广西黄颡鱼源嗜水气单胞菌及其致病性、耐药性调查
刘杰+刘良敏+黄英龙+吕忠坚+蒙兰丽+黄钧
摘 要：以常规方法分离细菌，API 20NE进行细菌鉴定，人工感染检测细菌的致病性，K-B纸片扩散法进行耐药性试验，对梧州市等3个不同养殖区域黄颡鱼源嗜水气单胞菌及其致病性、耐药性进行调查。结果显示，从广西梧州等3个市/县网箱养殖的患病黄颡鱼（Pseudobagrus fulvidrico）分离到17株嗜水气单胞菌，总检出率41.46%，永福县的检出率最高（76.92%），桂平市次之（26.67%），梧州市最低（23.08%）。除YF13无致病力外，其余16株菌株对健康黄颡鱼的平均致死率70.00%～100%。抑菌效果最好的药物有环丙沙星、左氟沙星和盐酸沙拉沙星3种，抑菌效果最差的是青霉素G和氨苄青霉素。高度敏感的药物梧州市有9种，永福县10种，桂平市12种；不敏感药物梧州市6种，永福县3种，桂平市2种。对3个养殖区域黄颡鱼源嗜水气单胞菌都高度敏感的药物有头孢他啶等8种，都不敏感的是青霉素G和氨苄青霉素2种。
关键词：黄颡鱼（Pseudobagrus fulvidrico）；嗜水气单胞菌；致病性；耐药性
黄颡鱼（Pseudobagrus fulvidrico）的营养价值高，硒含量丰富，是防癌、抗衰老的优良食品[1]，是我国出口创汇的优良水产品，也是广西重要的名特优淡水养殖品种之一。在广西，黄颡鱼的养殖主要集中在南宁市、柳州市、桂林市、梧州市和桂平市等市、县，但近年来广西养殖黄颡鱼细菌性病害日渐增多，已知的有类志贺邻单胞菌引起的类志贺邻单胞菌病[2]，嗜水气单胞菌引起的腹水病[3]和暴发性流行病[4-5]等，还有嗜水气单胞菌和温和气单胞菌引起的体表溃疡病[6]。据多年来对水产养殖动物病害监测发现，广西养殖黄颡鱼细菌性疾病在生产实践中很常见，一旦发病，通常会造成严重的经济损失，已检测到的病原菌主要有嗜水气单胞菌、温和气单胞菌等。笔者主要对广西的梧州市、永福县和桂平市3个不同养殖区域黄颡鱼源嗜水气单胞菌及其致病性、耐药性进行调查，旨在了解黄颡鱼源嗜水气单胞菌在广西黄颡鱼主养区的分布和该菌在不同养殖区域的致病力和对药物的耐药特性，为各地对该菌引起的黄颡鱼疾病的防控提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2013～2015年间，分别于广西梧州市、桂平市和永福县，采集网箱养殖中患病病症明显的黄颡鱼，病鱼个体重在35.3～103.4 g之间。健康黄颡鱼购自南宁市某个体养殖户，平均体重（32.26±4.01）g普通营养琼脂培养基、兔血琼脂培养基购于北京陆桥责任有限公司，API20NE试剂条及附加试剂、麦氏比浊管购于法国生物梅里埃公司，革兰氏染液、药敏纸片购自杭州天和微生物技术有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 细菌的分离 病样带回实验室后，先按常规进行剖检，观察记录其临床症状，然后从其肝脏、心脏、脾脏、脑等组织取样，分别接种到购自广东环凯微生物科技有限公司的普通营养琼脂培养基和兔血营养琼脂培养基上，36 ℃培养24 h后取优势菌落经纯化后以甘油液保存于-80 ℃冰箱中备用。
1.2.2 细菌的鉴定 菌落和菌体的形态观察 在普通培养基和兔血培养基上培养24 h后，直接观察菌落形态、颜色及溶血性等，革兰氏染色后观察细菌的染色特性、菌体形态并测定菌体大小。
API生化鉴定 生化鉴定所用的API半自动细菌鉴定系统及麦氏比浊管、生化试剂条、氧化酶等相关附属试剂，均购自法国-梅里埃公司。
细菌鉴定时，先在分离菌株的单个菌落上滴加氧化酶试剂后，1 min内快速变色为氧化酶反应阳性，不变色为氧化酶反应阴性。本调查仅对氧化酶反应阳性的分离菌株，按API产品说明书选用API 20NE试剂条进行鉴定和结果判读。
1.2.3 人工感染试验 健康黄颡鱼购回后先进行20 d的检疫暂养，人工感染前抽样剖检和进行细菌分离试验，确认无寄生虫和细菌感染。
