贝类血细胞分类及其功能研究进展

    吴刚 张志江 黄亚冬 王冬浩 李永仁 梁健

    血细胞是贝类细胞免疫的承担者，直接参与异物的吞噬、包囊、免疫黏附、伤口修复等过程[1]，同时能够合成和释放多种水解酶、抗菌肽、细胞因子类似物、调理素、凝集素等免疫因子，是体液免疫的供给者[2]。

    关于贝类血细胞的研究开始于1934年，兴盛在上世纪70年代中期，主要研究血细胞的形态、结构、功能，了解贝类的防御机制，以便抵御当时寄生虫和病菌泛滥引起的大量死亡情况[3]。随着研究的深入，学者们所用方法不同导致血细胞的分类命名存在巨大的差异，目前为止，贝类的血细胞分类都没有形成一个统一的标准。本文通过引用国内外相关文献，对目前研究贝类血细胞分类的几种技术方法做出阐述，列举出一些常见经济贝类血细胞的种类名称，并简单介绍其形态、结构及功能，为以后贝类非特异性免疫防御相关研究提供基础。

    1 贝类血细胞分类研究技术

    早期的贝类血细胞分类研究主要是通过光学或电子显微镜的直接观察，根据血细胞内部细胞器的形态、颗粒物质的有无以及细胞外部的形态结构、运动方式、血细胞发生等来进行分类。随着组织化学染色方法的成熟和发展，由于血细胞内不同物质对染色剂的亲和性不同而呈现颜色上的差异，为血细胞分类提供了新的研究方法。近些年来，流式细胞术、单克隆抗体及密度梯度离心等新型技术的应用为贝类血细胞的分类提供更多选择。

    1.1 显微镜观察技术

    显微镜观察技术分为普通光学显微镜观察和电子显微镜观察。其中，电子显微镜观察又分为透射电镜观察和扫描电镜观察。与光学显微镜相比，电子显微镜是以电子束作为照明源对样品进行透射或反射，在通过电磁透镜的多级放大后成像于荧光屏上。

    透射电镜具有高分辨率、高放大倍数、成像立体丰富等优点，但由于其成像原理也存在样品制备具有破坏性、电子束直接轰击样品表面、需真空环境及采样率低等缺点。透射电镜观察贝类血细胞这种细胞密度低、易凝集、形态结构多样的悬浮游离细胞时，常规的样品制备条件就不太适合。刘静等[4]从取样方法、琼脂包埋方式和锇酸固定时间等方面找到了适合菲律宾蛤仔血细胞透射电镜的样品制备方法，指出用固定液润洗过的注射器收取血淋巴液能有效防止凝集显现产生，同时采用离心式的琼脂包埋方法能最大限度地减少血细胞的丢失，并且锇酸固定2 h得到的样品制备效果最佳。

    扫描电镜分辨率高、观察景深大，可直接观察样品的表面结构，图像富有立体感、真实感，除了能显示一半样品表面的形貌外，还能将样品微区范围内的化学元素与光、电、磁等性质的差异以二维图像形式显示出来，并可用照相方式拍摄图像[5]。

    总之，透射电镜常用于观察普通显微镜不能分辨的细微结构，扫描电镜则主要用于观察物体表面的形貌特征。有时两者配合可以得到较为全面的分析结果。

    1.2 组织化学染色技术

    组织化学染色技术是利用一些特殊的染色物质可与细胞的某种成分发生反应而特异性附着颜色的原理，对这种成分进行定性和定位分析的技术[3]。此方法可以通过选择不同的染色剂几乎可以区分细胞内各种成分，如：AB-PAS染色法可以显示糖类；汞溴酚蓝染色法可以显示蛋白质；苏丹黑B染色法可以显示脂肪类；Feulgen染色法显示DNA等等。

    1.3 流式细胞技术

    流式细胞术是一种对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点，已经成为近代科学研究中的热门[6]。流式细胞仪是以流式细胞术为核心技术，将经过荧光染色的待测细胞制成单细胞悬液，在鞘液的包被下单行排列，以激光束作为激发光源垂直照射单行流动的细胞，对它的散射光和携带的荧光进行探测，从而完成细胞分析和分选。

    1.4 单克隆抗体技术

    单克隆抗体技术是依据抗原抗体具有特异性结合的特点，具有特异性的抗体与血细胞膜上抗原决定部位结合而反映出血細胞的不同类别及其免疫功能[7]。

    1.5 密度梯度离心技术

    密度梯度离心一般是纯化病毒的一种常用方法[8-9]。原理是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度介质的某些特定位置中而形成不同区带的分离方法[10]。优点是分离出来的细胞或病毒仍有很好的活性，广泛用于组织病理学研究中，近几年在贝类血细胞的分类和功能领域得到应用。以往主要采用氯化铯、蔗糖和多聚蔗糖作为梯度介质进行离心，但由于这几种介质的黏度高时渗透压也会处于较高水平，会对部分分离的目标病毒或细胞产生毒性，因此这种介质纯化出来的病毒或细胞需要进行透析或稀释才能应用于后续研究。张辉等[10]人使用高亲水性、高密度、低黏度的碘克沙醇作为介质进行梯度离心取得良好效果。

