应用于ＰＣＲ性别鉴定的朱鹮粪便基因组提取方法的建立

    张漫慧　赵泓淙　王彩霞　王小雨　侯佳　张军风　徐光岚

    

    

    

    摘要：使用无损伤采样的方法收集朱鹮（Nipponin nippon）的粪便样品，结合硫氰酸胍-硅珠法（GuSCN-SiO2）研究出了一种朱鹮粪便基因组提取的试剂配方和操作程序。结果表明，可应用于PCR性别鉴定的朱鹮粪便基因组提取方法的提取效率为85.11%。这种稳定有效的朱鹮粪便基因组提取试剂与提取方法可以有效解决目前朱鹮性别鉴定的困难，保证朱鹮人工种群在繁殖季节合理配对。

    关键词：朱鹮（Nipponin nippon）;鸟类繁殖;性别鉴定;粪便基因组

    中图分类号：S814.1 ? ? ? ?文献标识码：A ? ? ? ?文章编号：1007-273X（2020）08-0005-03

    朱鹮（Nipponin nippon）是鹳形目（Ciconiifomes）鹮科（Threskiorothidae）的国家Ⅰ级保护野生动物。朱鹮曾遍布亚州东部和北部地区，由于人类过度猎杀和栖息地的丧失，朱鹮种群数量锐减以至被认为在野外灭绝[1]。

    有效的朱鹮性别鉴定方法在朱鹮繁育过程中可避免错配误配的发生。目前朱鹮性别鉴定方法包括以下几种：根据外观和行为来判断，但准确率较低[2];腹腔镜检的准确性相对较高，但操作过程对鸟类伤害较大，易导致不育甚至死亡;类固醇激素法易受到各种因素的影响，个体差异性、样品新鲜度均会导致鉴定结果不准确。此外，染色体核型分析也是常用的一种性别鉴定方法，但朱鹮大小染色体的辨别与数量统计十分复杂，操作过程繁琐，不适用于实践推广[3]。

    近年来兴起的分子生物学方法具有准确性高、灵敏度高的优点。鸟类分子生物学的鉴定位点包括ATP5A1基因、EE0.6序列、染色体螺旋蛋白基因（Chromobox-helicase-DNA binding gene，CHD-1）。鸟类的CHD-1位于性染色体上，高度保守，CHD基因有两个同源拷贝CHD-W和CHD-Z，其中CHD-W为W连锁，CHD-Z为Z连锁，可通过特异性引物对Z染色体和W染色体上的同源特异序列进行PCR扩增[4，5]。有研究表明，CHD-1被应用于多种单态性鸟类的性别鉴定[6，7]。付晶等[8]曾通过特异引物2550F/2718R对CHD-1进行特异性扩增来鉴定鹌鹑（Coturnix coturnix）性别。针对朱鹮性别鉴定的引物2550F/2517R对于CHD-1的扩增效果良好，出现非特异性扩增条带[8]。He等[9]使用引物2550F/2517R进行朱鹮血液基因组的PCR反应并将目的条带进行纯化与回收，根据测序后的序列对2550F/2517R进行优化，设计新引物2467F/2530R，在朱鹮性别鉴定的PCR扩增中避免了非特异性条带的出现。

    前期研究一般将血液样品作为朱鹮性别鉴定的生物学材料来源，但采样过程繁琐，对朱鹮有直接损害，在实践中不宜作为常规方法进行大批量实施和推广。鸟类的遗传学研究需要采取样品，而非损伤取样以及对采样动物干扰小的优势被普遍应用于珍稀鸟类的研究。粪便是无损伤取样中常用的样品采集对象，采样过程中与动物基本无接触，因此动物很少产生应激，适合种群数量小且应激较大的鸟类研究取样[10-12]。目前关于珍稀鸟类粪便基因组提取的方法在雷鸟（Tetrao urogallus urogallus）、大鸨（Otis tarda）中有所提及，但不同鸟类的食性与消化系统有所差异，对其方法通用性产生了制约，而市场上的试剂盒较为昂贵且无针对性。因此，建立一种朱鹮粪便基因组提取并用其进行PCR性别鉴定的方法显得十分迫切。

    1 ?材料与方法

    1.1 ?样品来源

    本研究在陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心采集51份朱鹮粪便样品。使用5 mL粪便采集管采集49份已知性别朱鹮粪便样品（雌鸟25份，雄鸟24份），分别加入3 mL无水乙醇混匀，-20 ℃保存备用;使用2 mL注射器翅下静脉取1份雌性朱鹮血液样品与1份雄性朱鹮血液样品。样品采集详细信息见表1。

