高效液相色谱—串联质谱法测定淡水、沉积物中的阿莫西林

    时文博　李春青　陈永平　高丽娜　李连庆

    摘 要：建立了高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定淡水、沉积物中阿莫西林含量的检测方法。方法采用外标法进行定量。淡水样品通过固相萃取柱富集后洗脱，沉积物样品通过乙腈直接提取，以0.2%甲酸/5 mmol/L醋酸铵-乙腈为流动相梯度洗脱，通过C18色谱柱进行分离。方法的线性范围为0.05～10 μg/L，相关系数r>0.999。淡水中阿莫西林的平均回收率为77.9%～84.8%，RSD为2.5%～5.9%。沉积物中阿莫西林的平均回收率为76.5%～82.7%，RSD为1.2%～2.7%。方法步骤简单，灵敏度高，可以用于环境淡水及沉积物中阿莫西林的含量测定。

    关键词：淡水；沉积物；LC-MS/MS；阿莫西林

    阿莫西林（Amoxicillin）是一种最常用的青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，在医学和养殖业中被广泛使用[1]。近年来，抗生素滥用导致的环境污染现象日益严重，各地从河流到饮用水均有抗生素残留检出。环境中的抗生素污染对水产品质量安全产生了直接的影响[2]，环境中的抗生素还会导致细菌产生耐药性，从而威胁人们的健康[3]。阿莫西林作为我国使用量最大的抗生素之一，污染风险也较高。因此，对自然环境中阿莫西林的含量进行监测十分必要。目前，环境中阿莫西林的检测还缺乏相关的方法，文献报道的主要是动物组织、牛奶等的阿莫西林检测[4-5]，淡水及沉积物中阿莫西林的检测方法还未见报道。本文分别建立了淡水、沉积物中阿莫西林的提取方法，采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，该方法具有稳定性好、灵敏度高的特点，可以为阿莫西林的环境监测工作提供技术保障。

    1 实验部分

    1.1 试剂与材料

    AB SCIEX QTRAP5500三重四级杆质谱仪；岛津LC-30A高效液相色谱仪；Milli-Q Advantage A10超纯水系统；固相萃取装置；固相萃取小柱Waters Oasis HLB（3 cc/60 mg）；阿莫西林标准物质；甲醇（CH3OH）（色谱纯）；乙腈（C2H3N）（色谱纯）；甲酸（CH2O2）（色谱纯）；醋酸铵（C2H7NO2）（色谱纯）；磷酸二氢钠（NaH2PO4）（分析纯）。

    1.2 仪器条件

    1.2.1 色谱条件

    色谱柱：岛津Shim-pack XR-ODS（2.0 mm×75 mm ）；柱温：30 ℃；流动相：A：乙腈，B：5 mmol/L 醋酸铵（含0.2%甲酸）。

    1.2.2 质谱条件

    离子化模式：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子模式；检测方式：多反应监测（MRM）；喷雾电压：5 500 V；离子源温度：550 ℃；气帘气：25 psi；雾化气：50 psi；辅助加热气：50 psi；定性及定量离子、去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）见表2。

    1.3 样品前处理

    淡水样品：将所采集的淡水样品通过0.45 μm玻璃纤维滤膜进行过滤，收集过滤液并调节其pH为4.0后置于4 ℃冰箱避光保存。固相萃取柱活化：依次使用3 mL甲醇、3 mL纯水淋洗固相萃取柱对其进行活化。准确量取100 mL淡水样品导入固相萃取柱，对固相萃取装置真空度进行调节，使流速控制不超过5 mL/min，待样品流尽后加入3 mL纯水进行淋洗，纯水流尽后加入6 mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液于25 mL玻璃离心管中，移至氮吹仪氮气吹至近干。加入1 mL 5%乙腈溶液溶解残渣，混匀。过0.22 μm滤膜，移至进样瓶中准备进样。

    沉积物样品：将所采集的湿沉积物样品放置在通风处风干，避免阳光直射。风干后将沉积物样品粉碎，研磨成粉末状后放入密封广口瓶内，置于4 ℃冰箱避光保存。准确称取5.0 g沉积物粉末于50 mL塑料离心管内，向离心管内加入8 mL乙腈，涡旋混匀2 min，超声提取10 min，放入離心机10 000 r/min离心3 min，取上清液于25 mL玻璃离心管内。再向50 mL塑料离心管内加入8 mL乙腈，重复上述操作，合并上清液。将25 mL玻璃离心管置于氮吹仪上氮气吹至近干，加入1 mL 5%乙腈溶液溶解残渣，混匀。过0.22 μm滤膜，移至进样瓶中准备进样。

    阿莫西林受热易导致分解，因此在氮气吹干过程应中避免温度过高。建议将水浴温度调节至40 ℃以下。

    2 结果与讨论

    2.1 色谱参数的确定

    实验选择了甲醇和乙腈分别作为流动相有机相进行了对比实验，实验结果发现甲醇作为有机相时色谱图的基线噪音相较于乙腈偏高，同时色谱峰也有一定的拖尾情况，乙腈作为有机相峰形较好。

    实验还比较了0.1%、0.2%、0.3%的甲酸以及纯水作为水相对阿莫西林色谱峰的影响。结果发现随着甲酸浓度的提高，阿莫西林离子丰度增加、峰形变差；经过总体比较发现，甲酸浓度为02%时，阿莫西林的离子峰形与丰度的综合效果最佳。根据查询文献得知[6]，在流动相中加入一定量醋酸铵可以改善色谱峰的峰形，同时避免拖尾。因此，实验最终选择乙腈作为有机相，以0.2%甲酸以及5 mmol/L 醋酸铵的混合溶液作为水相流动相。采用优化后的色谱条件和质谱条件，阿莫西林标准溶液色谱图见图1。

