高效液相色谱—串联质谱法测定淡水、沉积物中的阿莫西林

    时文博 李春青 陈永平 高丽娜 李连庆

    摘 要:建立了高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定淡水、沉积物中阿莫西林含量的检测方法。方法采用外标法进行定量。淡水样品通过固相萃取柱富集后洗脱,沉积物样品通过乙腈直接提取,以0.2%甲酸/5 mmol/L醋酸铵-乙腈为流动相梯度洗脱,通过C18色谱柱进行分离。方法的线性范围为0.05~10 μg/L,相关系数r>0.999。淡水中阿莫西林的平均回收率为77.9%~84.8%,RSD为2.5%~5.9%。沉积物中阿莫西林的平均回收率为76.5%~82.7%,RSD为1.2%~2.7%。方法步骤简单,灵敏度高,可以用于环境淡水及沉积物中阿莫西林的含量测定。

    关键词:淡水;沉积物;LC-MS/MS;阿莫西林

    阿莫西林(Amoxicillin)是一种最常用的青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素,在医学和养殖业中被广泛使用[1]。近年来,抗生素滥用导致的环境污染现象日益严重,各地从河流到饮用水均有抗生素残留检出。环境中的抗生素污染对水产品质量安全产生了直接的影响[2],环境中的抗生素还会导致细菌产生耐药性,从而威胁人们的健康[3]。阿莫西林作为我国使用量最大的抗生素之一,污染风险也较高。因此,对自然环境中阿莫西林的含量进行监测十分必要。目前,环境中阿莫西林的检测还缺乏相关的方法,文献报道的主要是动物组织、牛奶等的阿莫西林检测[4-5],淡水及沉积物中阿莫西林的检测方法还未见报道。本文分别建立了淡水、沉积物中阿莫西林的提取方法,采用高效液相色谱-串联质谱进行检测,该方法具有稳定性好、灵敏度高的特点,可以为阿莫西林的环境监测工作提供技术保障。

    1 实验部分

    1.1 试剂与材料

    AB SCIEX QTRAP5500三重四级杆质谱仪;岛津LC-30A高效液相色谱仪;Milli-Q Advantage A10超纯水系统;固相萃取装置;固相萃取小柱Waters Oasis HLB(3 cc/60 mg);阿莫西林标准物质;甲醇(CH3OH)(色谱纯);乙腈(C2H3N)(色谱纯);甲酸(CH2O2)(色谱纯);醋酸铵(C2H7NO2)(色谱纯);磷酸二氢钠(NaH2PO4)(分析纯)。

    1.2 仪器条件

    1.2.1 色谱条件

    色谱柱:岛津Shim-pack XR-ODS(2.0 mm×75 mm );柱温:30 ℃;流动相:A:乙腈,B:5 mmol/L 醋酸铵(含0.2%甲酸)。

    1.2.2 质谱条件

    离子化模式:电喷雾离子源(ESI);扫描模式:正离子模式;检测方式:多反应监测(MRM);喷雾电压:5 500 V;离子源温度:550 ℃;气帘气:25 psi;雾化气:50 psi;辅助加热气:50 psi;定性及定量离子、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)见表2。

    1.3 样品前处理

    淡水样品:将所采集的淡水样品通过0.45 μm玻璃纤维滤膜进行过滤,收集过滤液并调节其pH为4.0后置于4 ℃冰箱避光保存。固相萃取柱活化:依次使用3 mL甲醇、3 mL纯水淋洗固相萃取柱对其进行活化。准确量取100 mL淡水样品导入固相萃取柱,对固相萃取装置真空度进行调节,使流速控制不超过5 mL/min,待样品流尽后加入3 mL纯水进行淋洗,纯水流尽后加入6 mL甲醇进行洗脱,收集洗脱液于25 mL玻璃离心管中,移至氮吹仪氮气吹至近干。加入1 mL 5%乙腈溶液溶解残渣,混匀。过0.22 μm滤膜,移至进样瓶中准备进样。

    沉积物样品:将所采集的湿沉积物样品放置在通风处风干,避免阳光直射。风干后将沉积物样品粉碎,研磨成粉末状后放入密封广口瓶内,置于4 ℃冰箱避光保存。准确称取5.0 g沉积物粉末于50 mL塑料离心管内,向离心管内加入8 mL乙腈,涡旋混匀2 min,超声提取10 min,放入離心机10 000 r/min离心3 min,取上清液于25 mL玻璃离心管内。再向50 mL塑料离心管内加入8 mL乙腈,重复上述操作,合并上清液。将25 mL玻璃离心管置于氮吹仪上氮气吹至近干,加入1 mL 5%乙腈溶液溶解残渣,混匀。过0.22 μm滤膜,移至进样瓶中准备进样。

    阿莫西林受热易导致分解,因此在氮气吹干过程应中避免温度过高。建议将水浴温度调节至40 ℃以下。

    2 结果与讨论

    2.1 色谱参数的确定

    实验选择了甲醇和乙腈分别作为流动相有机相进行了对比实验,实验结果发现甲醇作为有机相时色谱图的基线噪音相较于乙腈偏高,同时色谱峰也有一定的拖尾情况,乙腈作为有机相峰形较好。

    实验还比较了0.1%、0.2%、0.3%的甲酸以及纯水作为水相对阿莫西林色谱峰的影响。结果发现随着甲酸浓度的提高,阿莫西林离子丰度增加、峰形变差;经过总体比较发现,甲酸浓度为02%时,阿莫西林的离子峰形与丰度的综合效果最佳。根据查询文献得知[6],在流动相中加入一定量醋酸铵可以改善色谱峰的峰形,同时避免拖尾。因此,实验最终选择乙腈作为有机相,以0.2%甲酸以及5 mmol/L 醋酸铵的混合溶液作为水相流动相。采用优化后的色谱条件和质谱条件,阿莫西林标准溶液色谱图见图1。

