生物体内的氧化自由基处于动态平衡状态，若受到外界因素的干扰机体产生过多的自由基，会造成一系列的氧化损伤，导致机体的抗病能力下降[15]。当机体内自由基平衡破坏时，抗氧化系统就会起作用，来维持机体内的氧化平衡[16]。抗氧化系统是由一系列抗氧化酶组成，主要包括SOD、GSH-Px、CAT。这三种酶是重要的抗氧化酶，它们可以共同催化超氧阴离子自由基生成无毒化合物，从而降低其毒性[17-19]。T-AOC直接反映虾体的抗氧化能力，SOD活性间接反映虾体清除氧自由基的能力，MDA是脂质过氧化产物，其含量反映了机体脂肪组织受自由基氧化损伤的严重程度[19-20]。盐度是对虾生活环境中的重要因子，它的变动会影响虾类的生长、代谢、体组成等。已有研究表明，盐度的变化能影响多种鱼虾体内抗氧化酶活力的变化。当脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）处于较高或较低的盐度水平时，机体内的SOD活力均受到抑制，盐度的变化会降低机体的免疫力，从而导致患病的几率增加[7]。克氏原螯虾（Procambarus clarkia）在較高的盐度时，肝脏SOD和CAT活力会显著升高，并且在达到一定的高度时逐渐降低并趋于稳定[8]。尽管凡纳滨对虾经过盐度的驯化后，可以在较低的盐度下存活，但是研究显示其最适的生长盐度是20‰[4-5]。本试验结果显示5‰盐度下，凡纳滨对虾肝胰腺和血清的抗氧化活力均较低，MDA含量则显著升高，表明低盐度下凡纳滨对虾机体抗氧化活力受到一定的抑制，机体受到一定程度的氧化损伤，这与盐度突变下的胁迫作用相似[7，11]。笔者之前的研究发现低盐度养殖条件下，凡纳滨对虾血细胞中的活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）均显著升高，而血细胞免疫力指标下降[21]，与本研究结论一致，表明凡纳滨对虾虽然经过驯化后能够在低盐度条件下进行养殖，但是遭受了一定程度的慢性低盐度胁迫，机体的抗氧化活力受到一定程度的抑制，机体受到一定程度的氧化损伤。
3.2 盐度对虾类转氨酶活力的影响
GOT和GPT是参与机体内氨基酸氨基转运的一类酶，主要存在于动物肝组织细胞中，其活性的高低可以反映机体内氨基的转移活力[22]，也常用于反映机体肝组织的健康状态。潘鲁青等[23]研究报道，当凡纳滨对虾受到重金属离子胁迫时，其肝胰腺组织中的GOT和GPT活力显著下降，而血液中GOT和GPT活力显著上升，表明对虾在重金属胁迫下肝胰腺受到损伤。在正常生理状态下，对虾细胞内的转氨酶仅有少量释放入血淋巴中，因此血清中GOT和GPT活力较低，当肝组织发生炎症、病变或中毒等而受损时，肝细胞内的转氨酶便被大量释放到血淋巴中[24-25]。本研究结果显示，与20‰盐度相比，5‰低盐度养殖条件下，凡纳滨对虾肝胰腺中GOT和GPT活力降低，而血清GOT和GPT活力显著升高，表明对虾在低盐度养殖条件下，肝胰腺受到一定程度的损伤，与抗氧化活力结果一致。
3.3 盐度对虾类免疫相关酶活力的影响
ACP和AKP是甲壳动物体内的两种非特异性免疫因子，是吞噬细胞溶酶体的重要组成成分，直接参与机体内的物质代谢和细胞的吞噬作用[26]，在对虾体内具有防御和消化代谢双重作用[27-28]，也对磷酸钙化、骨骼形成、甲壳素分泌等具有重要作用[9]。研究显示，对虾在受到高盐胁迫和硝态氮胁迫时，磷酸酶均会被诱导[9，29]。李娜等[9]报道，ACP和AKP主要在肝胰腺和血淋巴中发挥作用，随着高盐胁迫加重，对虾ACP和AKP酶活力呈现先升高后下降的趋势，盐度升高后，对虾可能需要通过消耗更多的ATP去调节渗透压来适应外界环境的变化，而ACP和AKP催化磷酸酯类水解可合成ATP，从而导致了ACP和AKP活力的升高，但盐度高达一定的程度时，两种磷酸酶活力又受到抑制。本研究结果显示，相比20‰的适宜盐度，在5‰的低盐度养殖条件下，凡纳滨对虾的ACP和AKP活力均显著降低，推测凡纳滨对虾可能因长期受到低盐度胁迫，机体受到氧化损伤，生理平衡受到一定的破坏，致使磷酸酶活力受到抑制。
4 结论
本研究结果显示，凡纳滨对虾在两个不同的养殖盐度（5‰和20‰）下，其肝胰腺和血清的抗氧化和免疫相关指标均存在显著的差异。结果表明，养殖盐度会显著影响凡纳滨对虾肝胰腺和血清的生理生化状态，在20‰盐度组，对虾的抗氧化活力和免疫力均较好，在5‰低盐度下，对虾可能受到慢性低盐度胁迫，抗氧化活力和免疫力均受到一定程度的抑制，脂质过程氧化程度升高，肝胰腺受损。因此，在低盐度养殖条件下，为降低低盐胁迫的不利影响，建议在对虾饲料中可定期补充维生素C等抗氧化添加剂以及保肝护肝添加剂。
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Effect of salinities on activities of antioxidant enzymes and immune-related enzymes of the white shrimp Litopenaeus vannamei
