非洲大蜗牛螺壳标准样品的研制

    刘若思　边勇　刘辉　乔彩霞　王强

    

    

    

    摘要 ? ?本文梳理了非洲大蜗牛的采集、鉴定、饲养、螺壳制作、样品检验、定值等样品制作环节。最终制备的标准样品均匀性和稳定性均达到了国家标准样品的技术要求，可用于非洲大蜗牛的标准质量控制样品。该产品有利于检测质量控制、能力验证、文字标准的执行，也有利于结果的溯源，同时达到全国鉴定一致的作用。

    关键词 ? ?非洲大蜗牛;标准样品;螺壳

    中图分类号 ? ?TS251.7 ? ? ? ?文献标识码 ? ?A

    文章编号 ? 1007-5739（2020）19-0192-04

    Development ?of ?a ?Standard ?Sample ?of ?Snail ?Shell ?from ?Achatina ?fulica

    LIU Ruosi 1 ? ?BIAN Yong 1 ? ?LIU Hui 2 ? ?QIAO Caixia 1 ? ?WANG Qiang 1 *

    （1 Beijing Customs Technology Center， Beijing 100026; 2 Tianjin Port Health Technology Development Service Co.，Ltd.，

    Tianjin 300457）

    Abstract ? ?In this paper， the collection， identification， feeding， snail shell production， sample inspection， fixed value and other sample production processes of Achatina ?fulica Bowdich were summarized. The uniformity and stability of the final prepared standard samples met the technical requirements of national standard samples， which could be used for the standard quality control samples of A. fulica. The product is conducive to the quality control， ability verification， the implementation of written standards， is also conducive to the traceability of results， and to achieve the role of national identification at the same time.

    Keywords ? ?Achatina ?fulica Bowdich; standard sample; snail shell

    非洲大蜗牛（Achatina ?fulica Bowdich），又名褐云玛瑙螺、非洲巨螺、菜螺、花螺等，隶属软体动物门（Mo-llusca）、腹足纲（Gastropoda）、柄眼目（Stylommatophora）、玛瑙螺科（Achatinidae）、瑪瑙螺属（Achatina）。非洲大蜗牛排挤本地土著物种，严重威胁当地物种多样性[1]。非洲大蜗牛既是农林生产的危险性有害生物，可危害500多种农作物，又是人畜寄生虫的中间宿主，尤其是传播结核病和嗜酸性脑膜炎，对人类健康危害极大。非洲大蜗牛被世界自然保护联盟列入全球100种恶性外来入侵物种黑名单[2]，2003年国家环保总局将非洲大蜗牛列入首批入侵中国的16种外来物种之一[3]，原国家质量监督及检验检疫总局将其列入我国首批进境植物检疫性有害生物名单的5种软体动物之一。由此可见，国内外对非洲大蜗牛的重视程度。

    目前，我国南方部分地区有非洲大蜗牛的分布。该蜗牛原产于非洲，模式标本在国外，我国尚无正式的标准样品，给该蜗牛的准确鉴定带来了一定难度。目前，关于该蜗牛的鉴定有国家标准《非洲大蜗牛检疫鉴定方法》（GB/T 29576—2013），但缺少标准品作为鉴定的统一标准。制作非洲大蜗牛标准品有利于检测质量控制、能力验证、文字标准的执行，也有利于结果的溯源，同时可达到全国鉴定一致的作用，进而为有针对性的防治提供基础保证。

    1 ? ?材料与方法

    1.1 ? ?试验材料

    采集的非洲大蜗牛来源于广州市广东省林业科学研究院内。采集30头，带回北京海关技术中心实验室饲养备用。

    1.2 ? ?试验方法

    1.2.1 ? ?鉴定。

    （1）原材料的鉴定。对采集的30头蜗牛进行形态学种类鉴定，并随机挑取4头进行分子生物学鉴定。

    （2）形态学鉴定。对照国家标准《非洲大蜗牛检疫鉴定方法》（GB/T 29576—2013）中7.3.2.1的方法逐一观察非洲大蜗牛成体，肉眼观察其形态学特征，局部细微特征在高倍体式显微镜下进行观察[4]。

    （3）分子生物学方法鉴定。一是实验方法。使用通用引物LCO1490/HCO2198扩增线粒体COI条形码序列，由上海桑尼测序服务公司双向测序，使用Geneious软件检测测序峰图并拼接获得最终序列。通过NCBI-BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和BOLD（http：//www.boldsystems.org/index.php）数据库比对分析。二是PCR扩增结果。三是分子鉴定结果。

