五种糖类对犬精液冷冻保存效果的研究

    孙玲伟　戴建军　吴彩凤　张树山　张德福

    

    

    

    摘要：选取8只身体健康、性欲旺盛的比格公犬，采集其精液，对鲜精进行质量检测，主要包括颜色、射精量、精子活率、活力和pH。选取精子活率达到70%以上犬精液用于后续精液冷冻试验。分别将含有葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖的精液稀释液与精液按照1∶2的比例进行稀释。经冷冻解冻后，进行活率、活力、质膜完整性和顶体完整性的精子质量检测。通过对新鲜精液进行品质检测，结果显示5只合格用犬的平均射精量为2.85 mL，密度为2.01×108个/mL，pH为6.56。含有果糖的冷冻稀释液中精子活率和活力最高，分别达59.90%和54.00%;其次是添加葡萄糖和乳糖的稀释液中活率较高，分别为59.21%和56.73%，且两组稀释液中精子解冻后活力均为52.00%。进一步评估精子解冻后质膜完整率，结果显示葡萄糖和果糖组显著高于其他组，分别达48.73%和49.52%;而蔗糖添加组精子质膜完整率最低，为42.21%。稀释液中添加果糖的精子解冻后顶体完整率显著高于其他组，而添加蔗糖组顶体完整率最低。在比格犬的精液冷冻保存中，添加果糖的冷冻稀释液能显著提高精子的活率和活力，从而达到提高冻精质量的效果。

    关键词：犬精液;冷冻;冷冻保护剂;糖类

    中图分类号：S814.3;S829.2? ? ? ? 文献标识码：A? ? ? ? 文章编号：1007-273X（2020）06-0010-03

    人工授精是一项发挥优秀公畜遗传潜力的重要现代动物生物技术，而精液冷冻是实现人工授精的重要技术环节[1]。目前，牛和羊等动物的冷冻精液已经商业化生产，广泛用于人工授精和体外受精，进行优良品种的繁殖。然而，犬的冷冻精液保存效果较差，冻精解冻后精子活力低，用于人工授精后导致受胎率低、产仔数少等问题。犬的精液冷冻技术研究开始于1967年，美国对犬精液冷冻做了大量研究，并制定了冷冻精液生产及操作规程，然而因精子质量问题未得到广泛推广。有研究使用犬冷冻精液进行人工授精，其受胎率虽低于自然交配，但胎儿死亡率、先天性畸形率、初生重及性比例均与自然交配相似[2]。目前，在发达国家，犬的精液冷冻保存研究已经广泛开展。我国对犬精液冷冻技术和人工授精技术研究始于20世纪80年代，目前尚处于试验研究阶段，生产实践中并没有普及和推广。潘寿文等[3]报到了德国牧羊犬精液冷冻的研究，冻精人工授精成功。禹学礼等[4]对豫西土犬的冷冻精液和人工授精试验获得成功，受胎率达到57%，平均窝产仔3只。此后，李彩霞[5]、曹授俊等[6]、王素梅等[7]分别做了相关的研究，但冻精质量差、受胎率低一直是制约我国犬精液冷冻技术发展的重要因素。

    在精液冷冻保存过程中，稀释液中糖类物质不仅能为精子生存以及运动提供能量，也能提高精子冻后的活率以及顶体完整性。因此，本试验旨在探寻葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖在比格犬精液冷冻中的添加，并研究其对冻精质量的影响，为犬精液冷冻产业化生产提供参考，促进犬精液冷冻技术更加成熟。

    1? 材料与方法

    1.1? 试验动物

    随机选取上海交通大学农业与生物学院身体健康、生殖器官发育正常的雄性比格犬8只，年龄2～5岁。犬只单独饲养在围栏里，每天定时定量由固定饲养员饲喂全价种公狗粮，并提供新鲜饮用水，采集精液前1 h禁食。

    1.2? 仪器与试剂

    犬用集精杯、温度计、电子分析天平、消毒锅、离心机、磁力搅拌器、恒温水浴锅、光学显微镜、冰箱、0.5 mL冻精细管、液氮罐、一次性精子计数板（迈朗）、精子分析仪（迈朗，SJ-TMDI608）、便携式pH检测仪。

    三羟甲氨基甲烷（Tris）、甘油、新鲜蛋黄、青霉素、链霉素、双蒸水、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖等均由上海市农业科学院提供。

