肉鸡和藏鸡肺动脉平滑肌中ＣａＳＲ的表达

    李善政 郭锐 陈永旭 鲍钰莹 王佳杰 常振宇

    

    

    

    摘要：肉鸡肺动脉高压是以肺动脉压血管重构为特征的一种疾病，众多研究揭示肺血管重构是其中心环节之一。细胞内钙离子（[Ca2+]）浓度的升高是诱发并导致血管重构的重要机制，钙敏感受体（CaSR）在肺动脉平滑肌细胞内钙离子稳态失调及低氧性肺血管收缩和肺血管重构中起着重要的作用。应用免疫组化和Western blot方法研究了缺氧条件下CaSR在AA肉鸡和藏雞肺动脉平滑肌组织中的表达情况，为肉鸡腹水综合征（PAH）的肺动脉重构提供新的证据。结果表明，肉鸡组有肺水肿发生，藏鸡组无肺水肿发生，缺氧条件下饲养的肉鸡肺动脉平滑肌CaSR表达明显高于藏鸡组（P<0.05）。通过探讨CaSR在AA肉鸡和藏鸡肺动脉平滑肌组织中的表达情况，从新的角度阐明了肉鸡腹水综合征发生的分子机制。

    关键词：肉鸡;藏鸡;肺动脉平滑肌;钙敏感受体（CaSR）

    中图分类号：S858.31? ? ? ? 文献标识码：A? ? ? ? 文章编号：1007-273X（2020）04-0005-03

    肉鸡肺动脉高压（PAH） 综合征，也称肉鸡腹水综合征，是家禽发生的以一种缺氧、不愿运动、腹部膨大和肺动脉压力升高及右心衰竭为特点的疾病或综合征。目前公认发病机制为缺氧—血管重构—PAH—右心衰竭—右心容量负荷增加直至腹水死亡[1，2]。王建琳等[3]证实血管重构及PAH的形成是其发病的中心环节。肉鸡PAH综合征形成过程中具有血管重构这一特征，即血管壁厚度、管腔直径的比值增加，血管内径、外径减小，而血管壁的横截面积不变[4，5]。有证据表明钙敏感受体（CaSR）介导了肺血管收缩和重构以及肉鸡腹水综合征发生的分子机制[6]。

    钙敏感受体（Calcium-sensing receptor，CaSR）是G蛋白耦联受体的C家族成员。1993年，Brown等首次由牛甲状旁腺克隆出CaSR。CaSR主要由胞内羧基尾部、氨基胞外域以及7个跨膜螺旋的跨膜域所组成[7]。CaSR主要分布在骨组织、血管、胃肠道、参与钙稳态调节的甲状旁腺及肾组织等。其功能主要是维持钙离子和其他金属离子的稳定状态，并且能够调节细胞增殖分化，控制离子通道的开启和激素分泌等[8]。本研究通过比较肉鸡和藏鸡在高原缺氧条件下肺水肿发生率、CaSR表达差异两个方面来阐述腹水综合征发生的分子机制。

    1? 材料与方法

    1.1? 实验动物分组

    7 日龄健康白羽肉仔鸡50只购于宜昌某正大孵化厂（由飞机运往林芝）;7日龄健康藏仔鸡50只购于拉萨某商业孵化厂。白羽肉仔鸡和藏鸡在西藏农牧学院畜牧场按常规饲养条件进行饲养。

    1.2? 主要仪器与试剂

    高速冷冻离心机（3K15，Sigma）;RM-2245型莱卡组织切片机;Olympus光学显微镜;CaSR抗体;TBS浓缩缓冲液、中性树胶、水杨酸甲酯、二甲苯、福尔马林、PVDF 膜、显影定影试剂、转移缓冲液、电泳缓冲液。

    1.3? 免疫组化检测CaSR

    肉鸡和藏鸡肺动脉平滑肌组织经包埋切片后，3%H2O2溶液避光室温条件下作用30 min，修复缓冲液进行抗原修复，3%TBST封闭，分别滴加兔抗鼠CaSR 抗体（1∶100，一抗）、山羊抗兔 HRP-IgG（二抗），孵育，按说明书进行二氨基联苯胺法显色操作，苏木素染液复染2 min、梯度乙醇脱水、透明和封片（用PBS缓冲液替代一抗作阴性对照），用Olympus光学显微镜进行观察并拍照。

    1.4? Western blot检测CaSR蛋白的表达

    将肉鸡和藏鸡肺动脉平滑肌组织裂解，匀浆并提取肺动脉平滑肌总蛋白，用BCA试剂盒测定其蛋白浓度和含量。SDS-PAGE、考马斯亮兰染色确定各样品总蛋白含量，将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h。加兔抗鼠CaSR抗体（1∶500，一抗），4 ℃孵育过夜，室温下TBST脱色摇床上洗3次，每次5 min;山羊抗兔HRP-IgG（二抗）用TBST稀释3 000 倍，室温下孵育30 min，用TBST在室温下脱色、摇床上洗3次，每次5 min。内参是GAPDH（1∶10 000），显色后凝胶成像系统拍摄。应用光密度法测定目标蛋白丰度。使用SPSS 17.0软件对所得灰度值进行分析，并用Graph pad prism 5.0软件作图。