    1.2.2 ? ?标准样品的制备。

    （1）样品筛选：选取采集到的非洲大蜗牛中8～9 cm体长、螺壳花纹明显的健康成体，经形态学确认无误后，进行表面清洁。最终选取符合标准的8头非洲大蜗牛亲本。

    （2）扩繁饲养：参照周卫川[5]的饲养方法，并做了适当的调整。一是亲本交配。8头非洲大蜗牛进行两两配对，28 ℃下避光饲养。饲养期用新鲜的蔬菜做青饲料，每日喂食1次，喂食前清除污物，直至观察到其交配。二是产卵。经过配对后的非洲大蜗牛，以只为单位分别饲养在口径为30 cm左右垫有海绵的盆中，让其生长和产卵。三是孵化。产下的卵置于口径为12 cm培养皿中，每皿90粒，加盖后让其在28 ℃培养箱中孵化。四是培养成体。将孵化的幼螺，在28 ℃培养箱饲养至成螺，在生长过程中逐渐降低螺的饲养密度，最后降至每盆2～5只。饲养期用新鲜的蔬菜做青饲料，每天投喂1次，并清除污物。经过6个月饲养成成螺，以螺壳高7 cm以上并可见起交配作为成体依据。五是扩繁后的鉴定。为保证扩繁后种群的单一和性状稳定，对饲养出来的二代非洲大蜗牛逐一进行形态学鉴定，确保重要特征的稳定性，确认无误后用于螺壳标本制作。

    1.2.3 ? ?标本处理。参照GB/T 29576—2013的标本处理方法，并在其基础上进行适当的改进。一是致死。采用窒息法杀死非洲大蜗牛。将蜗牛置于盛满水的罐头瓶中，旋紧瓶盖，进行闷杀。单头蜗牛在室温（25 ℃）24 h即可完全致死。二是净化。经过窒息致死的蜗牛立即放入饱和洗衣粉所浸泡的水中浸泡24 h。三是壳肉分离。经过洗衣粉水浸泡的非洲大蜗牛软体部分柔软，且黏液尽除，用直头镊子将肉体完全从壳内取出。蜗牛软体部分用75%乙醇浸泡2～3次，每次8～10 h，直到没有残渣存留后保存于90%乙醇中并加入几滴甲醛。四是螺壳内部清洗。用吸管将10%氢氧化钠溶液滴入螺壳内部，浸泡48 h。五是二次清洗。倒出碱液，用自来水反复冲洗螺壳内外。使用试管刷擦拭螺壳内外的污浊物及洗衣粉残渣。六是干燥。制作好的螺壳放入白瓷盘中，用50 ℃烘箱烘干48 h，备用。

    1.2.4 ? ?标准样品的确认。一是特性值的确定。非洲大蜗牛生物个体形态标本，用于检疫鉴定和科研工作中的形态比较和质量控制，其特性值为分类学鉴定中的各形态鉴定指标的总合及其所指向的物种分类地位。依靠各形态特征进行表征时，可以获得明确的分类地位指向，其不确定性主要来自主观观测时各特征应符合对应标准的描述。为此，本次标准样品采用逐一观察核对的方法。观察测量设备为奥林巴斯SZ51。二是进行溯源分析。

    1.2.5 ? ?标准样品的检验。对所制备的样品进行初步筛选，选择个体超过7 cm、形态完整、特征明显的个体进行形态学鉴定，剔除不符合要求的个体。

    （1）均匀性检验。作为形态特征传递的标准样品，其特性值一致性检验时，主要考虑的因素是单一特征值和总体特征值的关系，即单一特征是否会导致总体结论的偏离。测量方法为形态观察设备;技术水平为专家能力、技术熟练度等;差异来源于主观观测的模糊性。主要依靠不同实验室的共同测试进行确认。按照GB/T 15000.3—2008的规定和原则，通过形态观察对样品均匀性（一致性）进行了检验[6]。

    （2）稳定性检验。稳定性研究是为了确定标准样品稳定贮存和运输的环境条件。在适宜的环境条件下，标准样品特性值应不会随着贮存、运输时间的延长发生显著变化。本次研制的螺壳标本，短期的湿度和温度改变不会对产品产生影响，故本项目按照标准GB/T 15000.3—2008进行长期保存稳定性和运输稳定性研究。螺壳标本制作完成后，在常温条件下可长期保存。本实验室标本保存经验表明，通常保存得当的标本在5年內不出现特征改变。因此，为确保标准样品参考性的有效，本次研制的标准样品推荐的有效期为4年，同时研制完成后标准样品保存于常温下，进行为期1年的保存期试验。从保存的标准样品中，按先密后疏的原则在不同时间（1、3、6、12个月），每次对同一编号的5份样品进行形态学检测。

    （3）快递运输条件测试。随机抽取10 份测试样品，按照快递要求，完全包装好后从2 m的高度将样品扔至地上，反复10次，测试样品是否出现变形、脱落等影响识别与鉴定的异常情况。

    1.2.6 ? ?定值报告。协同定值验证采用定性检测验证。项目主持单位制作《非洲大蜗牛标准样品协作定值》作业指导书，并对每个协作定值单位发送非洲大蜗牛标准样品6份，共计8家单位依据推荐标准使用不同仪器设备对样品进行检测。协作定值单位需在收到样本后5个工作日内完成并反馈试验结果。

