重金属对凡纳滨对虾血细胞吞噬活力的影响
汪蕾 张秀霞 鲁耀鹏 郑佩华 冼健安
摘?要：为研究不同重金属离子对虾类血细胞的免疫抑制作用，凡纳滨对虾（Ltiopenaeus vannamei）血细胞在离体状态下暴露于重金属离子（Cd2+、Hg2+、Cu2+和Zn2+），浓度分别设置为10-3～10-9 M，在胁迫6 h后应用流式细胞术测定血细胞的吞噬活力。结果显示，与对照组相比，浓度为10-3～10-5 M的Cd2+和Hg2+、10-3～10-4 M的Cu2+、10-3 M的Zn2+均显著抑制了对虾血细胞的吞噬活力;当浓度为10-3M时，Cd2+、Hg2+、Cu2+和Zn2+组的吞噬活力抑制率分别为79.6%，82.6%、68.1%和58.7%。这些结果表明，一定浓度的重金属离子对虾类血细胞吞噬活力具有免疫抑制作用，免疫抑制毒性强度依次为：Hg2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+，免疫毒性临界浓度分别为：Cd2+和Hg2+ 10-5 M、Cu2+ 10-4 M、Zn2+ 10-3 M。
关键词：重金属;凡纳滨对虾（Ltiopenaeus vannamei）;血细胞;吞噬活力;免疫抑制
中图分类号：X171
文献标识码：A
由于工业的迅猛发展，重金属对水体环境的污染日趋严重。重金属是典型的积累性污染物，具有较强的生物毒性和持久性，对水生动物的毒性极大，而且极易富集在水生动物体内， 并可通过食物链进入并毒害人体，因此倍受研究者的关注。重金属对虾类毒性影响的研究主要集中在半致死浓度和酶类活性变化[1-3]。血细胞在虾类免疫功能中起着十分重要的作用，吞噬作用是虾类血细胞免疫防御的主要功能之一[4]，但以往由于技术限制等原因，重金属对虾类血细胞影响的研究仍甚少。
流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一种快速、准确地检测单个细胞功能的先进技术，此技术为细胞水平的研究提供了便捷、可靠的检测平台，在临床研究中的应用十分广泛，近年来已逐步应用到水产动物血细胞研究中[5-7]。本研究应用流式细胞术分析四种常见重金属离子（Cd2+、Hg2+、Cu2+和Zn2+）对凡纳滨对虾离体血细胞吞噬活力的影响，探讨不同重金属离子对虾类血细胞的免疫毒性。
1?材料和方法
1.1?材料与试剂
凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）购于广东省广州市番禺区某养殖场，平均体重 ??（9.69±1.47）g，在实验室[盐度20‰，pH 7.9～8.0，温度（24 ± 2）℃]暂养1周后，选取附肢完整、无病患、处于蜕皮间期的个体作为试验用虾。
黄绿色荧光微球（直径1 μm）购自Molecular Probes，Invitrogen 公司，取微球原液，双蒸水稀释10倍得到微球工作液，微球浓度为3.6×109个/mL。其它试剂为国产分析纯。
1.2?血细胞悬液的制备
用2.5 mL一次性注射器吸取400 μL预冷的抗凝剂（葡萄糖20.5 g/L，柠檬酸钠8 g/L，氯化钠4.2 g/L，pH 7.5），然后从虾的围心腔抽取等量的血淋巴。取足够的血淋巴后将其混合，用预冷的抗凝剂调整细胞浓度约为1×106个/mL，再分装于离心管中。
1.3?离体重金属胁迫
分别以CdCl2·2.5H2O、HgCl2、CuCl2和ZnCl2作为Cd2+、Hg2+、Cu2+和Zn2+的添加源，各重金属离子的浓度均分别设置为10-3～10-9 M，不作处理的血细胞作为对照组。用抗凝剂配制浓度为10-1 M的各重金属溶液，再依次逐步稀释为10-2～10-7 M的工作液，分别加3 μL不同浓度的重金属溶液至297 μL的血细胞悬液中，得到细胞悬液中重金属的終浓度分别为10-3～10-9 M，对照组加入3 μL的抗凝剂。在室温下孵育6 h。
1.4?流式细胞仪
实验所用流式细胞仪是美国BD（Becton Dickinson）公司生产的FACSCalibur，激发光为488 nm。应用CellQuest软件（Becton Dickinson I mmuno-cytometry Systems，San Jose，CA）进行实验数据的获取和分析。每个样品的细胞获取数为10 000个。
1.5?吞噬活力测定
以直径为1 μm的黄绿色荧光微球作为被吞噬物测定血细胞的吞噬活力。血细胞经重金属处理6 h后，加入微球工作液7.5 μL，避光孵育60 min，200目筛网过滤后上机检测。结果以细胞的荧光强度（FL1）为横坐标，细胞数量为纵坐标的直方图显示。吞噬三个或以上荧光微球的细胞认为是吞噬阳性，通过Marker划定阳性区域计算阳性细胞所占的比例，即为吞噬率。按以下公式计算吞噬活力抑制率：吞噬活力抑制率=（1-胁迫组吞噬率/对照组吞噬率）×100%。
1.6?统计分析
实验重复三次，结果显示为平均值 ± 标准差（Mean ± SD）。应用SPSS 13.0对实验数据进行单因素方差分析。
2?结果
2.1?Cd2+对血细胞吞噬活力的影响