    2.2 淡水中阿莫西林提取条件的优化

    自然界中阿莫西林含量可能比较低，为了提高检测灵敏度，因此提取过程中需要对样品进行富集浓缩。本实验选择的方式是通过固相萃取柱对水中的待测物质进行富集，经过对固相萃取柱的比较研究，选用的固相萃取柱为Waters公司的Oasis HLB（3 cc/60 mg），实验中水样最终的富集倍数为100倍。

    前处理过程中，为了达到最佳富集效果，使水中阿莫西林的回收率达到最高，本实验还进一步优化了相关条件，研究了pH对阿莫西林回收率的影响。本实验对在pH 为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0六种条件下阿莫西林的回收率进行了对比试验。取待测水样100 mL，使用硫酸溶液和氢氧化钠溶液分别调节水样pH为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，加入10 μg/mL阿莫西林标准使用液100 μL，加标浓度为10 ng/mL，过HLB小柱后洗脱进行测定，测定结果见表3。

    结果发现，在pH为4.0的条件下，阿莫西林的回收率最高。因此实验对保存的水样pH进行了调节，调节pH为4.0。

    2.3 沉积物中阿莫西林提取剂的选择

    目前常用的阿莫西林提取剂主要有乙腈、磷酸二氢钠溶液、乙腈水溶液。实验对比了乙腈、0028 mol/L磷酸二氢钠溶液、1∶1的乙腈水溶液三种提取剂的提取效果。称取5.0g空白沉积物粉末，加入100 μL 100 ng/mL的阿莫西林标准使用液，进行提取测定。测定结果发现，0.028 mol/L磷酸二氢钠溶液与1∶1的乙腈水溶液由于无法直接氮气吹干，需要通过HLB小柱进行萃取，造成了一定的损失，导致回收率较低。三种试剂乙腈作为提取剂时回收率最高，优于磷酸二氢钠溶液及乙腈水溶液，因此选取乙腈作为沉积物中阿莫西林的提取剂。

    2.4 方法的标准曲线及灵敏度

    使用外标法定量，配制阿莫西林系列标准溶液，使用1.2中的色谱条件及质谱条件。以阿莫西林的色谱峰峰面积为纵坐标， 阿莫西林的质量浓度（ μg/L）为横坐标绘制标准工作曲线，结果显示标准工作曲线线性方程为Y=1.29×105X-5.71×103，如图2所示。结果显示阿莫西林在质量浓度0.05～10 μg/L 范围内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数r>0.999。在方法规定的取样体积和定容体积下，以信噪比S/N=10确定其定量下限（LOQ）分别为0.66 ng/L和0.013 μg/kg。

    2.5 方法的回收率与精密度

    采用加标回收的方式对方法进行验证，在空白淡水样品中分别按5.0、10.0、20.0 ng/L 3个浓度进行填加，在空白沉积物样品中分别按照10、2.0、5.0 μg/kg 3个浓度进行填加，每个浓度填加3個平行样品，按照1.3中的方法进行前处理后上机测定，测定结果及算得的回收率及相对标准偏差分别见表4、表5。

    上述结果可见，3个浓度填加的淡水样品中的阿莫西林的平均回收率为77.9%～84.8%，相对标准偏差（RSD）的范围为2.5%～5.9%。3个浓度填加的沉积物样品中的阿莫西林的平均回收率为76.5%～82.7%，相对标准偏差（RSD）的范围为1.2%～2.7%。

    3 结论

    本文通过优化淡水、沉积物的提取条件，色谱质谱仪器条件，建立了自然环境中淡水水体及沉积物中阿莫西林含量的测定方法。结果表明，本方法中阿莫西林的质量浓度在0.05～10 μg/L范围内与峰面积呈线性关系，淡水和沉积物中的定量限分别为0.66 ng/L 和0.013 μg/kg。淡水和沉积物中的空白加标回收率均大于75%，同时RSD均小于10%，说明该方法的准确度和精密度良好，具有较高的可靠性，可以用于淡水、沉积物中阿莫西林含量的测定，为开展监测阿莫西林的药残工作提供了技术支撑。

    参考文献：

    [1]

    谢恺舟，陈学森，徐东，等.高效液相色谱荧光检测法检测鸡蛋中阿莫西林残留[J].食品科学， 2012，33 （22） ：264-268

    [2] 王萍亚，周勇，陈皑，等.高效液相色谱荧光检测法同时测定水产品中4种四环素族药物残留的研究[J].计量学报，2008，29（4A）：238-241

    [3] 张致一，刘军，董杰，等.天津市市售贝类水产品中副溶血性弧菌污染和耐药状况的调查[J].中国卫生检验杂志，2015，14（7） ：2413-2415

    [4] 秦峰，郑文捷，陈桂良，等.高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中6种青霉素类药物的残留量[J].中国抗生素杂志，2009，34（6）：348-351

    [5] 孙雷，张骊，汪霞，等.超高效液相色谱-串联质谱法对动物源性食品中13种β-内酰胺类药物残留的检测[J].分析测试学报，2009，28（5）：576-580

    [6] 孙汉文，李挥，张敬轩，等.快速高分离液相色谱-串联质谱法检测原乳中活性β-内酰胺酶[J].分析化学，2010，38（8）：1203-1205

    （收稿日期：2017-06-14；修回日期：2017-07-19）