    1.2 ?主要试剂

    Quick Taq HS Dye Mix（货号：DTM-101，100次反应） 购自日本东洋纺公司;SDS购自德国Biofroxx公司;蛋白酶K购自索莱宝公司;异硫氰酸胍购自上海源叶生物公司;聚乙烯吡咯烷酮购自上海蓝季生物公司;无水乙醇与碘化钾均购自西陇科学公司;BIOG粪便DNA提取试剂盒（货号51031，50次反应）购自常州百代生物公司;血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（货号DP304-02，50次反应）与通用型DNA纯化回收试剂盒（货号DP214-02，50次反应）均购自天根生化科技公司。

    1.3 ?试验方法

    使用试剂盒提取不同性别朱鹮血液基因组DNA，使用朱鹮性别鉴定特异性引物（2467F：5'-CGTCAGTTTCCCTTTCAG-3';2530R：5'-CCAGTGCTTGTTTCCTCA-3'）进行聚合酶链式反应PCR扩增。PCR扩增反应条件为94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸8 min;30个循环。

    研究使用改良硫氰酸胍-硅珠法提取粪便基因组DNA，确定试剂的组成，优化操作程序。使用试剂盒与改良硫氰酸胍-硅珠法提取朱鹮粪便基因组，进行PCR扩增并对产物进行胶回收纯化测序，对本研究建立的改良硫氰酸胍-硅珠法粪便基因组提取质量与效率进行探究。

    1.4 ?改良硫氰酸胍-硅珠法粪便基因组提取法的建立

    1.4.1 ?改良硫氰酸胍-硅珠法相关试剂配制组分

    （1）SiO2磁珠悬液。取5 g SiO2固体溶于50 mL去離子水，充分混匀后室温静置12 h，弃上清，加入5 mL浓度为8 mol/L的KI溶液，充分混匀后室温静置6 h，4 ℃避光保存。

    （2）裂解液。终浓度为50 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.0）、200 mmol/L的NaCl、200 mmol/L的EDTA （pH 8.0）、200 mmol/L的Proteinase K、1% SDS。

    （3）提取液。终浓度为100 mmol/L的Tris-HCl（pH 6.4）、5 mol/L的GuSCN、200 mmol/L的EDTA （pH 8.0）、1.3%的TritonX-100。

    （4）洗涤液A。终浓度为100 mmol/L的Tris-HCl（pH 6.4）、5 mol/L的GuSCN、200 mmol/L的EDTA （pH 8.0）

    （5）洗涤液B。终浓度为100 mmol/L的Tris-HCl（pH7.5）溶液、1 mmol/L的EDTA（pH 8.0）溶液、5 mol/L的NaCl溶液、55%乙醇。

    1.4.2 ?改良硫氰酸胍-硅珠法提取步骤的设计

    （1）取朱鹮粪便悬液500 μL于2 mL离心管中，12 000 r/m离心2 min弃上清液，加入1 mL PBS振荡重悬沉淀，重复此步骤至上清无色，加入1 mL PBS浸泡1.5 h。

    （2）12 000 r/m离心10 min弃上清液，加入1 mL裂解液，充分振荡混匀后放入37 ℃恒温振动培养箱过夜（12～16 h）。

    （3）12 000 r/m离心10 min，取600 μL上清液转移到新的离心管中，加入800 μL提取液，37 ℃摇动培养10 min。

    （4）将上述溶液700 μL转移到吸附柱中，12 000 r/m离心2 min弃上清液，再将剩余的700 μL溶液转移到吸附柱中，12 000 r/m离心2 min弃上清液。

    （5）向柱中加入200 μL SiO2磁珠悬液室温静置20 min。

    （6）12 000 r/m离心1 min后弃上清液，向吸附柱内加入500 μL的洗涤液A，12 000 r/m离心2 min弃上清液。重复一次。

    （7）向吸附柱内加入500 μL洗涤液B，12 000 r/m离心2 min弃上清液。重复一次。将吸附柱室温开盖放置5 min，彻底晾干洗涤液。

    （8）取出离心柱放入新的1.5 mL離心管，向离心柱吸附膜悬空滴加60 μL去离子水，55 ℃放置5 min，12 000 r/m离心1 min收集DNA溶液。

    （9）将上一步收集的DNA溶液重新滴加到吸附膜，55 ℃放置5 min。12 000 r/m离心2 min，收集DNA溶液。置于-20 ℃冰箱。

    2 ?结果与分析

    2.1 ?朱鹮性别鉴定引物2467F/2530R的验证

    将朱鹮血液总基因组DNA作为模板，2467F/2530R为引物按照上述反应体系与反应程序进行普通PCR扩增，雄性朱鹮出现一条552 bp的条带，雌性朱鹮出现353 bp与552 bp的两条带，与预期结果一致（图1）。

