扇贝多肽的作用及其机制

    魏婷婷+侯玉+宗雅丽+马敬芝+杨俊丽+崔龙波

    摘 要：综述扇贝多肽（PCF）在抑制紫外线诱导的细胞凋亡、增强机体免疫功能以及作为抗氧化剂保护细胞等方面的作用，简述其对细胞增殖周期的影响，并探讨PCF发挥这些作用的生物学机制。

    关键词：扇贝多肽；细胞凋亡；免疫；抗氧化

    扇贝多肽（polypeptide from Chlamys fareri，PCF）是利用现代海洋生物工程技术从栉孔扇贝中提取的水溶性小分子多肽，氨基酸序列为 Pro-Asn-Thr-Hyl-Ser-Cys-Arg-Gly。与传统人工合成的抗氧化剂和大分子化合物相比，它具有相对分子质量小（Mr=879）、水溶性强和致敏性低的特点[1]。作为一种新兴海洋活性物质，PCF引起了众多科研工作者的注意，根据他们的研究结果，本文从抑制细胞凋亡、增强机体免疫功能、抗氧化等方面对扇贝多肽的作用及其作用机制进行了综述，以期为相关药物以及化妆品等的研发提供理论基础，使PCF得到进一步开发利用。

    1 PCF可抑制紫外线诱导的细胞凋亡

    紫外线（UVB）对细胞结构损伤明显，诱导出现细胞凋亡现象。已有研究表明经UVB辐射的小鼠其表皮变薄，成纤维细胞数量减少，表皮细胞和成纤维细胞中均有空泡形成，真皮的成纤维细胞内可见囊泡状扩张的内质网，高尔基体等细胞器减少，线粒体膜受损、嵴断裂，有的可见细胞核固缩，通过彗星电泳可检测有DNA链的断裂[2]。但经过UVB和PCF共同处理后，表皮的厚度和成纤维细胞的数量均有所增加，超微结构显示细胞结构明显改善，粗面内质网丰富，DNA链断裂程度减轻[3]。由此可推断， PCF能够在一定程度上抑制紫外线诱导的损伤和细胞凋亡。

    PCF通过影响细胞凋亡通路抑制细胞凋亡，目前探索到PCF所影响的信号通路如下。

    1.1 死亡受体通路（Fas-FADD-caspase-8通路）

    在死亡受体起始的细胞凋亡信号通路中，死亡受体（Fas）的交联使得接头分子（FADD）通过死亡结构域的相互作用被募集到死亡受体的胞内区，caspase-8（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8）通过死亡效应结构域的相互作用结合到FADD上，二聚化的caspase-8通过自身切割而被活化，活化的caspase-8又可以去裂解并活化效应caspase，从而导致细胞凋亡。李丙华等[4]的研究表明，UVB照射引起Fas和FADD的表达增加及caspase-8的活化，引发细胞凋亡，而PCF可通过抑制 Fas和FADD的表达及caspase-8的活化从而抑制紫外线诱导的HaCaT（人永生化表皮）细胞凋亡。

    1.2 线粒体内源性凋亡通路

    1.2.1 Bax / Bcl-2通路 Bcl-2（B淋巴细胞瘤-2基因）家族蛋白主要通过调节线粒体外膜的通透性来调控细胞凋亡，Bax和Bak是Bcl-2家族中的多结构域蛋白，它们能导致线粒体外膜通透化。与此同时，Bax和Bak的活化及其功能会被Bcl-2家族的抗凋亡成员（如Bcl-2等）所抑制，从而抑制外膜通透化及细胞凋亡。因此，Bax/Bcl-2的比值对细胞至关重要，它决定着细胞受到刺激后是发生凋亡还是幸存。实验[5]表明，PCF可通过增强Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达来抑制UVB辐射诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡。

    1.2.2 Smac-XIAP-caspase-3通路 凋亡蛋白抑制剂（IAPs）家族是近年来新发现的一类抑制细胞凋亡的蛋白，X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）是其中的一种caspases抑制剂[6]。当细胞受到凋亡信号刺激后，促凋亡蛋白分子（Smac）从线粒体释放进入细胞质，与caspases竞争结合X连锁凋亡抑制因子的重复序列，从而使caspases恢复活性，引发细胞凋亡。张兰兰等[6]研究发现，PCF可呈剂量依赖性地抑制Smac从线粒体释放到细胞质，上调 XIAP mRNA的表达，抑制相关caspase的活化，从而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡。