    2 贝类血细胞分类

    不同学者使用的研究技术手段以及研究对象不同，导致对贝类血细胞的分类命名存在一定差异（见表1）。

    显微镜观察法主要是根据血细胞的形态进行分类，如陈全震等[11]通过透射电镜观察皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）血细胞的超微结构，将其分为5种类型，分别为：大颗粒细胞、小颗粒细胞、特殊颗粒细胞、透明细胞和淋巴样细胞。并根据细胞核的形态和细胞质中的细胞器结构特征判断，大、小颗粒细胞是同一类细胞的不同发育阶段，是由特殊颗粒细胞发育而来的。透明细胞和淋巴细胞则是两类分化完全的细胞；Nakayama等[12]使用光镜和电镜将红番砗磲（Tridacna crocea）的血细胞分为3类，分别为：细胞内含有直径大约0.6μm颗粒的嗜酸性粒细胞，包含有低电子密度和少量高电子密度颗粒并拥有光滑表面的无颗粒细胞，以及细胞内填充大量直径约3μm高电子密度颗粒的类桑葚型细胞；Sahaphong 等[13]应用光镜和电镜观察耳鲍（Haliotis asinine）血细胞后认为可分为颗粒细胞和透明细胞两类；王江勇等[14]根据细胞大小、颗粒组成特征等将杂色鲍（Haliotis diversicolor）血细胞分为颗粒细胞和无颗粒细胞。

    由于细胞在发生过程中存在许多中间类型，僅依靠形态学进行分类具有一定的局限性，而化学染色技术的应用便能很好解决这些问题。韩卓然等[15]通过瑞氏染色法将毛蚶（Scapharca subcrenata）血细胞分为：大透明细胞（12.97±1.22μm）、颗粒细胞（9.98±1.85μm）、小透明细胞（7.60±1.17μm），其中大透明细胞质染色较淡，胞质内侧具有少量颗粒，胞质外侧为不规则的透明区域，而细胞核区域存在少量嗜碱性蓝紫色颗粒和嗜酸性红色颗粒。颗粒细胞胞质染色深，具有大量大小不一的蓝紫色嗜碱性颗粒。小透明细胞胞质染色较浅，内部无颗粒或很少；李俊辉等[16]使用同样方法将文蛤（Meretrix meretrix）的血细胞分为大颗粒细胞、小颗粒细胞、透明细胞和淋巴细胞。张剑诚等[17]将皱纹盘鲍血细胞分为颗粒细胞和透明细胞两大类。

    这些年来，采用流式细胞仪对贝类血细胞进行分类研究成为了国外学者普遍认可的方式[18-19]，这种方式分析血细胞的数量达到每秒钟几百个，并且还能在同一时间对血细胞的大小和颗粒性进行分析，避免了血细胞分类的主观性。潘辉等[20]通过流式细胞术认为西施舌（Coelomactra antiquata）、波纹巴非蛤（Paphia undulata）、双线紫蛤（Sanguinolaria diphos）的血细胞均可分为透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞3个亚群。使用相同方法冼健安等[21]把杂色鲍血细胞也分为上述3个亚群。

    密度梯度离心主要应用于对病毒的纯化处理，在贝类血细胞分离中的应用还不是很常见，属于较为新颖的技术方法。在对牡蛎血细胞分类研究中，Xue 等[22]就通过该方法将食用牡蛎（Ostrea edulis）血细胞分为3个亚群，分别为颗粒细胞、大透明细胞和小透明细胞。

    3 贝类血细胞功能

    贝类血细胞的功能包括吞噬、包囊、免疫黏附、伤口修复等，是贝类细胞免疫的主要承担者[23]。

    吞噬作用是贝类血细胞的最主要功能，包括外来物质的识别、黏附、摄入、降解、破坏、清除5个基本过程[24]，王文琪等[25]发现菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）具有吞噬作用的血细胞包括透明细胞、小颗粒细胞、大颗粒细胞；孙虎山[26]、邢婧[27]等均发现，颗粒细胞拥有最强的吞噬能力，吞噬作用的主要承担者是具有颗粒内含物的细胞；Cheng等[28]指出透明细胞有一定的吞噬能力，但不是主要的，其吞噬能力较弱或不具有吞噬能力。

    对于大体积的异物，单个血细胞无法吞噬时，血细胞形态特化成扁平状，细胞边缘相互接合，将异物层层包裹起来，形成包囊[29]。对于血细胞的包囊作用在昆虫和哺乳动物的研究较多，在水产动物中报道比较少，对贝类的研究就少之更少了。王文琪等[25]发现菲律宾蛤仔血细胞在人为刺激下可发生包囊作用，包囊的中心一般由发生了聚合或脱颗粒现象的大颗粒细胞组成，而外层是由发生了纤维化而彼此连接的小颗粒细胞和无颗粒细胞组成。

    大量研究证实哺乳动物血细胞中的红细胞表面存在众多免疫相关分子，如CR1（Complement receptor 1）、CR3（Complement receptor 3）、CD58、CD59、IL-8受体、SOD酶等，具有识别、黏附抗原、清除免疫复合物、促进吞噬细胞吞噬、增强NK细胞活性等多种免疫功能[30]。软体动物虽然低等，但有些种类的贝类是具有红细胞的，如毛蚶、魁蚶等蚶类，周丽青[31]就发现魁蚶（Scapharca broughtonii）的红细胞就具有免疫黏附功能。

    由于贝类没有血小板、特定的凝固因子等，故其伤口修复过程区别于高等动物。Suzuki[32]等指出珍珠牡蛎的无颗粒细胞会在伤口处增多以清除组织碎片，无颗粒细胞还会特化成细胞鞘，阻止血液流失的同时分泌胞外基质作为上皮细胞再生的模板；石安静等[33]在三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）珍珠囊形成初期观察到无颗粒细胞形成的多层细胞鞘，并进一步形成珍珠囊上皮。

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