一株海南土著荚膜红细菌的培养特性

    冼健安+张秀霞+李军涛+郑佩华+鲁耀鹏+王冬梅

    

    

    摘 要：针对筛选到的一株海南土著的高活性荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）菌株QH03，开展其最适培养条件研究。结果显示：其最适碳源为乙酸钠和酵母膏，最适氮源为氯化铵和硫酸铵，适宜光照强度为3 000 ～8 000 lx，最适温度为30～35 ℃，最适初始pH为7.0～7.5，最适盐度为10‰～30‰。

    关键词：光合细菌；荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）；培养条件

    光合细菌是最早出现具有原始光能合成体系的原核生物，可具有多种功能，包括固氮、脱氮、固碳、硫化物氧化等，与氮、磷、硫循环具有密切的关系，在自然界的净化过程中担当着十分重要的角色。因此，人们利用光合细菌的生理和生态特点，将其应用于废水治理当中，取得了显著的效果。研究表明光合细菌在水产养殖中的应用效果也十分显著[1]。光合细菌不但能作为净水剂改善池塘水质，还因其含有丰富营养物质以及生物活性物质辅酶Q，可作为鱼虾贝幼体及轮虫等动物性生物饵料的饵料，以及水产动物的饲料添加剂[1]。光合细菌的使用可显著提高水产养殖动物的生长性能、存活率、免疫功能和抗病能力，从而提高养殖产量[2-4]。光合细菌产品作为一种无毒害副作用和药物残留的微生态制剂，在当前保护环境、生态养殖及食品安全等的社会导向下，十分值得进一步的推广应用。

    目前应用于水产养殖的光合细菌产品繁多，但产品质量参差不齐，其中不乏添加色素、活力低等的伪劣产品。另一方面，海南地处热带地区，气候条件特殊，但针对海南土著光合细菌的研究尚未见报道。因此，作者从海南养殖池塘中筛选海南土著的光合细菌菌种，以期研发能更好地适用于海南地区水产养殖的高效光合细菌产品。从大量分离的菌株中，筛选了一株生长速度快、菌液鲜红的菌株，编号为QH03，经鉴定该菌株为荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）。为进一步研究该菌株的应用价值，针对该菌株开展了适宜碳源、氮源、光照度、温度、初始pH以及盐度等培养特性研究。

    1 材料和方法

    1.1 试验菌株

    本试验用的菌株由中国热带农业科学院热带生物技术研究所从海南高产对虾土塘的养殖水体中分离获得，经鉴定为荚膜红细菌Rhodobacter capsulatus（菌株编号QH03）。

    1.2 基础培养基

    每1 L液体培养基中，含有以下成分：CH3COONa 2 g、NH4Cl 1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.3 g、NaCl 0.1 g、CaCl2 50 mg、MnSO4·H2O 2.5 mg、生长素贮液（生长素1 mg、烟酸100 μg、对氨基苯甲酸10 mg、维生素B1 100 mg，蒸馏水1 L）10 mL，调节pH至7.0，高压灭菌。

    1.3 生长测定

    用紫外可见分光光度计测定培养液在660 nm的OD值。

    1.4 培养特性研究

    1.4.1 碳源 在基础培养基中，以不同的碳源替代CH3COONa，配制成含有不同碳源的培养基，将活化的菌种以20%接种到已灭菌的培养基中，于温度30 ℃、光照强度3 000 lx下培养96 h，取培养液测定OD660，根据菌株生长情况判断其对不同碳源的利用情况。实验设置3个平行。

    1.4.2 氮源 在基础培养基中，以不同的氮源替代NH4Cl，配制成含有不同氮源的培养基，将活化的菌种以20%接种到已灭菌的培养基中，于温度30 ℃、光照强度3 000 lx下培养96 h，取培养液测定OD660，根据菌株生长情况判断其对不同氮源的利用情况。实验设置3个平行。

    1.4.3 光照强度 将活化的菌种以20%接种到已灭菌的基础培养基，置于不同的光照强度下培养：1 000 、2 000、3 000、4 000、6 000和8 000 lx，温度30 ℃，培养96 h，取培养液测定OD660。实验设置3个平行。

    1.4.4 温度 将活化的菌种以20%接种到已灭菌的基础培养基，置于不同的温度下培养：15、20、25、30、35和40 ℃，光照度3 000 lx，培养96 h，取培养液測定OD660。实验设置3个平行。

    1.4.5 初始pH值 将基础培养基调节为不同的pH值：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，将活化的菌种以20%接种，于温度30 ℃、光照强度3 000 lx下培养96 h，取培养液测定OD660。实验设置3个平行。

    1.4.6 盐度 将海水进行过滤，以蒸馏水进行稀释配制不同盐度：0、5‰、10‰、15‰、20‰、25‰和30‰。以不同盐度的稀释海水配制培养基（去除NaCl），将活化的菌种以20%接种，于温度30 ℃、光照强度3 000 lx下培养96 h，取培养液测定OD660。实验设置3个平行。

    2 结果

    2.1 碳源

    荚膜红细菌菌株QH03对碳源利用结果如表1所示，菌株QH03对乙酸钠和酵母膏的利用率很高，对丙酸钠、谷氨酸、苹果酸和醋酸有较高的利用率，对乙醇、琥珀酸钠、甘油、葡萄糖、蔗糖和果糖的利用率较低，不能利用柠檬酸钠、酒石酸钠、硫代硫酸钠、苯甲酸钠和甘露糖。