    1.3 活性氧（ROS）相关通路

    1.3.1 ROS-JNK-caspase-3通路 紫外线辐射能导致ROS-JNK-caspase-3级连反应的发生，从而引起细胞凋亡。PCF可降低细胞内ROS的含量[7]，提高抗氧化酶的活性，抑制JNK（c-Jun氨基末端激酶）的磷酸化，进而使其下游caspase-3的活化被抑制，从而抑制紫外线辐射诱导的细胞凋亡。

    1.3.2 ROS-细胞色素C通路 在UVB诱导的HeLa细胞凋亡中，ROS的生成可引起线粒体膜电位的丢失，线粒体内膜上的渗透性通透孔通道开放，从而引起细胞色素 C的释放，传递凋亡信号。若预先加入不同剂量的PCF可剂量依赖性降低ROS的水平，进而减少线粒体细胞色素C的释放，从而抑制细胞凋亡[8]。

    1.3.3 ASK1-JNK通路 ROS诱导细胞凋亡的一个机制是通过激活ASK1（凋亡信号调节激酶1），从而引起JNK蛋白活化，使线粒体功能发生改变进而引起caspase活化而诱导细胞凋亡的。ASK1是對氧敏感的MAP-KKK，既可激活MKK3/MKK6-p38，又能激活SEK1-JNK途径，从而诱导细胞凋亡[7]。陈海英等[9]发现，PCF能降低因UVB辐射造成的ROS含量的升高，引起ASK1的降解，升高线粒体膜电位，抑制ASK1-JNK凋亡通路的活化，从而抑制细胞凋亡。

    1.4 MAPKs通路

    细胞外调节激酶——丝裂原活化蛋白激酶（APKs）家族包括ERKs、JNK和p38[10]。ERKs是一种胞浆内广泛分布的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，与细胞增殖和分化有关[11]，其所介导的通路的活化具有抗细胞凋亡的作用。在 MAPKs通路中，紫外线可催化激活JNKs和p38，它们是引起细胞凋亡的信号，从而导致细胞凋亡。而PCF可通过抑制JNKs和P38激酶水平、提高ERKs活性以及降低caspase-3的活化，从而抑制紫外线诱导的细胞凋亡[10]。

    1.5 p38MAPK-HSP27通路

    热休克蛋白27（heat-shock protein，HSP27）为细胞受损时产生的高度保守蛋白，是p38 MAPK （p38 mitogen activated protein kinases）的一个下游底物，在细胞应激反应中具有重要作用，可被p38 MAPK信号途径磷酸化，进而参与细胞的凋亡。石少婷等[12]研究表明，PCF可通过剂量依赖性抑制p38 MAPK的磷酸化活化而阻断HSP27的磷酸化及其细胞内移位，从而抑制紫外线引起的细胞凋亡。

    1.6 aSMase-JNK信号通路

    酸性鞘磷脂酶（aSMase）通常主要分布于溶酶体、内体和细胞膜的小窝，活化后即与膜融合，使其内容物释放到细胞外表面。UVA可诱导细胞表面aSMase的表达增多[1]，aSMase可进一步引起JNK的活化，PCF对细胞的保护作用是通过抑制aSMase的表达从而抑制JNK的活化而实现的。

    1.7 EGFR-ATK-CyclinD1-CDK-4通路

    紫外线照射后，表皮生长因子受体（EGFR）所在的信号通路被激活，EGFR表达迅速增多，EGFR基因序列较之正常组缺失了TAT序列，而插入了CTCTC序列；预先加入PCF孵育后，虽然仍保留部分CTCTC，但TAT序列被修复，故PCF在基因水平对细胞凋亡起作用[13]。此外，PCF可通过抑制磷脂酰肌醇-3激酶（ATK）的表达从而抑制细胞周期蛋白CyclinD1和周期蛋白依赖激酶4（CDK-4）的活化，抑制紫外线引起的细胞凋亡[14]。

    1.8 c-jun/c-fos和COX-2通路

    c-jun和c-fos基因对细胞生长的调控具有重要意义，是细胞凋亡的中间媒介，它们的表达产物c-jun和c-fos蛋白是激活蛋白1（activator protein1， AP-1）的重要组成部分，研究[15]表明AP-1在介导紫外线诱导的皮肤老化和癌症中占有重要地位。UVA可诱导HaCaT细胞内c-jun/c-fos和环氧合酶-2（COX-2）的表达，引发细胞凋亡，而PCF可通过抑制AP-1和COX-2的活性来抑制HaCaT细胞凋亡。