    2.2 ?改良硫氰酸胍-硅珠法与试剂盒法提取粪便基因组进行性别鉴定的效果对比

    将分别使用试剂盒与改良硫氰酸胍-硅珠法进行朱鹮粪便基因组总DNA提取的基因组样本为模板、以雌性血液样本基因组和雄性血液样本基因组作为阳性对照进行普通PCR扩增，结果表明，改良硫氰酸胍-硅珠法与试剂盒法所得到的朱鹮粪便基因组均可以作为朱鹮性别鉴定的DNA模板（图2）。

    2.3 ?改良硫氰酸胍-硅珠法进行朱鹮性别鉴定的效果分析

    采用改良硫氰酸胍-硅珠法从47份粪便样品中提取朱鹮总基因组DNA。共得到40份浓度与纯度处在正常范围内的基因组模板（19份雌性粪便样品，21份雄性粪便样品），普通PCR扩增结果如图3所示，可鉴定其性别。综上，改良硫氰酸胍-硅珠法提取基因组DNA进行朱鹮性别的鉴定效率为85.11%。证明引物2467F/2530R可用于朱鹮性别鉴定，雄性朱鹮出现1条552 bp的条带，雌性朱鹮出现353与552 bp两条带，建立的朱鹮粪便基因组改良硫氰酸胍-硅珠法验证47份朱鹮粪便样品，85.11%可用于PCR扩增的基因组模板。

    3 ?讨论

    人工种群的维持和扩大是朱鹮保护工作中重要的一环。随着分子生物学的快速发展，鸟类性别鉴定的通用引物也已经在朱鹮血液基因组上得到验证并改进。无损伤取样较传统的取样方法对动物应激小，对采样对象几乎无影响，尤其是粪便样品的采集，对动物无接触，优势更加明显，被广泛应用于珍稀野生动物的研究[13，14]。粪便不止作为一种生物资源被人们有效利用，并且作为最安全的无损伤取样材料，是朱鹮进行性别鉴定良好的基因组来源[15]。

    有国外研究者使用硫氰酸胍-硅珠法在大鸨粪便中成功提取出基因组DNA，国内研究者用同样的方法并未成功提取出白头鹤粪便基因组DNA[16]，继而对提取方法加以优化，成功进行了白头鹤的性别鉴定。白头鹤与朱鹮都属涉禽，本研究在预试验使用上述方法均未成功提取出朱鹮基因组，表明不同鸟类之间的粪便基因组提取方法差异很大，需要对硫氰酸胍-硅珠法进行改进，建立起朱鹮特有的粪便基因组提取方法。

    在试验探究的过程中，出现了很多问题，例如DNA浓度非常低甚至无法测出，可能是由于粪便中脱落的肠道上皮细胞数量过少，导致提取量过低。在接下来的试验中加大了粪便量，DNA浓度有所上升，但仍然会有一部分粪便DNA由于浓度过低而无法测出，推测是由于提取液过少引起的提取效率低下所致。将提取液与上清液的比例从2∶3提高至4∶3，结果有所改善，只有极少数会出现没有浓度的情况，但是A260/A230比值小于1。由于本试验的基因组提取方法为硫氰酸胍-硅珠法，极有可能出现胍盐污染，将洗涤液中的乙醇体积分数从55%升高至75%，重复一次样品洗涤步骤，基本上都得到了较理想的结果。

    对于改良硫氰酸胍-硅珠法无法提取基因组的样品，后续使用试剂盒再次进行该粪便基因组的提取，也未提取出可用于性别鉴定的基因组DNA。这说明样品的采集与保存可能存在問题，因此针对样品的保存方法还值得进一步探究。常见的粪便保存方法主要有无水乙醇保存法、70%乙醇保存法、-80 ℃冷冻法、烘干法、冷冻干燥法和硅胶干燥法等。不少研究者对上述粪便保存方法进行了效果比较分析，得出的结论也不尽相同[17，18]。笔者结合相关报道，推测不同种类的动物有食性和消化系统的区别，粪便保存的方法可能也因物种而异[13-18]。本研究采用了无水乙醇保存法，未对不同粪便样品保存方法进行分析比较，或许有更优于无水乙醇的样品保存方法等待着进一步研究与验证。

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    收稿日期：2020-06-10

    基金项目：国家自然科学基金面上项目（31771301）;陕西省自然科学基础研究计划面上项目（2019JM-038）

    作者简介：张漫慧（1995-），女，安徽阜阳人，在读博士研究生，研究方向为动物生殖，（电子信箱）862314341@qq.com。