Fe2+急性胁迫对斑尾复鰕虎鱼组织结构的影响

    宫春光 殷蕊 孙桂清 于清海 石艳洁 张建业

    摘 要：为探究重金属Fe2+对斑尾复鰕虎鱼（Synechogobius hasta）组织结构的影响，在水温16.5 ℃、盐度30‰、pH 8.0的环境下，进行了Fe2+对斑尾复鰕虎鱼的急性胁迫实验。结果表明，斑尾复鰕虎鱼对Fe2+异常敏感，最小浓度组5 mg/L的平均死亡时间仅为5.2 h；在各种组织器官中，Fe2+对斑尾复鰕虎鱼的鳃组织损伤最为明显，会造成鳃丝充血，鳃小片上皮细胞增生，从而严重阻碍鱼的呼吸机能。

    关键词：斑尾复鰕虎鱼（Synechogobius hasta）；Fe2+；急性胁迫；组织结构

    斑尾复鰕虎鱼（Synechogobius hasta），与矛尾复鰕虎鱼同物异名，隶属鲈形总目（Perciformes），鰕虎鱼亚目（Gobioidei）鰕虎鱼科（Gobiidae）鰕虎鱼亚科（Gobiinae），复鰕虎鱼属（Synechogobius）[1]。在我国黄渤海、东海、台湾海峡及周边半咸水水域均有分布，属底栖鱼类，多栖息于沙泥底质。斑尾复鰕虎鱼生命周期仅一冬龄，亲鱼早春4月产卵后大部分死亡，捕获的野生个体大小不等，通常在50～200 g/尾，经济价值不高，属沿海小型杂鱼[2-3]，由于其具有摄食虾苗的习性，因此在沿海对虾养殖中往往被作为敌害生物对待，通过虾池进水时的密网（80目筛绢）过滤或进水后使用茶粕予以清除。

    国家虾产业体系近几年的研究结果表明，利用生物防控技术对某些病毒性虾病的防控能够取得较好效果，通过在虾池中混养鱼类，利用鱼类摄食病死虾以减少虾病的传播。以往所公布的混养鱼类均为规模化人工养殖品种，人们对这些品种的研究相对较多，对不同品种的生态环境适应性了解较多，容易处理混养中的各种问题。在国家虾产业体系以往所列的混养鱼类中并无斑尾复鰕虎鱼，但2017年河北省对虾养殖生产实践表明，该鱼的混养效果在各种混养鱼类中表现最好，尤其是在中国对虾的养殖中。在每hm2放养600尾左右的斑尾复鰕虎鱼时能够取得较理想的效果，即摄食病死虾的比例超过70%（摄食健康虾的比例低于30%），同时基本控制了病毒性虾病（尤其是白斑综合征（WSD））的流行，斑尾复鰕虎鱼未来有望成为重要的对虾养殖生物防控混养鱼类。而目前该鱼尚未有人工规模化养殖，市场上的商品多来自海捕和虾池捕捞，人们对其生态环境要求及各种环境胁迫（包括药物胁迫）对其影响缺乏了解，在养殖中环境调控和药物使用缺乏依据，亟需进行相关研究。河北省很多虾池利用地下咸水進行养殖，地下水中的Fe2+含量往往过高，而Fe2+对斑尾复鰕虎鱼的影响尚不得而知。本实验通过研究Fe2+急性胁迫后该鱼的组织结构变化，以阐明Fe2+对斑尾复鰕虎鱼的影响，丰富该鱼环境胁迫反应数据库，为养殖实践提供数据支持。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    实验用斑尾复鰕虎鱼捕捞自河北省黄骅地区沿海，平均全长34.05 cm，平均体重142.94 g；实验水槽为体积30 L水族箱；实验用水为海水晶+曝气1 d的自来水配制的人工海水；添加的Fe2+使用硫酸亚铁分析纯。制作切片的各种试剂为常规试剂。

    1.2 实验方法

    斑尾复鰕虎鱼在正式实验开始前暂养2 d，选用规格相近、体色正常、体表无外伤、健壮的个体用于胁迫实验；实验用水水温16.5 ℃、盐度30‰、pH 8.0；在水族箱中加入20 L人工海水，以Fe2+为计算单位加入硫酸亚铁，浓度设置为5、50和500 mg/L，每组设3个平行，设一个对照组；配制好药液后在每个箱中放入2条实验鱼，不充气，静水实验。实验期间不投喂。

    实验开始后观察不同浓度组实验鱼的游动情况、呼吸频率、黏液分泌等表征；实验鱼一旦出现死亡，立即解剖，取鳃、肝脏、肾脏和脾脏，Bouin氏液固定，经自来水冲洗、梯度酒精脱水、透明、透蜡和石蜡包埋等步骤后进行切片，切片厚度5 μm；采用苏木精-伊红染色法（H. E）染色，BK5000显微镜观察并拍照。