    1.3? 方法

    1.3.1? 精液处理

    （1）精液采集。通过对试验用犬为期2周的采精调教后，采用手握法收集精液。

    （2）鲜精处理。精液采集后，立即记录射精量、精液pH、精液颜色和气味，之后进行精液品质分析，合格的精液进行下一步处理。只有射精量≥0.6 mL、精子密度≥2×108个/mL、精子活率≥70%的精液被用于后续试验[8]。为排除个体差异，将合格的精液进行混合后，按照要求进行分组稀释。

    （3）精液稀释液配方。根据以往文献，在以Tris为基础的传统稀释液中，分别添加葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖作为冷冻保护剂，配方列于表1[8-10]。之后检测精液解冻后精子活率、活力、质膜完整率和顶体完整率。

    （4）精液的稀释与分装。将经检测合格的精液，在37 ℃下500 r/min離心10 min去除上层精清，将精液用5种稀释液按照1∶1的比例进行稀释，至最终度为200×106个/mL。将精液包裹8层纱布放置在4 ℃冰箱内降温平衡2 h，分装至0.5 mL冻精细管中，并做好标记。

    （5）精液的冷冻与解冻。将冻精细管放置距离液氮上方4 cm处，利用液氮熏蒸法熏蒸15 min，之后投入-196 ℃的液氮中储存，直到评估。解冻时，将冻精细管快速从液氮中拿出，放入37 ℃的水浴中，来回摆动，30 s即可解冻。将细管中精液收集至1 mL离心管中，37 ℃孵育30 min，随后进行精液品质检测。

    1.3.2? 精液的品质检测

    （1）精子密度和精液pH。采用血细胞计数板进行测定。采用pH检测仪进行精液的pH检测。

    （2）精子活率和活力测定。取解冻后精液样品15 μL滴加在37 ℃预热的一次性精子计数板上，在200×光学显微镜下随机选择4个视野，利用精子分析仪，自动识别运动精子、直线运动精子和死亡精子数量，经计算后形成活率和活力数据。其中，精子活率=运动精子数/总精子数×100%，精子活力=直线运动精子数/总精子数×100%。

    （3）精子质膜完整率测定。采用低渗肿胀法（HOST）检测精子质膜完整性。将9.0 g果糖和4.9 g柠檬酸钠溶于1 000 mL蒸馏水中配置成HOST低渗溶液。将10 μL精液加入100 μL 37 ℃预热的HOST低渗溶液中，37 ℃孵育40 min，取10 μL精液涂于载玻片上，晾干后在200×光学显微镜下随机观察4个视野，统计质膜完整和不完整的精子。其中，精子尾部有卷曲或精子膨胀为质膜完整精子;反之，则为质膜不完整精子。精子质膜完整率=膜完整精子数/总精子数×100%。

    （4）精子顶体完整率测定。采用考马斯亮蓝法测定。将解冻后的100 μL精液加入500 μL 37 ℃预热生理盐水中，1 000 r/min 离心15 s后弃上清。加入500 μL多聚甲醛，室温固定20 min，再次离心弃上清。通过PBS悬浮洗涤2次后，取10 μL样品进行涂片，经空气干燥后，滴加0.22%考馬斯亮蓝染液，室温静置10 min。将染液洗涤干燥后，于油镜下观察顶体完整情况。每张抹片中观察200个精子，并统计顶体完整的精子数。其中，顶体着色为均匀的蓝色，代表顶体完整;反之，顶体着色浅或未染色，且边缘不完整为顶体缺失或损坏。精子顶体完整率=顶体完整的精子数/总精子数×100%。

    1.4? 统计分析

    上述试验均重复3次，所得数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，所有数据以平均值±标准误表示，当P<0.05表示差异显著。

    2? 结果与分析

    2.1? 比格犬鲜精品质检测结果

    本试验共采集8只公犬的精液，进行精液品质检测分析（表2）。其中1号、3号和6号的犬只精液检测结果不符合后续试验要求。故选用2号、4号、5号、7号和8号犬为试验犬，采集精液后进行精液冷冻与冻后分析。通过对合格的5只犬新鲜精液进行品质检测，犬平均射精量为2.85 mL，密度为2.01×108个/mL，pH为6.56。

    2.2? 不同糖类对犬精子冷冻保存效果的影响

    稀释液中不同糖类物质对犬精子解冻后的精子活率、活力、质膜完整性和顶体完整性影响如表3所示。其中添加葡萄糖和果糖的稀释液中精子解冻后活率最高，分别为59.21%±2.00%和59.90%±1.36%（P<0.05）;添加蔗糖和海藻糖精子解冻后活率较低，分别为49.52%±2.20%和49.52%±1.74%。通过检测解冻后精子活力发现，仅添加蔗糖稀释液的精子活力最低，为0.46%±0.01%，而稀释液中添加其余4种糖类物质的精子解冻后活力差异不显著（P>0.05）。进一步评估精子解冻后质膜完整率，结果显示添加果糖的稀释液组质膜完整率最高，为49.52%±2.12%，且与添加葡萄糖、乳糖和海藻糖差异不显著（P>0.05），但添加蔗糖的精子质膜完整率最低，为42.21%±2.68%（P<0.05）。通过对各组冻后精子顶体完整率检测发现，添加果糖组最高，为48.20%±1.80%，而添加蔗糖组最低，为40.59%±2.38%。