    1.9 TNF-α/TNFR1通路

    肿瘤坏死因子（TNF-α）与其受体TNFR1的结合既可以诱导凋亡信号，也可以引起抗凋亡信号，其作用与细胞核因子NF-κB被活化还是被抑制有关。紫外线辐射后HaCaT细胞内TNF-α、TNFR1的活化可导致JNK蛋白的激活，活化的TNFR1还可以通过影响NF-κB的活性及caspase级联反应来调控细胞凋亡过程。实验[16]表明PCF可以通过影响TNF-α/TNFR1的表达，进而抑制下游JNK磷酸化，最终发挥细胞保护作用。

    1.10 TRAIL通路

    肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumour necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）存在于人体的大多数器官和细胞，其诱导的凋亡信号传导与ROS有关[17]。PCF可直接抑制TRAIL的表达，或以其抗氧化活性抑制TRAIL凋亡通路。

    2 PCF增强机体免疫功能

    目前，在研究PCF对免疫方面的作用时，常采用地塞米松（DEX）建立淋巴细胞的免疫抑制病理模型[18]。DEX可以显著减弱脾脏和胸腺细胞的活性，减少免疫细胞的数量。

    2.1 PCF对机体免疫细胞的影响

    PCF对正常小鼠的腹腔巨噬细胞和天然杀伤细胞无明显影响，但是DEX和FCF共同培养与DEX单独培养的细胞比较，腹腔巨噬细胞的吞噬功能和天然杀伤细胞的活性均有明显提高[18]。因此可推断，对于免疫力低下的小鼠，PCF可提高机体非特异性免疫防御能力。

    PCF对于胸腺和脾脏的作用并不完全相同。胸腺是中枢淋巴器官，是培育T淋巴细胞的场所；而脾脏为外周淋巴器官，是T淋巴细胞和B淋巴细胞受到抗原刺激后产生免疫反应的场所。根据张彩梅等[19]的研究发现，PCF对DEX处理小鼠的胸腺细胞形态学无明显影响，但可以使脾脏白髓组织恢复正常大小，且淋巴细胞密集；在另一方面，PCF对于正常和DEX处理小鼠胸腺各T细胞亚群无明显影响，但可以使脾脏T细胞亚群中L3T4+和Lyt2+所占的比例明显升高。由此可推断， PCF可能主要通过影响外周成熟免疫细胞发挥免疫调节作用。

    2.2 PCF对免疫调节物质的影响

    PCF还可以通过调节机体内免疫物质而影响机体的免疫能力。刀豆素（ConA）能较好的促进淋巴细胞的转化反应，调节机体免疫反应。PCF可以提高因DEX处理而降低的ConA转化能力，但对于正常的细胞，PCF没有明显增强ConA转化能力的效果[18]。雌二醇（E2）是机体中具有广泛调节作用的激素之一，对免疫功能也具有调节作用，可在体内抑制免疫细胞的活性，而PCF可以阻断E2对免疫细胞的抑制作用[20]。

    3 PCF的抗氧化作用

    PCF可作为抗氧化剂，使細胞中ROS、丙二醇（MAD）等物质减少，还可以提高抗氧化物质的活性。车勇良[21]实验证明，PCF和H2O2共同处理的胸腺细胞较H2O2单独处理的胸腺细胞，抗氧化酶和非酶抗氧化剂如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、H2O2酶（CAT）及总抗氧化能力（T-AOC）的活性有明显升高，且在一定范围内有剂量依赖性。PCF的抗氧化作用在不同种氧化损伤模型处理的不同细胞中普遍存在，如以UVA为损伤模型处理的HaCaT细胞[22]，以UVB为损伤模型处理的Hela细胞[23]、HaCaT细胞[24]中均出现此类现象。

    3.1 修复H2O2损伤的生物膜结构

    H2O2是一种强氧化剂，可以使细胞中MAD的含量升高，MAD是自由基所致的过氧化物，可以破坏细胞膜脂，损坏其结构和功能的完整性。PCF可以普遍降低氧化损伤细胞中MAD的含量，从而抑制了细胞的脂质过氧化。

    另外，PCF还可以通过升高线粒体膜电位（ΔJm）和Ca2+浓度保护生物膜[21]。线粒体膜电位的下降可引起线粒体Ca2+外流，Ca2+作为一种重要的细胞信号，它的持续升高会导致细胞质中大量的蛋白酶和磷酸酶失活，同时分解钙的依赖性蛋白酶和磷酸酶可能被激活，从而引起细胞骨架的破坏和细胞膜的损伤。