    2 ? ?结果与分析

    2.1 ? ?形态学特征与分子学鉴定

    该蜗牛螺壳大型，壳质稍厚，有光泽，呈长卵圆形;有6.5～8.0个螺层，螺旋部呈圆锥形，体螺层膨大，其高度约为壳高的3/4;壳顶尖，缝合线深，壳面为黄或深黄底色，带焦褐色雾状花纹，胚壳呈玉白色，其他各螺层有断续的棕色条纹，生长线粗而明显;壳内为淡紫色或蓝白色;体螺层上的螺纹不明显，各螺层的螺纹与生长线交错;壳口呈卵圆形，口缘简单、完整，外唇薄而锋利，易碎，内唇贴覆于体螺层上，形成“S”形的蓝白色胼胝部;轴缘外折，无脐孔。综合以上特征，其形态符合非洲大蜗牛典型形态特征，判断为非洲大蜗牛。

    由图1、图2可知，所测序列通过NCBI-BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对鉴定为Achatina ?fulica，相似度为98%以上。

    所测序列通过BOLDSYSTERM（http：//www.boldsy

    stems.org）比对鉴定为Achatina ?fulica，最高比对相似度为99.67%。BOLDSYSTERM中生成的基于遗传距离的系统发育树表明，所测序列与Achatina ?fulica最近缘（图3）。经形态学结合分子生物学综合判断，所采集的样品为非洲大蜗牛（Achatina ?fulica）。

    2.2 ? ?标准样品的确认

    2.2.1 ? ?特性值的确定。由表1可知，用于标准样品的所有螺壳标本对应于标准描述的特征均应符合要求，并且形态学指标相对典型。

    2.2.2 ? ?溯源性分析。本次研制的标准样品，原始样品采集自广州市广东省林业科学院内，寄主为番石榴、羊蹄甲、黄花风铃木等。经形态学和线粒体COI分子方法鉴定确认后扩繁培养，其形态特征值可溯源到标准GB/T 29576—2013，线粒体COI的分子序列与NCBI和BOLD的非洲大蜗牛同源性均达到98%以上，可溯源至GenBank MN708326。通过对原始样品的继代培养和筛选获得初始样品用于标准样品制备。

    2.3 ? ?样品的检验

    2.3.1 ? ?均匀性检验。通过同一检测人员使用同一设备逐一检验，确保了本批标准样品的形态特征稳定，体型大小相对一致。对本次所制作的螺壳标本，对照国家标准GB/T 29576—2013检验其重要特征，即表1所列特征。

    2.3.2 ? ?稳定性检验。经对测试样品检验，各测试标本螺壳完整无污损、鉴定特征清晰可辨;经对同一编号标本的所有照片进行比较，未发现螺壳形态有明显变化，见图4。

    2.3.3 ? ?快递运输条件测试。测试结果表明，样品未出现变形、脱落等影响识别与鉴定的异常情况。

    2.4 ? ?定值报告

    定值结论表明，所提供螺壳标本完整、特征清晰可辨，符合《非洲大蜗牛检疫鉴定方法》（GB/T 29576—2013）的描述，鉴定为非洲大蜗牛（Achatina ?fulica）。螺壳标本完整，无缺损，符合制作要求。

    3 ? ?结论与讨论

    在软体动物的标准样品制作过程中，螺壳的处理是关键。处理好螺壳是制作出标准样品的核心技术。本文以非洲大蜗牛为例，简述该蜗牛标准样品制作的通用方法，该方法同样适用于其他中大型蜗牛的标准样品制作。腹足纲的软体动物通常可以用螺壳进行鉴定，《非洲大蜗牛检疫鉴定方法》（GB/T 29576—2013）关于物种的鉴定也是以螺壳为鉴定标准。因此，腹足纲的标准物质主要以螺壳为最终产物。虽然目前DNA作为辅助鉴定方法已广泛应用，但作为标准物质尚无统一的权威的数据可以支持。

    本文通过非洲大蜗牛的采集、鉴定、饲养、螺壳制作、样品检验、定值等多个环节，梳理了该样品的制作环节。最终制备的标准样品均匀性和稳定性均达到了国家标准样品的技术要求，可用于非洲大蜗牛的标准质量控制样品。本文的研制方法为腹足纲软体动物标准样品提供了一种可行的研制模式，可为今后更多的软体动物标准样品应用研究提供参考。

    4 ? ?参考文献

    [1] 游意.非洲大蜗牛的分布、传播、为害及防治现状[J].广西农学报，2016，31（1）：46-48.

    [2] LOWE S，BROWNE M，BOUDJELAS S，et al.100 of the wo-rld′s worst invasive alien species：a selection from the global?invasive species database[M].New Zealand：Invasive Species Specialist Group，2000.

    [3] 國家环保总局，中国科学院.中国第一批外来入侵物种名单[J].中华人民共和国国务院公报，2003（23）：40-46.

    [4] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.非洲大蜗牛检疫鉴定方法：GB/T 29

    576—2013[S].北京：中国标准出版社，2013.

    [5] 周卫川.非洲大蜗牛种群生物学研究[J].植物保护，2006，32（2）：86-88.

    [6] 国家标准化管理委员会.标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法：GB/T 15000.3—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.

    基金项目 ? 海关总署科技项目（2017IK142）。

    作者简介 ? 刘若思（1982—），男，北京人，博士，高级农艺师，从事植物昆虫检疫工作。

    *通信作者

    收稿日期 ? 2020-05-30