    2? 结果与分析

    2.1? 肉鸡和藏鸡肺水肿发病情况

    由图1可知，在高原缺氧环境下，从第2天起，肉鸡开始出现肺水肿，并呈现增高的趋势，截至第15天，共有11只肉鸡出现肺水肿情况，其发病率为22%。藏鸡从饲养开始到结束无肺水肿发生，发病率为0。

    2.2? CaSR免疫组化结果

    免疫组化结果（图2）表明，与肉鸡组（图2A）肺动脉平滑肌组织比较，藏鸡组肺动脉平滑肌组织有弱阳性表达，颜色较浅（图2B）。阴性对照组（不加一抗）则无阳性反应显色（图2C）。

    2.3? Western blot 检测CaSR蛋白的表达

    免疫印迹结果（图3）表明，与肉鸡组比较，藏鸡组肺动脉平滑肌组织CaSR蛋白水平显著降低（P<0.05）。

    3? 讨论

    肉鸡肺动脉高压是以肺动脉压血管重构为特征的一组疾病，且众多研究揭示肺血管重构是其中心环节之一。研究证实，CaSR在肺血管重构和低氧性肺血管收缩以及维持肺动脉平滑肌细胞内钙离子稳定状态均发挥着至关重要的作用[9]。Tfelt-Hansen等[10]发现CaSR 在新生大鼠心室肌细胞有功能性表达。试验表明，CaSR在血管重构的内皮细胞和平滑肌也有功能性表达。有研究发现，钙离子超载主要是由于CaSR激活G蛋白-PLC-IP3途径，从而导致细胞内钙离子增多;在慢性缺氧期间由瞬时受体电位基因编码的钙库操纵的阳离子通道和受体操纵的阳离子通道在肺动脉平滑肌中上调，从而认为这可能是导致肉鸡腹水综合征发生的新途径[11]。Molostvov等[12]、Li等[13]发现大鼠肺动脉平滑肌缺氧时有CaSR 的功能表达，并可调节血管内皮细胞增殖和血管紧张度。Ziegelstein等[14]在培养的人主动脉内皮细胞（Human aortic endothelial cell）时运用蛋白质印迹法（Western blot）和荧光免疫法证明了CaSR的存在，通过RT-PCR方法获得了CaSR的预期产物。Ohanian等[15]证实，大鼠皮下动脉存在CaSR的功能表达，后者参与肌张力调节，进而参与外周血管阻力的调节。研究表明，CaSR激动剂可导致细胞内钙离子增加，主动脉内皮细胞转染特异性靶向CaSR的siRNA、NO及细胞内钙离子浓度产生均会缺失或减少，但是细胞内钙离子浓度的增高为诱发血管重构的重要机制之一，在缺氧条件下其增高机制尚未了解。王关嵩等[16]认为慢性缺氧时细胞内静息钙离子浓度显著增加，这可能与缺氧诱导的膜静息电位变化有关，从而引起电压门控钙离子通道活性的改变、钙通道开放和钙离子内流。膜静息电位在细胞内钙离子浓度的调节中发挥着至关重要的作用，如果细胞内钙离子浓度增高，则可以导致细胞增殖、收缩和基因表达等变化。

    對于低氧性肺动脉高压导致的肉鸡腹水综合征发病机制，肺血管重构、收缩被普遍认为是导致肉鸡腹水综合征发病的病理学和生理学基础[17]。试验结果表明，CaSR可调节细胞增殖、分化、离子通道开启等，缺氧激活血管CaSR表达增加，CaSR表达增加是血管重构的启始阶段，因而是肺动脉高压形成和血管平滑肌增殖的上游调控因子。尽管肉鸡肺动脉高压综合征的发病原因各不相同，动物机体的器官形态功能和体内生化指标改变多样，但都具有呼吸困难和肺动脉高压的临床特征和血管重构等病理学特征，由此我们有理由假设其发病机制：肉鸡快速增长—心肺发育滞后—心肺功能不全—缺氧—激活血管CaSR表达—启动血管重构—血管壁增厚—进一步缺氧—右心衰竭—腹水形成，Julian等[18]在1987年首次提出此假说。CaSR介导了血管重构并促进PAH的形成，亦证实低氧条件下培养可诱导细胞增殖反应，研究表明低氧是导致肺血管重构和PAH发生的重要原因。本假说如果成立，研究CaSR在PAH肉鸡血管重构中的作用将具有重要意义[19]。

    4? 结论

    本研究首次证明了藏鸡和肉鸡肺动脉平滑肌组织中有CaSR的表达。通过本试验确定并掌握了CaSR在白羽肉鸡和藏鸡肺动脉平滑肌组织中的表达情况，为阐明肉鸡腹水综合征的肺动脉重构提供了新的科学证据。免疫组化和Western blot结果表明，肉鸡肺动脉平滑肌CaSR表达明显高于藏鸡组，我们前期进行了肉鸡常氧条件下饲养试验[20]，与本试验中缺氧条件下肉鸡CaSR表达进行比较，发现缺氧条件下肉鸡CaSR表达量明显高于常氧条件下CaSR表达量。本试验通过研究缺氧条件下肉鸡和藏鸡CaSR表达差异，进而发现CaSR表达与鸡的品种有关。

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