超高效液相色谱—同位素稀释串联质谱法测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留

    杨惠宇+张惠峰

    摘 要：建立了采用Oasia PRiME HLB固相萃取柱净化-超高效液相色谱-同位素稀释串联质谱法（UPLC-MS/MS）快速测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留的方法。样品加入同位素内标，超声衍生化后用乙酸乙酯超声提取，经Oasia PRiME HLB固相萃取柱一次性净化后上机检测，电喷雾-正离子多反应监测模式，内标法定量。该方法将测试时间缩短至4小时。结果显示，4种硝基呋喃类代谢物的检测限为0.01 μg/kg，定量限为0.03 μg/kg，在0.05～10 ng/mL质量浓度范围内线性良好，4种硝基呋喃类代谢物相关系数r均大于0.999，5个添加浓度水平的平均回收率为88.5%～115.2%，相对标准偏差均小于8，说明该方法快速、准确并且重复性好。

    关键词：硝基呋喃类代谢物；高效液相色谱-串联质谱；水产品；超声衍生化

    近年来，药物残留已成为影响中国水产品质量安全的重要因素，而硝基呋喃类药物因其价格便宜、抗菌效果好等特点，被广泛应用于水产养殖中[1-2]，同样也是检出率最高的违禁药物之一[3-4]，因此，为确保水产品质量安全和渔业经济的可持续发展，建立准确可靠、灵敏度高的硝基呋喃类药物及其代谢物的定量定性方法具有深远意义。由于硝基呋喃类药物在动物体内可迅速代谢，通过测定母体化合物的含量是不合适的，因此在水产品质量监测中主要检测硝基呋喃类代谢物[5]。目前国内外文献报道测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的检测方法除质谱分析法还有免疫分析法、光谱分析等[6-7]。硝基呋喃类代谢物一般经衍生化后，采用液液萃取、固相萃取、凝胶渗透色谱、免疫亲和色谱、超临界流体萃取、分子印迹、平行蒸发等方法提取净化后，用液相色谱法或质谱联用法进行检测[8-10]。此外，还有一些新兴的方法应用于水产品中硝基呋喃类代谢物的检测，如原子吸收法[11]、流动注射-化学发光分析技术（FI-CL）[12]、液相色谱电化学检测器（LC-ECD）[13]，太赫兹时域光谱（THz-TDS）[14]等，但是使用最为普遍的是液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法[15-18]。笔者首次在样品前处理过程中采用超声衍生化结合Oasia PRiME HLB固相萃取净化的方法，并利用超高效液相色谱-同位素稀释串联质谱法同时快速测定水产品中4种硝基呋喃类代谢物残留量。检测过程仅需4 h，为水产品中硝基呋喃代谢物的检测提供快速、准确的方法。

    1 材料与方法

    1.1 仪器设备

    超高效液相色谱-串联质谱Xevo TQS（UPLC-MS/MS）：美国WATERS公司；BSD-250型震荡培养箱：上海博讯实业有限公司；TDL-40B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；TTL-DCI型氮吹仪：北京同泰联科技发展有限公司；TE212-L电子天平：德国Sartorius公司；Research plus移液器：德国Eppendorf公司； KQ-800KDE型高功率数控超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司；漩涡振荡器：德国IKA公司，Oasia PRiME HLB固相萃取柱，（WATERS公司）；实验用水均为超纯水。

    1.2 试剂

    甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸乙酯（色谱纯）、甲酸、乙酸铵、正己烷：Fisher Chemicals公司；盐酸：北京化工厂；2-硝基苯甲醛（2-NBA 衍生化试剂）：ACROS公司；磷酸氢二钾和二甲亚砜均为国产分析純试剂。

    1.3 标准溶液的配制

    呋喃唑酮代谢物 3-氨基-2-恶唑烷酮（3-amino-2-oxazolidone AOZ，纯度99.3±0.3%，Dr Ehrenstorfer公司）、呋喃西林代谢物氨基脲（semicarbazide SEM，纯度99.5%）、呋喃妥因代谢物1-氨基-2-内酰脲（1-aminohydantoin AHD，纯度99.3%）和呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-2-唑烷基酮（5-morpholinomethy-3-amino-2-oxazolidone AMOZ，99.6%）。氘、碳-13氮-15标记的硝基呋喃类代谢物同位素标准物质（AOZ-D4、SEM-HCl-13C-15N2、AHD-13C3、AMOZ-D5，纯度分别为98.7±0.3%、98.5±0.5%、98.7±0.3%、99.5±0.3%），购自WITEGA公司。

    硝基呋喃类代谢物标准品用甲醇配成浓度为1 mg/mL的标准储备液，保存期为180 d，硝基呋喃类代谢物同位素标准品用甲醇配制成浓度为100 μg/mL的同位素混合标准储备液，保存期180 d。使用时用纯水将标准品和同位素混合内标储备液逐级稀释成浓度为10 ng/mL和 100 ng/mL的工作溶液。保存条件：呋喃西林代谢物、呋喃妥因代谢物为常温保存，其它几种标准物质均为4 ℃条件下保存。