    2 结果与分析

    2.1 实验结果

    2.1.1 实验鱼表征 硫酸亚铁加入水中后，实验用水很快变成红褐色，0.5 h后逐渐产生红褐色沉淀，药物浓度越大越明显。实验鱼放入水中后，除开始时有短暂应激反应外，基本没有异常表现，比较安静，仅胸鳍微微摆动，与对照组相同。10 min后500 mg/L浓度组实验鱼开始急速游动，30 min后逐渐趋于平静（麻痹）；50 mg/L 浓度组在实验进行到2 h时出现5 min左右的剧烈游动，其后反应平静；5 mg/L浓度组实验鱼始终处于平静状态。500 mg/L浓度组实验鱼在实验开始1.5 h后体色变浅、发白，50 mg/L浓度组实验鱼3 h后体色开始发白，5 mg/L浓度组实验鱼体色始终无变化。实验开始0.5 h后，所有加入Fe2+实验组的实验鱼黏液分泌开始增多，表现为水中出现絮状物，药物浓度越高絮状物越多。实验开始0.5 h时，对照组鱼鳃盖张合次数为平均27次/min，5 mg/L浓度组为平均32次/min，50 mg/L浓度组为平均33次/min，500 mg/L浓度组为平均52次/min；实验进行2 h时，对照组鱼鳃盖张合次数为平均26次/min，5 mg/L浓度组为平均34次/min，50 mg/L组为平均41次/min，500 mg/L组为平均20次/min；实验进行2.5 h，500 mg/L浓度组开始有死亡出现，该浓度组鱼鳃盖张合次数平均仅为9次/min，对照组鱼鳃盖张合次数为27次/min，5 mg/L浓度组为38次/min，50 mg/L浓度组为平均22次/min。

    500 mg/L浓度组实验鱼在实验进行2.5 h开始陆续死亡，平均死亡时间为2.7 h；50 mg/L浓度组实验鱼在实验进行3.2 h开始陆续死亡，平均死亡时间为3.4 h；5 mg/L浓度组实验鱼在实验进行4.3 h开始陆续死亡，平均死亡时间为5.2 h。对照组鱼没有出现死亡。

    2.1.2 Fe2+对斑尾复鰕虎鱼组织结构的影响 不同浓度Fe2+急性胁迫对斑尾复鰕虎鱼鳃、肝脏、肾脏和脾脏的组织结构影响见图版I-图版IV（见封二、封三）。

    2.2 分析

    硫酸亚铁加入水中后，由于Fe2+氧化成Fe3+，水变成红褐色并逐渐产生红褐色沉淀，这与生产实际相同。河北省多数地区如昌黎、乐亭等地工厂化养殖牙鲆所抽取的地下水半咸水中Fe2+含量超标，地下水初始时清澈透明，但曝气后很快变成红褐色，停止充气后会在池底形成厚厚一层红褐色的沉淀。沉淀物易黏附在鱼鳃上，阻碍鱼的正常呼吸，在工厂化养殖持续充气的情况下，鱼不会很快死亡，但鱼的体质变差，抗逆能力下降，易感染各种生物病原性疾病。

    50 mg/L浓度组实验鱼在2 h内保持平静，5 mg/L浓度组实验鱼在整个实验过程中始终比较平静，说明Fe2+本身并非强刺激性药物，其作用是逐渐显现的。硫酸亚铁有一定收敛作用，可抑制腺细胞的分泌，使鱼的黏膜细胞脱落[4]，但实验鱼却分泌了大量黏液，这可能与实驗鱼呼吸受到阻碍有关。500 mg/L浓度组的实验鱼在实验开始10 min时开始急速游动，在实验进行0.5 h时，鳃盖张合次数达到52次/min（对照组则为27次/min），说明高浓度的Fe2+对斑尾复鰕虎鱼的刺激较强，而当实验进行2 h时，鳃盖张合次数降为20次/min，实验进行2.5 h（到了接近死亡时），鳃盖张合次数降到了仅为9次/min，这种表现一方面符合毒物对生物的胁迫规律，即先兴奋，后逐渐麻痹；另一方面也说明Fe2+对斑尾复鰕虎鱼的主要影响是妨碍其呼吸功能。另外2个浓度组也有类似表现，只不过发生的时间有所区别。

    本次实验中斑尾复鰕虎鱼在Fe2+胁迫下死亡较快，500 mg/L浓度组仅为2.7 h，5 mg/L浓度组也仅仅5.2 h。分析其原因可能有两点：一是实验鱼暂养时间较短，还没有完全适应小水体+人工海水的实验环境，其自身处于应激状态，对药物的抗性较差；二是斑尾复鰕虎鱼对Fe2+非常敏感。为进一步进行验证，我们又进行了一次低浓度胁迫实验，即将Fe2+浓度梯度设置为1、2和4 mg/L，其它实验条件相同。实验结果显示，1 mg/L浓度组的平均死亡时间为25.4 h，2 mg/L浓度组为19.5 h，4 mg/L浓度组为7.5 h。低浓度胁迫实验结果说明斑尾复鰕虎鱼的确对Fe2+异常敏感。

