基于液相色谱-飞行时间质谱的白花龙叶化学成分分析
欧阳胜祥 姚文华 唐熙麟 李青 朱庆妮 黄睿 陈彦斌 金威 龙飞
摘 要 通过液相色谱-飞行时间质谱联用技术定性分析白花龙叶甲醇提取物中的化学成分，为白花龙叶的进一步研究和开发提供依据。色谱分离采用C18色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），以0.2%甲酸-乙腈为流动相梯度洗脱，流速0.3 mL·min-1，质谱定性采用飞行时间质谱，正负离子模式扫描。结果：从白花龙叶中鉴定出54种化合物，其中黄酮类9种，有机酸类9种，酯类4种，糖类5种，氨基酸7种，香豆素类6种，木脂素类6种，酚类3种，醛类、苯丙酸类、萜类、苷类和维生素类各1种。针对白花龙叶，本研究建立了一种基于LC-ESI-TOF-MS/MS技术分析鉴定其化学成分的方法，发现含有许多对人体有保健功能的成分。
关键词 白花龙叶;液相色谱-飞行时间质谱;化学成分
中图分类号：Q501文献标志码：ADOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.01.001
白花龙（Styrax faberi Perk.）为安息香科安息香属植物，主要分布于我国长江流域以南各省区，生长在海拔100～600 m的低山区和丘陵灌丛中[1]。
湖南郴州、岳阳等地人们常用白花龙叶当茶饮，饮用历史达百年之久。已有的研究表明，安息香属植物的花、叶、果均可入药，具有清热解毒、开窍行气、活血止痛的作用，可治疗风湿关节炎、胃痛等[2]，并对预防皮肤衰老和治疗皮肤癌等有重要作用[3]，其叶对镉的去除也有明显效果[4]。目前白花龙多为野生，对于白花龙叶中所含有的具体化学成分尚未见系统的文献报道[5]，也一直未被深度开发利用。对白花龙叶片中的化学成分进行研究，有利于充分开发这一植物资源在饮用和药用方面的价值。本研究采用液相色谱-三重四级杆/飞行时间高分辨质谱联用技术对白花龙叶片的化学成分进行定性分析，旨在为白花龙叶的进一步研究和开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
野生白花龙树叶，经杀青、晒干制得。
1.2 仪器与试剂
AB 5600+三重四级杆飞行时间质谱仪（美国AB Sciex公司）;岛津LC-30A液相色谱仪;高速低温离心机（Sigma公司）;NC1500-T非接触式超声波处理器（上海欧河机械设备有限公司）。甲酸、乙腈为HPLC级，其他试剂为分析纯，具体制备方法参照王军[6]、李嘉蓉[7]等人的文献。
1.3 色谱条件
色谱柱为C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）;柱温为35 ℃;流速为0.3 mL·min-1;进样量为5 μL;流动相采用乙腈-0.2%甲酸水溶液的梯度洗脱程序（见表1）。
1.4 质谱条件
离子化模式为电喷雾正离子模式，离子源电压 5 500 V，离子源温度600 ℃，去簇电压（DP）100 V，碰撞能量（CE）35 eV，碰撞能量擴展（CES）为15 eV。雾化气体为氮气，辅助气1为60 PSI，辅助气2为50 PSI，气帘气为40 PSI。一级质谱母离子扫描范围为50～1 000，在IDA设置响应值超过100 cps的6个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为50～1 000，开启动态背景扣除（DBS）。
离子化模式为电喷雾负离子模式，离子源电压 -4 500 V，离子源温度500 ℃，去簇电压（DP）100 V，碰撞能量（CE）-35 eV，碰撞能量扩展（CES）为15 eV。雾化气体为氮气，辅助气1为60 PSI，辅助气2为50 PSI，气帘气为40 PSI。一级质谱母离子扫描范围为50～1 000，在IDA设置响应值超过100 cps的6个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为50～1 000，开启动态背景扣除（DBS）。
1.5 供试品制备方法
取白花龙干燥叶片粉碎得粉末，取粉末0.5 g于10 mL玻璃试管内，加入5 mL 50%甲醇-水溶液浸泡4 h，然后40 ℃超声40 min;取此中药提取液2 mL于2 mL离心管内，以2 000 r·min-1低温（4 ℃）离心10 min，过0.22 μm微孔滤膜后装入1.5 mL自动进样瓶，得到中药提取物样品。同样条件得到空白对照样品。将样品放入4 ℃冰箱保存，在分析前取出（保存时间不能超过24 h）。
1.6 数据分析方法
通过文献调研，查找了文献报道的安息香科植物常见化学成分及植物常见萜类、酚酸类、黄酮类、蒽醌类、脂肪酸类、生物碱类、木脂素、香豆素类、苷
类、维生素及氨基酸等化学成分，采用液相色谱-三重四级杆-飞行时间高分辨质谱联用技术，将所获得的化合物精确分子质量、碎片离子峰、色谱保留时间与数据库中的化学成分进行匹配，并结合METLIN数据库和HMDB数据库，定性分析白花龙叶的化学成分。
2 结果与分析
拟定分析条件下，白花龙叶甲醇超声提取液中化学成分正负离子模式下总离子流图见图1。