    3.2 抑制P物质（SP）的过度表达

    SP是由感觉神经纤维C受到各种刺激后释放，作为调节皮肤炎症的递质，另外它还与细胞增殖和细胞凋亡有关。张玉江等人[25]的研究表明，在无毛小鼠皮肤氧化损伤和凋亡模型中均存在SP的过度表达，PCF对SP的表达有抑制作用且存在剂量依赖性。因此可推测，UVB引起的皮肤氧化损伤与SP的过度表达有关，PCF可以减少SP的表达量，预防连续UVB辐射对皮肤组织的损伤。

    3.3 降低一氧化氮（NO）的产生

    NO是细胞在应激状态下产生的高反应自由基，由一氧化氮合酶NOS催化产生，也可以由非一氧化氮合酶（iNOS）途径产生。实验表明[26]，PCF预孵的HaCaT细胞经UVB照射后，NO的释放量低于未预孵的模型组，说明PCF可有效抑制NO的釋放。PCF可能通过抑制iNOS的表达，从而抑制NO的生成，但对于通过其他途径释放NO的抑制，还需通过进一步研究。

    3.4 抑制EGFR的过度表达

    EGFR是一种跨膜蛋白，其胞外区有上皮生长因子的结合位点，其介导的酪氨酸磷酸化反应在调节细胞生长和增殖中有重要的作用，多种肿瘤细胞存在EGFR的过量表达，因此该途径被认为与肿瘤的发生密切相关。在连续UVB辐射无毛小鼠皮肤氧化损伤病理模型的基础上研究发现，连续UVB辐射可使无毛小鼠突变型EGFR过度表达，PCF可以有效减少因辐射而增加的EGFR的表达量[25]。因此可推断，PCF可以通过减少EGFR的表达量预防连续UVB辐射对皮肤组织的损伤。

    4 PCF的其它作用

    4.1 抑制UVB导致的人皮肤成纤维细胞周期阻滞

    实验证明，UVB可以使人皮肤成纤维细胞ROS含量上升，诱导p53蛋白表达，使p21Cip1（周期蛋白依赖激酶抑制因子）分子表达明显升高；加入PCF后，ROS、p53蛋白和p21Cip1分子的表达均受到抑制[27]。p21Cip1分子是p53蛋白的下游靶分子，对细胞周期有负调控作用，可导致细胞G1期阻滞，而ROS是激活p53蛋白物质之一。因此可以推断，PCF通过清除ROS、抑制p53蛋白的表达缓解人皮肤成纤维细胞周期阻滞。

    4.2 促进细胞的增殖和分化

    实验证明，一定浓度的PCF可以明显促进新西兰兔骨髓基质细胞（BM-SCs）在体外的增殖，达到促进神经细胞损伤修复的效果[28]。另外，PCF还可以促进人脐血干细胞的的分化[29]。

    5 展望

    PCF是一种新兴的海洋活性物质，相比于传统人工合成的大分子多肽，其具有毒性低、来源广的特点，因此近年来引起研究者的注意。目前已取得一些进展与突破，主要是在细胞保护方面，提供了细胞损伤的修复及防治方法。同时，海洋蛋白经酶解后有溶解性强、乳化性高、流动性增加等特点，使PCF在化食品、药物、化妆品等方面有着十分广阔的开发与利用前景[30]。其与相应药物联用后的抑瘤作用更是为肿瘤辅助药物的研发提供了新思路，充分体现出其潜在而巨大的社会效益与经济效益。当然，现在对PCF的研究是远远不够的，未来对其进行综合研究将会对相关行业的现状带来巨大改善。

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    Effects and mechanism of polypetide from Chamys farreri

    WEI Ting-ting，HOU Yu，ZONG Ya-li，Ma Jing-zhi，Yang Jun-li，CUI Long-bo

    （College of Life Sciences，Yantai University，Yantai 264005，China）

    Abstract：Polypeptides from Chlamys farreri （PCF） is an solvable antioxidative peptide. The functions of PCF were summerized， including inhibiting apoptosis caused by UVB， boosting immunity and inhibiting the oxidative damages as antioxidants. The role of PCF in the proliferation cycle was also outlined and the mechanism of actions of PCF was analyzed.

    Key words：Polypetide from Chamys farreri； apoptisis； immunity； antioxidation