    组织切片结果显示，Fe2+对斑尾复鰕虎鱼肝脏、肾脏和脾脏的影响相对较小，5 mg/L和50 mg/L浓度组的肝脏主要表现为轻度的水泡变性，肾脏主要表现为颗粒变性，脾脏主要表现为轻度萎缩和网状细胞伪足伸长。这些表现在鱼的一般性应激中也经常存在，不能确定是Fe2+所造成的。而500 mg/L浓度组的肝脏（包括胰脏）出现了程度较深的水泡变性，肾脏的颗粒变性较严重，脾脏出现了一定程度的炎性细胞浸润的现象。这些变化很难在一般的应激中出现，可以认为是高浓度Fe2+所造成的，但总体上组织变化仍属于较轻的程度。这种结果可能是药物浸泡时间较短，实验鱼死亡较快所造成的，但也可以确定Fe2+急性胁迫对斑尾复鰕虎鱼的肝脏、肾脏和脾脏的损伤较小。

    Fe2+对斑尾复鰕虎鱼的鳃组织影响最大，在不同浓度组都表现得非常明显。5 mg/L浓度组的鳃即表现出明显的充血和上皮细胞增生的现象（图版I-2、3）；50 mg/L浓度组的鳃小片明显肿胀，入鳃动脉明显扩张，鳃小片和入鳃动脉中充满血细胞（图版I-4）；而500 mg/L浓度组的鳃小片上皮细胞已经严重增生，部分鳃小片出现融合现象，有的鳃小片严重膨胀，体积是正常鳃小片的数倍（图版I-5、6）。可以看出，在鳃、肝脏、肾脏和脾脏这4种组织器官中，Fe2+对鳃组织的损伤最严重，极大影响到了其正常的呼吸机能，是造成实验鱼死亡的主要因素。

    鉴于斑尾复鰕虎鱼经济价值较低和以往作为敌害鱼类的认识，人们对该鱼的研究相对较少，有关其生长及繁殖的报道仅有几篇，如罗刚等进行了矛尾复鰕虎鱼性腺发育及个体繁殖力研究[5]，还进行了矛尾复鰕虎鱼越冬暂养技术的研究[6]，李莉等进行了矛尾复鰕虎鱼室内人工繁育实验研究[7]，李春岭等进行了渤海矛尾复鰕虎鱼生殖力的研究[8]。有关环境（药物）胁迫的报道也较少，仅有刘香江等研究了铜、镉和乙酰甲胺磷对矛尾复鰕虎鱼的急性毒性影响[7]，黄超等研究了水体铜和锌暴露对矛尾复鰕虎鱼肝脏脂代谢的影响[10]，税春等研究了盐度渐变对斑尾复鰕虎鱼幼鱼血清渗透压和离子浓度及鳃丝Na+/K+–ATP酶活力的影响[11]。本项研究首次阐明了Fe2+对斑尾复鰕虎鱼的组织结构影响，为进一步探讨环境（药物）胁迫对斑尾复鰕虎鱼的影响机理奠定了一定基础。研究结果可用于养殖实践，为鱼、虾混养时药物的使用提供一定的理论依据。

    参考文献：

    [1]

    秦克静，姜志强.斑尾复鰕虎鱼和矛尾复鰕虎鱼同物异名的探讨[J].大连水产学院学报，1987（02）：37-39.

    [2] 李晴. 中国黄渤海区虾虎鱼类[D].南昌大学，2008.

    [3] 孙帼英，陈建国.斑尾复鰕虎鱼的生物学研究[J].水产学报，1993（02）：146-153.

    [4] 农业部《新编渔药手册》编撰委员会.新编渔药手册[M].北京：中国农业出版社，2005：232-233.

    [5] 罗刚，徐国成，程汉良. 矛尾复虾虎鱼性腺发育及个体繁殖力研究[J]. 淮海工学院学（自然科学版），2011，20（4）：83-85.

    [6] 罗刚，丁成曙，徐加涛. 矛尾复虾虎鱼越冬暂养技术[J].科学养鱼，2012，2：45.

    [7] 李莉 ，车升亮.矛尾复虾虎鱼室内人工繁育实验[J].水产养殖，2012，11：7-11.

    [8] 李春岭，王振怀，王继芬等.渤海矛尾复鰕虎鱼生殖力的研究[J].河北渔业，2012（03）：5-7.

    [9] 刘香江.重金属铜和镉（ Cu和Cd）及乙酰甲胺磷对矛尾复虾虎鱼毒性效应的研究[D].武汉：华中农业大学，2010.

    [10] 黄超.水体铜和锌暴露对矛尾复虾虎鱼肝脏脂代谢的影响[D].武汉：华中农业大学，2015.

    [11] 税春，施永海，华雪铭，等.盐度渐变对斑尾复鰕虎鱼幼鱼血清渗透压和离子浓度及鳃丝Na+/K+–ATP酶活力的影响[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2014，40（01）：67-71.