对总离子流图中的一级质谱信号较强的谱峰进行二级质谱分析得到特征碎片，进一步获得化合物的化学结构式。通过质谱提供的准确分子质量推导出化合物的分子式，再依据特征碎片二级质谱图信息，与相关文献数据比对，并结合METLIN数据库和HMDB数据库，共推测出54种成分，结构类型可分为 13类（见表2）。
2.1 黄酮类化合物
从白花龙叶中鉴定出9种化合物：忍冬苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素、芦丁、柚皮素、鼠李素、白前苷B、黄腐酚。其保留时间分别为6.238、8.447、8.243、8.182、3.527、12.552、7.589、9.392、14.473 min，相对分子量分别为594.5、302.2、286.2、270.2、610.5、272.3、316.3、448.4、354.4。忍冬苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素、芦丁、柚皮素、鼠李素、白前苷B、黄腐酚在二级质谱图中对应出现的碎片峰分别为m/z255、285、284，m/z303、257，m/z153、213、287，m/z115、141、197，m/z283、285、255，m/z119、117，m/z217、245、302，m/z447、448、449，m/z137、151、203、307。根据结果分析，参考文献[8]得出皆为黄酮类化合物。
2.2 氨基酸类化合物
氨基酸是组成蛋白质的基本单位，同时也是重要的活性物质，在反相色谱中保留弱。本研究通过待测物的精确分子质量、分子式和一级二级质谱图等信息，结合文献[8-9]的研究，共鉴定出苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、脯氨酸这7种氨基酸。
2.3 酚类物质
酚类物质一般极性较大，在反相色谱中保留较弱，由于存在苯环等大共轭体系，一般具有较强的紫外吸收。
本实验经HPLC二级管阵列检测器的全波长扫描，结合文献[8-10]的报道，对质谱鉴定结果进行确认。共鉴定出没食子儿茶素、去甲氧基姜黄素和去氢二异丁香酚3种酚类物质。
2.4 香豆素类物质
香豆素类化合物具有抗HIV、抗癌、降压、抗心律失常、抗骨质疏松、镇痛、平喘及抗菌等多方面生物学活性，本实验以图谱数据为基础，参照文献[11-13]，共鉴定出6种香豆素类物质：二氢欧山芹醇当归酸酯、8-甲氧基异欧前胡内酯、东莨菪苷、欧前胡素、紫花前胡素、羟甲香豆素。
2.5 有机酸类物质
根据文献[8，10，14]，结合本实验的波谱数据，共鉴定出9种有机酸物质：5-（9H-fluoren-9-yl-methoxy）-5-oxop-entanoic acid、肉桂酸、苯甲酸、香草酸、亚麻酸、亚油酸、胆酸、软脂酸、D-葡萄糖醛酸。
2.6 木脂素类物质
木脂素类物质是安息香属植物中文献报道最多的一类化合物，从根、茎、种子中都曾分离得到过，但未见到从叶中分离得出的报道。在本实验基础上，结合[9，15-16]等文献，鉴定出6种木脂素类物质：桉叶素、襄五脂素、木兰脂素、异紫杉脂素、松脂素、落叶松树脂醇。
2.7 其他类型化合物
利用LC-ESI-TOF-MS/MS所显示的紫外吸收光谱、保留时间、分子式和质谱碎片信息，结合文献[9，15，17]，鉴定了4种酯类物质：肉桂酸苯丙酯、水杨酸甲酯、桂酸桂酯、苯甲酸乙酯;结合文献[18]，鉴定了5种糖类：蔗糖、葡萄糖、鼠李糖、龙胆二糖、水苏糖四水合物;参照文献[8-9]，鉴定了安息香属植物报道较多的醛类物质香草醛;依照文献[15]，鉴定出曾在安息香树枝和根茎中鉴定到的萜类物齐墩果酸;参照文献[19-20]，鉴定出苯丙酸类阿魏酸;结合文献[25]，获得苷类物质苔黑酚龙胆二糖苷;参考文献[21-23]，鉴定出维生素PP（烟酸）。
3 讨论
高效液相色谱-飞行时间质谱技术具有样品处理简单、用量少，快速高效、灵敏度高等特点，依据高分辨率和精准分子质量及一、二级质谱峰提供的碎片信息，使定性分析的准确度得到大幅提高，是植物化学成分分析的重要手段。但该技术还存在一定的局限性，比如在同分异构体的辨别和质谱碎片的裂解途径等方面不能获得精准的结果，还需要结合其他技术手段或资料，才能得到最终的确认。
白花龙叶泡茶饮用，具有似薄荷般清凉的口感，并能快速祛痰、平喘，在民间已有上百年的饮用历史。但对白花龙的研究非常少，近年来才有人对其栽培繁育[24-26]、园林绿化[27]方面进行研究探索，而对于白花龙叶中所含有的具体化学成分还未见系统的研究报道。本研究对白花龙叶中的化学成分进行定性分析，证实了其中含有许多对人体有保健作用的成分，从而也解释了湖南民间有人长期用其泡茶的缘由。针对这些特殊化学成分的含量和保健功效，有待于做进一步的定量研究和活性分析。
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（责任编辑：丁志祥）
收稿日期：2020-09-10
作者简介：欧阳胜祥（1981—），男，湖南常德人，硕士，农艺师，主要从事林木培育和经济林研究。E-mail：258456237@qq.com。