10-3、10-4和10-5 ?M Cd2+显著抑制血细胞的吞噬活力，吞噬活力分别降至对照组的20.4%（P<0.05）、34.7%（P<0.05）和60.3%（P<0.05）。10-6～10-9 M Cd2+组血细胞的吞噬活力与对照组之间没有显著性差异（P>0.05）。
2.2?Hg2+对血细胞吞噬活力的影响
10-3、10-4和10-5 M Hg2+显著抑制血细胞的吞噬活力，吞噬活力分别降至对照组的17.4%（P<0.05）、17.6%（P<0.05）和45.4%（P<0.05）。10-6～10-9 M Hg2+组血细胞的吞噬活力与对照组之间差异不显著（P>0.05）。
2.3?Cu2+对血细胞吞噬活力的影响
10-3和10-4 M Cu2+显著抑制血细胞的吞噬活力，吞噬活力分别降至对照组的31.9%（P<0.05）和47.7%（P<0.05）。10-5～10-9 M Cu2+组血细胞的吞噬活力与对照组之间没有显著差异（P>0.05）。
2.4?Zn2+对血细胞吞噬活力的影响
10-3 M Zn2+显著抑制血细胞的吞噬活力，吞噬活力降至对照组的41.3%（P<0.05）。10-4～10-9 M Zn2+组血细胞的吞噬活力与对照组之间没有显著差异（P>0.05）。
2.5?吞噬活力抑制率
按以下公式计算吞噬活力抑制率：（对照组吞噬率-胁迫组吞噬率）/对照组吞噬率×100%
不同浓度重金属对吞噬活力抑制率如表1所示，吞噬活力抑制强度依次为：Hg2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+， Cd2+，Hg2+，Cu2+和Zn2+的吞噬抑制毒性临界浓度分别为10-5 M，10-5 M，10-4 M和10-3 M。
3?讨论
重金属对虾类具有较强的毒性，一些重金属对虾类的半致死浓度已有研究报道。Cd和Cu对体长6～9 mm、体重2.0～8.5 mg的凡纳滨对虾幼虾的24 h LC50分别为2.22和4.50 mg/L，毒性Cd>Cu[8]。Cu和Zn对体长5～13 mm、体重1.50～10.83 mg的中国对虾（Penaeus chinensis）仔虾的24h LC50分别为3.74和5.12 mg/L，毒性Cu>Zn[2]。Cu、Zn、Cd和Hg对体长0.80～1.10 cm的斑节对虾（Penaeus monodon）仔虾的24 h LC50分别为7.978、8.904、4.365和0.329 6 mg/L，毒性依次为Hg>Cd>Cu>Zn[9]。Hg、Cd和Zn对的日本对虾（Penaeus japonicus）仔虾（P4）的24 h LC50分别为0.133、4.039和4.600 mg/L，毒性依次为Hg>Cd>Zn[10]。不同虾类对重金属的耐受能力不同，但总体而言，Hg和Cd作为非必需的重金属元素，其毒性较强。在本研究中，依据临界浓度可初步判断Cd2+和Hg2+对吞噬活力的抑制毒性较强，进一步比较相同浓度下吞噬活力的抑制率，可发现Hg2+对吞噬活力的抑制强度大于Cd2+，由此可见，在这四种重金属中，Hg2+的免疫抑制毒性最强，重金属对血细胞吞噬活力的免疫抑制毒性强度依次为：Hg2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+。罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）的研究显示，针对细胞活性，重金属对血细胞的毒性强度依次为：Hg2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+，针对血细胞酯酶活力，Hg和Cd表现出较强的抑制性，Cu和Zn的抑制性相对较弱，表明Hg和Cd具有较强的免疫抑制毒性[6]，与本研究结果相似。
贝类是重要的水体环境质量指示物种，重金属对贝类吞噬活力影响的研究报道相对较多。Sauve等研究了Ag、Cd、Hg和Zn对多种海水和淡水双壳贝类血细胞的影响，不同的物种表现出对重金属的不同敏感性;在所有测试物种中，高浓度重金属暴露均抑制了血细胞的吞噬活力，与本试验结果一致;但在部分物种中，发现低浓度的有机Hg、无机Hg以及Zn可引起吞噬活力的提高，作者认为这是毒物兴奋效应[11]，在本研究中没有发现这一现象。蛤（Mya arenaria）的研究结果也显示，经18 h的离体暴露，10-9和10-8M的低浓度的有机Hg、无机Hg以及Zn、Cd均刺激了血细胞的吞噬活力，而10-7M以上的浓度时，则表现出对吞噬活力的抑制性，依次为：ZnCl2
本研究结果表明虾类血细胞的吞噬活力对重金属胁迫较敏感，可作为检测重金属免疫毒性的重要指标。重金属对虾类其它免疫功能的影响也有研究报道。低浓度的镉（7.5 mg·L-1）对克氏原螯虾肝胰腺和触角腺中的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力起到了激活作用，而高浓度的镉（30 mg·L-1）均显著抑制了肝胰腺、触角腺和鳃中的抗氧化酶活力[14]。一定浓度的重金属会产生免疫毒性，降低虾类的抵抗力，增加患病风险，因此在养殖过程中应重视养殖水体的重金属含量。
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