LU Yao-peng1，2，QIAN Kun2，WANG Lei2，ZHANG Xiu-xia1，WANG Dong-mei1，LI Jun-tao1，XIAN Jian-an1，WANG An-li2
（1. Hainan Provincial Key Laboratory for Functional Components Research and Utilization of Marine Bio-resources，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101;2.School of Life Science，South China Normal University，Guangzhou 510631）
Abstract：The purpose of this study was to compare the antioxidant capacity and non-specific immunity of Litopenaeus vannamei cultured in different salinities.Shrimp with average body length of （10.6±1.7） cm were divided into high-salinity group （20‰） and low-salinity group （5‰）.After feeding for 2 weeks，the activities of immune-related enzymes and antioxidant enzymes in hepatopancreas and serum were measured.Results showed that the activities of glutathione peroxidase （GPx），superoxide dismutase （SOD） and total antioxidant capacity （T-AOC） in hepatopancreas of shrimp cultured in 5 ‰ were significantly lower than those of shrimp cultured in 20 ‰，and the content of malondialdehyde （MDA） was higher than that of 20 ‰ group.GPx activity and T-AOC in serum of shrimp at low salinity were significantly lower than those in the group with high salinity，while MDA content was higher than that in the group with high salinity.At low salinity，the activities of GOT and GPT in hepatopancreas significantly decreased，while those of GOT and GPT in serum increased.Activity of acid phosphatase （ACP） and alkaline phosphatase （AKP） in serum and hepatopancreatine of shrimp cultured in low salinity were lower than that of shrimp cultured in high salinity.Results showed that antioxidant capacity and immune-related activities in serum and hepatopancreas were inhibited by low salinity，while lipid peroxidation increased，and hepatopancreas were damaged to some extent.
Key words：Litopenaeus vannamei; salinity; non-spectific immunity; antioxidant enzyme
（收稿日期：2019-10-21）
基金项目：中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金（1630052019013和1630052016011），广东省自然科学基金（2017A030313194）。
作者简介：鲁耀鹏（1993-），男，博士研究生，研究方向：水产动物营养与饲料学。E-mail：[email protected]。
通信作者：冼健安（1983-），男，博士，副研究员，研究方向：水产动物营养与饲料学、水产动物生态及毒理学。E-mail：[email protected]。