    3? 讨论

    精液冷冻稀释液中糖类物质作为非渗透性保护剂，在冷冻过程中能提高细胞外的渗透压，从而避免细胞内水分向外流出而造成细胞脱水而皱缩，也能进一步减少细胞内冰晶形成，从而避免细胞遭受破坏[11]。此外，以往研究显示稀释液中糖类物质的添加能减少甘油对精子的毒害作用，从而提高精子活率和顶体完整率[12]。

    作为反映精子运动状态的重要指标，精子活率直接影响精子的受精能力，从而影响受精率。目前，不同国家对于解冻后精子活率和活力的标准不同，发达国家普遍要求均为35%以上，我国对解冻后的精子活率和活力要求均为30%以上[13]。稀释液中添加的5种糖类物质后，犬精液解冻后精子活率和活力均超过国内外标准，说明5种糖类物质的稀释液均能保证犬精子解冻后的受精能力。其中，添加果糖的稀释液中犬精子冻后活率最高，葡萄糖次之。较多研究已经证明果糖和葡萄糖是精子的主要能量来源，但在犬的精液中没有发现果糖和葡萄糖的存在。因此，外源性的添加果糖和葡萄糖能增加犬解冻后精子的能量代谢[13]。

    精子质膜是在精子冷冻和解冻过程中最易受损伤的部位，也是影响精子受精能力的重要因素之一。精子质膜的完整性对精子维持自身新陈代谢、精子获能和顶替反应等能力有直接关系[15]。本试验结果表明，稀释液中添加不同糖类物质对犬精子冻后的质膜完整率效果依次为果糖>葡萄糖>海藻糖>乳糖>蔗糖。稀释液中添加糖类物质主要有两方面作用，第一，糖类物质能提高过氧化物酶的活性，防止细胞质膜受到脂质过氧化，从而保持细胞膜通透性的稳定;第二，糖类物质具有一定黏性，能黏附在精子外围，形成一个微环境，减少冷冻过程中形成的冰晶，从而防止冰晶对细胞质膜完整性的破坏[15]。此外，有研究显示，蔗糖在哺乳动物精液低温保存中，必须和渗透性抗冻剂联合使用才能有效保护精子，这也进一步解释了本试验中稀释液添加蔗糖组精子解冻后质膜完整性最低的原因[16]。

    精子顶体中含有能影响精子受精能力的水解酶，若顶体结构受损伤而破坏，造成水解酶的丢失，直接影响精子的受精能力。保持精子完整性也是精子能够完成顶体反应、穿过透明带的必要前提[17]。目前，已经证明精子受到低温应激后，会出现顶体异常，造成顶体完整率降低，一定程度上影响了精子的冷冻保存效果[18]。本试验研究结果表明，稀释液中添加不同糖类物质对犬精子冻后的质膜完整率效果依次为果糖>乳糖>葡萄糖>海藻糖>蔗糖。以往研究显示，精液稀释液中添加糖类物质，通过激光扫描共聚焦显微镜检测发现其能增加细胞膜流动性，从而令精子顶体完整率得到提升[19]。本研究结果显示，添加果糖组的精子冻后顶体完整率显著高于蔗糖组，进一步说明果糖作为犬精液稀释液相对于蔗糖更加具有优势。

    综上所述，不同糖类物质对犬精子的冷冻保存具有不同程度的影响，综合解冻后犬精子的活率、活力、质膜完整性和顶体完整性检测结果，果糖作为犬的精液冷冻稀释液是最佳的。

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    收稿日期：2020-04-20

    基金项目：上海市农口系统青年人才成长计划[沪农青字（20l8）第l-22号]

    作者简介：孙玲伟（1987-），女，黑龙江伊春人，助理研究员，博士，主要从事动物繁殖学研究，（电话）17740813839（电子信箱）

    sunlingwei1987@126.com;通信作者，张德福（1963-），男，上海奉贤人，研究员，博士，主要从事动物繁殖生物技术研究，

    （电话）021-52235475（电子信箱）zhangdefuzdf@163.com。