    2.2 淡水中阿莫西林提取条件的优化

    自然界中阿莫西林含量可能比较低,为了提高检测灵敏度,因此提取过程中需要对样品进行富集浓缩。本实验选择的方式是通过固相萃取柱对水中的待测物质进行富集,经过对固相萃取柱的比较研究,选用的固相萃取柱为Waters公司的Oasis HLB(3 cc/60 mg),实验中水样最终的富集倍数为100倍。

    前处理过程中,为了达到最佳富集效果,使水中阿莫西林的回收率达到最高,本实验还进一步优化了相关条件,研究了pH对阿莫西林回收率的影响。本实验对在pH 为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0六种条件下阿莫西林的回收率进行了对比试验。取待测水样100 mL,使用硫酸溶液和氢氧化钠溶液分别调节水样pH为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,加入10 μg/mL阿莫西林标准使用液100 μL,加标浓度为10 ng/mL,过HLB小柱后洗脱进行测定,测定结果见表3。

    结果发现,在pH为4.0的条件下,阿莫西林的回收率最高。因此实验对保存的水样pH进行了调节,调节pH为4.0。

    2.3 沉积物中阿莫西林提取剂的选择

    目前常用的阿莫西林提取剂主要有乙腈、磷酸二氢钠溶液、乙腈水溶液。实验对比了乙腈、0028 mol/L磷酸二氢钠溶液、1∶1的乙腈水溶液三种提取剂的提取效果。称取5.0g空白沉积物粉末,加入100 μL 100 ng/mL的阿莫西林标准使用液,进行提取测定。测定结果发现,0.028 mol/L磷酸二氢钠溶液与1∶1的乙腈水溶液由于无法直接氮气吹干,需要通过HLB小柱进行萃取,造成了一定的损失,导致回收率较低。三种试剂乙腈作为提取剂时回收率最高,优于磷酸二氢钠溶液及乙腈水溶液,因此选取乙腈作为沉积物中阿莫西林的提取剂。

    2.4 方法的标准曲线及灵敏度

    使用外标法定量,配制阿莫西林系列标准溶液,使用1.2中的色谱条件及质谱条件。以阿莫西林的色谱峰峰面积为纵坐标, 阿莫西林的质量浓度( μg/L)为横坐标绘制标准工作曲线,结果显示标准工作曲线线性方程为Y=1.29×105X-5.71×103,如图2所示。结果显示阿莫西林在质量浓度0.05~10 μg/L 范围内与峰面积呈良好的线性关系,相关系数r>0.999。在方法规定的取样体积和定容体积下,以信噪比S/N=10确定其定量下限(LOQ)分别为0.66 ng/L和0.013 μg/kg。

    2.5 方法的回收率与精密度

    采用加标回收的方式对方法进行验证,在空白淡水样品中分别按5.0、10.0、20.0 ng/L 3个浓度进行填加,在空白沉积物样品中分别按照10、2.0、5.0 μg/kg 3个浓度进行填加,每个浓度填加3個平行样品,按照1.3中的方法进行前处理后上机测定,测定结果及算得的回收率及相对标准偏差分别见表4、表5。

    上述结果可见,3个浓度填加的淡水样品中的阿莫西林的平均回收率为77.9%~84.8%,相对标准偏差(RSD)的范围为2.5%~5.9%。3个浓度填加的沉积物样品中的阿莫西林的平均回收率为76.5%~82.7%,相对标准偏差(RSD)的范围为1.2%~2.7%。

    3 结论

    本文通过优化淡水、沉积物的提取条件,色谱质谱仪器条件,建立了自然环境中淡水水体及沉积物中阿莫西林含量的测定方法。结果表明,本方法中阿莫西林的质量浓度在0.05~10 μg/L范围内与峰面积呈线性关系,淡水和沉积物中的定量限分别为0.66 ng/L 和0.013 μg/kg。淡水和沉积物中的空白加标回收率均大于75%,同时RSD均小于10%,说明该方法的准确度和精密度良好,具有较高的可靠性,可以用于淡水、沉积物中阿莫西林含量的测定,为开展监测阿莫西林的药残工作提供了技术支撑。

    参考文献:

    [1]

    谢恺舟,陈学森,徐东,等.高效液相色谱荧光检测法检测鸡蛋中阿莫西林残留[J].食品科学, 2012,33 (22) :264-268

    [2] 王萍亚,周勇,陈皑,等.高效液相色谱荧光检测法同时测定水产品中4种四环素族药物残留的研究[J].计量学报,2008,29(4A):238-241

    [3] 张致一,刘军,董杰,等.天津市市售贝类水产品中副溶血性弧菌污染和耐药状况的调查[J].中国卫生检验杂志,2015,14(7) :2413-2415

    [4] 秦峰,郑文捷,陈桂良,等.高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中6种青霉素类药物的残留量[J].中国抗生素杂志,2009,34(6):348-351

    [5] 孙雷,张骊,汪霞,等.超高效液相色谱-串联质谱法对动物源性食品中13种β-内酰胺类药物残留的检测[J].分析测试学报,2009,28(5):576-580

    [6] 孙汉文,李挥,张敬轩,等.快速高分离液相色谱-串联质谱法检测原乳中活性β-内酰胺酶[J].分析化学,2010,38(8):1203-1205

    (收稿日期:2017-06-14;修回日期:2017-07-19)

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