无菌滤液的人工感染 无菌条件下取病样的肝、心、脾、肾剪碎，按重量加入5倍的无菌PBS液后匀浆，8 000 r/min离心15 min，取上清液并加入双抗，置4 ℃冰箱2 h后以0.22 μm细菌滤膜过滤得无菌滤液。取少量无菌滤液涂布于普通营养琼脂培养基上，36 ℃培养24 h观察有无菌落生成。将健康黄颡鱼分成试验组和对照组（每组10尾），采取腹腔注射的方法，试验组注射无菌滤液0.3 mL/尾，对照组注射等量的PBS液，注射后按组进行常规的饲养管理，每天观察记录各组受试鱼的摄食、游动和死亡情况，连续观察15 d。试验组若出现死亡，即取其肝、心、脾、肾等组织制成无菌滤液再进行1次无菌滤液的人工感染。
分离菌株的致病性试验 用无菌PBS液洗下分离菌株的新鲜培养菌落，制成相当于MCF3管浓度的菌悬液，再以活菌计数的方法确定菌悬液的细菌浓度。与无菌滤液的人工感染一样，将健康黄颡鱼分组（每组20尾）后，以腹腔注射的方法，試验组注射0.3 mL/尾的菌悬液，对照组注射等量的无菌PBS液。注射后按组进行常规的饲养管理，每天观察记录各组受试鱼的摄食、游动和死亡情况，连续观察15 d。试验组若出现死亡，取濒死个体再进行细菌分离和人工感染试验。
1.2.4 菌株的耐药表谱检测 试验用的药敏纸片中，除氟苯尼考（30 μg）、磺胺-6-甲氧嘧啶（25 μg）、磺胺二甲嘧啶（25 μg）和盐酸沙拉沙星（5 μg）4种为广西水生动物病害诊断实验室自行制备外，其余的青霉素G（10 μg）、氨苄青霉素（10 μg）、头孢他啶（30 μg）、头孢拉定（30 μg）、庆大霉素（10 μg）、复方磺胺甲恶唑SMZ/TMP（23.75/1.25 μg）、新霉素（30 μg）、新生霉素（30 μg）、恩诺沙星（30 μg）、环丙沙星（5 μg）、左氟沙星（5 μg）、依诺沙星（30 μg）、氧氟沙星（5 μg）、头孢哌酮钠（75 μg）和哌拉西林钠他唑巴坦钠（哌拉西林/他唑巴坦：100/10 μg）15种均购自杭州天和微生物试剂有限公司。
试验采用常规的K-B纸片扩散法进行。
2 结果
2.1 细菌的分离鉴定结果
2013年～2015年，共从广西梧州市、永福县和桂平市网箱养殖中采集了27批次黄颡鱼病样，分离到41株优势菌株，氧化酶试验均为阳性，经API 20NE生化鉴定，嗜水气单胞菌17株，占分离菌株数的41.46%，其他菌株分别为温和气单胞菌15株（占36.59%），肺炎克雷伯菌肺炎亚种3株（占7.32%），弗氏柠檬酸杆菌4株（占9.76%），不可识别2株（占4.88%）。梧州市、永福县和桂平市分离到的嗜水气单胞菌菌株数分别占分离菌株数的23.08%、76.92%和26.67%（表1）。
17株嗜水气单胞菌在普通营养琼脂培养基上生长良好，菌落圆形且略隆起，菌落表面湿润、边缘整齐、半透明、乳白色，菌落直径约1.00～1.98 mm。菌体为革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆，长约0.85 μm，排列形式为单个或者成对。经兔血培养基的培养结果，除YF13菌株无溶血性外，其余菌株均呈β溶血。17株嗜水气单胞菌的API 20NE生化鉴定结果见表2。
在表2中，17株嗜水气单胞菌的API阳性代码值除YF30菌株为5577754、GP32菌株为7777754外，其余菌株均为7577754。
2.2 人工感染结果
2.2.1 无菌滤液人工感染结果 无菌滤液经36 ℃、24 h的涂布培养无细菌生长。人工感染无菌滤液后经15 d的连续观察，试验组与对照组的黄颡鱼均未出现病症和死亡现象，表明所采集的发病样本因病毒引起的可能性不大。
2.2.2 17株嗜水气单胞菌的人工感染结果 17株嗜水气单胞菌对健康黄颡鱼的人工感染结果见表3。
从表3可见，2次人工感染试验结果，除了YF13无致病力外，其余16株菌株对健康黄颡鱼均有很强的致病力，人工感染的平均致病率70.00%～100%，并能复制出体表、下颌、鳍条、鳍基发红，腹腔内充满血色腹水，肠道和胃发红，部分病鱼肛门红肿等与自然发病相似的症状，试验期间对照组无症状和死亡现象，表明分离到的17株嗜水气单胞菌中，除YF13菌株外，其余16株均是引起黄颡发病死亡的病原菌。
2.3 不同养殖区域嗜水气单胞菌的耐药性比较
17株嗜水气单胞菌的药敏试验结果见表4。
