产气荚膜梭菌β1毒素基因克隆与表达

    张蓉蓉++艾地云++张腾飞++罗青平++温国元++王红琳++汪宏才++邵华斌

    

    

    

    摘要:以C型产气荚膜梭菌中PCR扩增出β1毒素基因,构建了表达质粒pGEXKG-β1,将构建的KG-β1转化受体菌BL21(DE3),得到重组菌株BL21/KG-β1。对重组菌株诱导的表达产物进行了SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达毒素蛋白。

    关键词:产气荚膜梭菌;β1毒素;克隆表达

    中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1007-273X(2016)09-0007-02

    产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)在自然界中广泛分布,是人和动物肠道内的一种正常菌,能产生a、β、ε、ι四种主要毒素,根据产生这四种毒素种类的不同,可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E五种类型[1]。该菌在家禽中主要是能引起坏死性肠炎,鸡源产气荚膜梭菌主要是A型,但也有C型,C型产气荚膜梭菌主要产生a和β两种毒素。其中β毒素具有细胞毒性和致死性的特点,是重要的致病因子[2]。课题组在前期进行了鸡源产气荚膜梭菌a毒素的克隆表达及免疫原性研究[3],本研究旨在进一步对β毒素进行克隆表达,为其诊断试剂和亚单位疫苗的研究提供基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株与载体 C型产气荚膜梭菌、受体菌大肠杆菌DH5a和BL21(DE3)和pGEX-KG载体由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

    1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶BamH I和Xho I、PCR试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司;RNaseA、Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司;细菌DNA提取试剂盒购自OMEGA公司。

    1.2 方法

    1.2.1 引物合成 参照NCBI中产气荚膜梭菌β1毒素全基因组序列,设计1对β1毒素基因引物,上游引物CPb01: 5′-ACGGGATCCTTAGTTATAGTTAGTTCACTTT-3′,下游引物CPb02:5′-ACGCTCGAGCTAAATAGCTGTTACTTTATG-3′,目的片段大小为1 008 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。上游引物和下游引物分别含有BamH I和Xho I酶切位点。

    1.2.2 全基因组的提取 将产气荚膜梭菌在厌气肉肝汤中于37 ℃厌氧培养过夜离心后,将沉淀菌细胞重悬于含2 mg/mL溶菌酶的TE溶液中,混匀后30 ℃水浴10 min。按照OMEGE bacterial DNA Kit说明书进行全基因组的提取。

    1.2.3 PCR扩增 50 μL PCR反应体系为:10×Buffer缓冲液5.0 μL,MgCL2(25 mmol/L)4.0 μL,dNTPs(10 mmol/L)1.0 μL,模板5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL和Taq DNA聚合酶(25 U)1.0 μL,加灭菌双蒸水补足至50 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

    1.2.4 PCR产物的回收、连接转化及鉴定 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳回收后,以DNA胶回收试剂盒回收PCR产物,按说明书操作。将回收纯化的目的产物与pGEX-KG载体双酶切后,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,以含有氨苄西林(Amp)抗性平板进行筛选培养,挑取白色菌落于含Ampr的LB液体培养基上培养过夜,以SDS碱裂解法提取重组质粒,经PCR鉴定及BamH I和Xho I双酶切分析筛选阳性克隆。

    1.2.5 阳性质粒的诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析 将构建的阳性质粒转入受体菌BL21(DE3)经37 ℃加IPTG诱导后,按文献[4]报道的方法收集菌体变性处理后,进行SDS-PAGE电泳分析。

    2 结果与分析

    2.1 PCR鉴定结果

    采用设计的特异性引物进行β1毒素基因的PCR扩增,经1%琼脂糖凝胶电泳,结果表明,以产气荚膜梭菌为模板扩增出约1 000 bp的特异性条带,与预期大小相符(图1)。

    2.2 重组质粒的双酶切鉴定

    将质粒经PCR鉴定后用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切鉴定,结果见图2。由图2可见,经双酶切后可获得大小约为5 000和1 000 bp的2条DNA条带,即pGEX-KG载体和目的基因条带,初步表明成功构建产气荚膜梭菌β1毒素克隆表达质粒。

    2.3 β1毒素基因表达产物SDS-PAGE分析

    将BL21(DE3)菌株作为表达的宿主菌,经转化挑取单个菌落培养诱导后,菌体经超声波处理,提取包涵体,上清经80%饱和硫酸铵沉淀后得到浓缩,沉淀经透析后,用SDS-PAGE分析(图3),在相对分子质量约为56 ku处出现特异性蛋白条带,结果表明β1毒素可在宿主菌种得以表达,并且β1毒素蛋白多以包涵体的形式存在表达。

    3 讨论

    产气荚膜梭菌能产生多种具有致病性的外毒素,其中β毒素不仅能引起家禽坏死性肠炎及仔猪肠毒血症,也能引起婴幼儿的坏死性肠炎[5],危害极其严重。本研究利用PCR技术,设计特异性引物成功地从C型产气荚膜梭菌中扩增出目的片段β1,并构建了成功表达β1毒素的重组菌株,表达的蛋白以包涵体形式存在,纯度高。β1毒素的表达为产气荚膜梭菌的临床诊断和基因工程疫苗提供了前提。

    参考文献:

    [1] SPARK S G, CARMAN R J, SARKER M R,et al. Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with antibiotic-associated diarrhea and food poisoning in North America[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(3):883-888;

    [2] TIMBERMONT L, LANEKRIET A, PASMANS F,et.al. Intra-species growth- inhibition by Clostridium perfringens is a possible virulence trait in necrotic enteritis in broilers[J]. Veterinary Microbiology, 2009(12):l-4.

    [3] 张蓉蓉,艾地云,张腾飞,等. 鸡源产气荚膜梭菌a毒素基因克隆表达及免疫原性的初步研究[J].湖北农业科学,2015,54(20):5152-5154.

    [4] 梁宋平.生物化学与分子生物学实验教程[M].北京:高等教育出版社,2003.

    [5] GRANUM P E. Clostridium perfringens toxin involved in food poisoning[J]. Int J Food Microbiol,1990,10:101-111.

相关文章!
  • 多壁碳纳米管净化-气相色谱法

    李解 樊磊摘要 ? ?本文建立了超声波提取、固相萃取净化、气相色谱-电子捕获检测器法(GC-ECD)同时测定瓜菜中α-六六六、β-六六六、γ-六六六

  • 南美白对虾海水高位池养殖高产

    黄元明 龚恩俊 周冠军 康镐 李喜超 何乐云 盛楷源摘?要:为探寻高产高效的养虾模式,应对环境恶化及疾病蔓延对南美白对虾(Penaeus

  • 江苏智慧牧业装备科技中心成立

    2020年12月8日,由南京农业大学、江苏省农业机械技术推广站、南京慧秋生物科技有限公司共同创建的江苏智慧牧业装备科技创新中心在南京正