    1.4 方法

    1.4.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm 1.7 μm）；柱温：35 ℃；流动相：A为2 mmol/L乙酸铵水溶液，B为甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；梯度洗脱程序如表1。

    1.4.2 质谱条件 ESI正离子化模式；仪器型号：Waters Xevo TQS；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测（MRM）；锥孔电压：40 V； 毛细管电压：0.9 kV； 脱溶剂气温度：500 ℃

    1.4.3 样品前处理方法 水产品取可食部分，经匀浆制肉糜。称取约2 g样品（精确到0.001 g）于50 mL离心管中，加入50 μL同位素混合内标工作液（100 ng/mL），涡旋震荡30 s，再加入5 mL 水、1 mL盐酸溶液（4 mol/L）和300 μL的二硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），涡旋震荡30 s，置于超声清洗仪中超声2 h（温度控制在35～60 ℃之间）。取出样品，冷却至室温，加入磷酸氢二钾溶液调pH值至7.4（±0.2），加入4 mL乙酸乙酯漩涡震荡60 s，4 000 r/min离心5 min，重复提取一次，合并上清液直接过Prime HLB固相萃取小柱，收集滤液至10 mL离心管中，40 ℃下水浴氮气吹干，准确加入1 mL甲醇溶液（20%），漩涡震荡混合2 min，过0.22 μm滤膜，待上机检测。

    2 结果与分析

    2.1 色谱条件的选择

    本方法选择了ACQUITY UPLC BEH C18柱，该色谱柱在保证良好分离效果的基础上，缩短了一半的分离时间。比较了以乙腈-水和甲醇-水溶液作为流动相，对于硝基呋喃类代谢物的色谱分离效果，结果发现，甲醇-水作为流动相更有利于目标物的分离，能够得到更好的线性关系，并能获得较低的检出限，提高了分析的灵敏度。

    2.2 质谱条件的优化

    参考相关标准和文献选定硝基呋喃类代谢物相应的定量、定性子离子，并结合仪器的实际情况，分别对锥孔电压、碰撞能量和选择离子等进行充分的优化，优化条件如表2。

    2.3 前处理方法的选择

    水解和衍生化条件：按照上述方法在35～60 ℃水浴中超声，结果表明水浴温度对测定结果没有显著影响，衍生时间为120 min时可使实际样品中与蛋白结合的硝基呋喃类代谢物水解较充分，并使衍生化反应顺利进行。

    水产品样品中含有大量磷脂、脂肪等亲脂性杂质，干扰了目标化合物的分析，同时降低色谱柱的使用寿命，易污染质谱，并严重影响检测结果的重现性。本方法采用乙酸乙酯提取液直接通过Oasia PRiME HLB固相萃取柱，将干扰物质吸附于固相萃取柱中。该SPE柱对磷脂、脂肪等亲脂性杂质净化效果较好，并且对目标化合物无吸附作用。经净化后的样品氮吹干后直接定容，不需正己烷去脂、离心等操作。相较一般的固相萃取省去了溶剂转换过程，缩短了检测时间。

    2.4 仪器线性范围和检出限、定量限的测定

    在系列标准溶液中加入50 μL同位素混合内标，按上述实验步骤操作，以硝基呋喃代谢物浓度为横坐标，以各特征离子质量色谱峰面积与相应内标的峰面积比为总坐标，绘制标准曲线。线性回归方程和相关系数如表3。结果表明线性范围为0.05～10 μg/kg，且相关系数均达到0.99以上。以3倍信噪比计算方法的检出限，以10倍信噪比确定方法的定量限，经确证得出结果见表3。计算信噪比相对标准偏差（RSD）分别为AOZ 2.38%、AMOZ 3.06%、SCA 2.83%、AHD 2.89%，均在允许范围内。

    2.5 方法的精密度和回收率

    取不含硝基呋喃类药物的样品，准确称取2.00 g，分别做4种硝基呋喃类代谢物的5个添加水平，浓度从0.025～2 μg/kg，每个做3份平行，按照样品的操作过程进行提取、净化和测定，每个添加水平在相同条件下做6个平行样品，用标准曲线校准样品，计算每个样品的浓度，计算加标回收率、相对标准偏差（RSD）如表4：

    2.6 样品分析

    按照本文方法对2017年农业部考核样品进行检测，回收率在70%～120%之间，检测结果合格，说明该方法能够达到检测水产品中硝基呋喃类代谢物的要求。

    3 结论

    本工作建立了水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测方法，该方法与传统方法比较，操作简单快速，有效缩短了检测时间，灵敏度高、稳定性好，结果重现性好，可广泛用于大批量水产品中硝基呋喃类代谢物的高效快速检测。

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