根据表4，19种试验药物对17株黄颡鱼源嗜水气单胞菌抑菌效果最好的是环丙沙星、左氟沙星和盐酸沙拉沙星3种，高度敏感率均为94.12%，其余依次为氟苯尼考（88.24%），恩诺沙星、氧氟沙星和哌拉西林钠他唑巴坦钠（均为82.35%），头孢他啶和头孢哌酮钠（均为76.47%），磺胺二甲嘧啶（58.82%），依诺沙星（47.06%），头孢拉定和庆大霉素（均为35.29%），新霉素（29.41%），复方磺胺甲恶唑和磺胺-6-甲氧嘧啶（均为11.76%），新生霉素（5.88%），青霉素G和氨苄青霉素（均为0.00%）；抑菌效果最差的是青霉素G和氨苄青霉素，不敏感率均为100%，其次为头孢拉定（58.82%），其余依次为，新生霉素（41.18%），磺胺-6-甲氧嘧啶（29.41%），复方磺胺甲恶唑（17.65%），氟苯尼考（5.88%），头孢他啶、庆大霉素、新霉素、恩诺沙星、环丙沙星、左氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、头孢哌酮钠、哌拉西林钠他唑巴坦钠、磺胺二甲嘧啶和盐酸沙拉沙星均为0.00%。
将表4结果进行统计后，得到不同养殖区域嗜水气单胞菌的耐药性结果（表5）。
说明：1.表中数字为抑菌圈直径（单位：mm）；2.药敏片直径5.6 mm；3.抑菌圈直径d>20 mm判为高度敏感，10 mm 将高敏率达到和超过60%药物定义为敏感药物，将不敏感率达到和超过60%药物定义为不敏感药物。根据表5，对3个养殖区域黄颡鱼源嗜水气单胞菌敏感的药物梧州市有9种，永福县10种，桂平市有12种；不敏感药物梧州市6种，永福县3种，桂平市2种。对3个养殖区域黄颡鱼源嗜水气单胞菌都敏感的药物有头孢他啶、环丙沙星、左氟沙星、氧氟沙星、头孢哌酮钠、哌拉西林钠他唑巴坦钠、氟苯尼考和盐酸沙拉沙星8种，都不敏感的药物只有青霉素G和氨苄青霉素2种。 3 讨论 嗜水气单胞菌是鱼类等多种淡水养殖动物细菌性疾病的病原菌，携带有hly、Aer、Alt、Act、ahal、ahp 等多种毒力基因[8]，可引起水产养殖动物的暴发性死亡，是目前广西淡水养殖中常见且危害性大的病原菌之一。本调查从广西梧州市、永福县和桂平市网箱养殖的27批次黄颡鱼病样中分离到的41株菌株中有17株为嗜水气单胞菌，占分离菌株数的41.46%，其次為温和气单胞菌15株，占36.59，表明广西梧州市、永福县和桂平市网箱养殖黄颡鱼细菌性疾病的主要病原菌为嗜水气单胞菌和温和气单胞菌。在检出的17株为嗜水气单胞菌中，永福县的检出率最高，为76.92%，桂平市次之（26.67%），梧州市最低，为23.08%。可见嗜水气单胞菌是永福县网箱养殖黄颡鱼主要的病原菌，但是什么原因导致黄颡鱼源嗜水气单胞菌在各养殖区域之间的不均匀分布，尚待从养殖环境、养殖技术、饲料等诸多因素作进一步的综合研究。 在本试验中，除来自永福县无溶血性的1株嗜水气单胞菌YF13对健康黄颡鱼无致病力外，其余菌株都有很强的致病力，人工感染试验的平均致死率70.00%～100%。可能与该菌株所携带的毒力基因型有关。根据刘杰等的研究结果，黄沙鳖源嗜水气单胞菌的致病力与其所携带的毒力基因型密切相关，该菌对黄沙鳖的致病力是多个毒力基因共同作用的结果，只携带Alt和ahal 2种毒力基因的菌株对黄沙鳖和小鼠均无致病力，凡携带有溶血素基因hly的嗜水气单胞菌均为有毒株[8]。
药敏试验结果显示，不同养殖区域的黄颡鱼源嗜水气单胞菌对药物的敏感也存在差异，对黄颡鱼源嗜水气单胞菌敏感的药物种类和数量在梧州市、永福县和桂平市3个养殖区域也不尽相同。产生这一差异的原因可能与不同养殖区域的用药习惯不同有关。已知病原菌长期接触某种药物后会对该药物产生很强的耐药性[9-10]，因此，在生产实践中对嗜水气单胞菌等细菌引起的水产动物疾病进行防治时，应避免长时间选择用同一种药物，以免病原菌对该药物产生耐药性。值得关注的是，环丙沙星在水产養殖中属于违禁药物，而在实际生产过程中，偶有发现少数养殖者在养殖鱼类出现全身性发红或暴发性死亡时仍将环丙沙星作为首选药物，这些养殖者的使用理由是“此药效果好”。本试验将环丙沙星列入药敏试验药物，主要是想印证“此药效果好”的说法。从药敏试验结果可以看出，环丙沙星对嗜水气单菌确实有很好的杀菌效果，但毕竟这是水产违禁药物，所以建议广大养殖从业者在对水产养殖动物进行疾病防治时自觉遵守国家的相关法规，为了食品安全，不使用违禁药物。政府的相关部门加强对乱用、滥用药物行为的监管和处罚力度。
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