    “-”表示对该物质不利用，“+”表示对该物质利用率较低，“++”表示对该物质利用率较高，“+++”表示对该物质利用率很高，下表同。

    2.2 氮源

    荚膜红细菌菌株QH03对氮源利用结果如表2所示，菌株QH03对氯化铵和硫酸铵的利用率很高，对蛋白胨有较高的利用率，对硝酸钠的利用率较低，不能利用亚硝酸钠和尿素。

    2.3 光照强度

    光照强度对QH03菌株生长的影响如图1所示。在1 000至8 000 lx的光照强度范围内，该菌均能生长，光照强度越大，其生长速度越快，生物量越大。在光照强度为3 000～8 000 lx时，生长情况良好，达到6 000～8 000 lx时，生长速度最快。在2 000 lx以下时，生长速度受到了较大的抑制。

    2.4 温度

    温度对QH03菌株生长的影响如图2所示。该菌在温度为15～40 ℃的范围内均能生长。在15 ℃时，菌的生长速度最慢；在15～35 ℃范围内，随着温度的提高，菌的生长速度也提高，在25～35 ℃時生长良好，达到30～35 ℃时，生长速度最快；温度继续提高到40 ℃时，对其生长造成了一定的抑制性。

    2.5 初始pH值

    初始pH值对QH03菌株生长的影响如图3所示。该菌在初始pH为6.0～8.5的范围内均能生长。在pH值为6.5～8.0时，生长状况良好，在pH值为7～7.5时，生长速度最快。pH值过低或过高均对该菌的生长产生较大的抑制作用。

    2.6 盐度

    盐度对QH03菌株生长的影响如图4所示。该菌在盐度为0～30‰的范围均能生长。在盐度为10‰～30‰的状态下，菌的生长速度显著高于盐度为0～5‰。

    3 讨论

    从结果可见，荚膜红细菌菌株QH03可利用的碳源较为广泛，其中对乙酸钠和酵母膏的利用率最高，以丙酸钠、谷氨酸、苹果酸和醋酸为碳源时，生长状况也较为良好。适宜氮源以铵盐为主，对有机氮的尿素以及亚硝态氮的亚硝酸钠均不可利用。

    光照强度是影响光合细菌生长速度的最重要因素之一。从结果可看出，菌株QH03的适宜光照强度在3 000～8 000 lx，在光照强度为3 000 lx以上时，菌的生长良好，光照强度达到6 000 lx以上时，生长速度还能进一步提高，但提高程度有限。如果以该菌株作为规模化生产的菌种，考虑生产成本，则以3 000 lx为宜。从海底污泥中分离的荚膜红假单胞菌的适宜光照强度则偏低，为1 600～3 000 lx，超过3 000 lx时，对生长产生一定的抑制作用[5]。从宁波虾塘底泥中分离的荚膜红假单胞菌的最适光照强度为2 000～5 000 lx[6]。本研究所用的菌株QH03分离自池塘表面水体，接受自然光照的强度较大，因此相比较分离自底泥的菌株，其光照强度需求较高。

    温度与菌体的生长代谢速率关系密切，由结果可见，温度过低或过高都不利于菌株QH03的生长，其在25～35 ℃时生长良好，最适温度范围为30～35 ℃，与从洛河水中分离的荚膜红假单胞菌的研究结果较一致[7]；从广东台山海底污泥中分离的荚膜红假单胞菌的最适温度为25～28 ℃[5]；从宁波虾塘底泥中分离的荚膜红假单胞菌的最适温度则为27.5～30 ℃[6]。菌株QH03来源于海南热带地区的养殖池塘，因此更能适应较高的生长温度。

    初始pH值对菌株QH03生长具有十分明显的影响，结果显示菌株QH03能较好地适应的pH范围为6.5～8.0，表明该菌株的pH适应范围较广，其中pH为7.0～7.5时，可达到最佳的生长速度。易力等从洛河水中分离的荚膜红假单胞菌的最适pH为6～7[7]；金珊等从宁波虾塘底泥分离的荚膜红假单胞菌的最适pH为6.5～75[6]。光合细菌的大量繁殖会导致菌液pH的上升，虽然pH上升意味着光合细菌处于生长旺盛阶段，但pH升高至超过生长适宜范围时，便会抑制菌的生长，导致生长停滞并逐渐衰亡，因此初始pH应尽量控制在较低的适应水平。为达到最佳的生长速度，对菌株QH03进行扩大培养时，其培养基以pH 7.0为宜。

    为确定菌株QH03的咸淡水适用范围，分析了其适宜生长的盐度。由结果可见，菌株QH03的适宜盐度范围十分广泛，可在淡水至30‰海水中正常生长，尤其在10‰～30‰海水中生长情况较好。该菌株筛选自海南沿海地区的对虾养殖池塘，养殖水体为海水，其盐度为28‰～30‰，因此该菌株更能适应高盐度的水体。从洛河水中分离的荚膜红假单胞菌的较为适宜NaCl盐度为05%～2%[7]；从宁波虾塘底泥分离的荚膜红假单胞菌的适宜NaCl盐度为2.5%～5.0%[6]。

    本研究所选用的荚膜红细菌菌株QH03为海南土著菌种，结果显示其碳源适应范围广，能够很好地利用铵盐，光照强度为3 000 lx以上可生长良好，适宜温度25～35 ℃，适宜pH6.5～8.0，适宜盐度范围广，淡水和海水中均可适用，表明该菌株在海南热带地区水产养殖中具有一定的应用潜力，可作进一步的应用性研究。

    参考文献：

    [1] 沈涛，刘斯开，傅罗琴，等.光合细菌在鱼类养殖上的应用及其作用机理[J].水产科学，2012，31（2）： 114-118

    [2] 王有基，胡梦红，朱焕青，等.光合细菌对鲤鱼非特异性免疫功能的影响[J].水利渔业，2005，25（6）： 38-39

    [3] 张梁，张伟，任小丽.光合细菌对草鱼生长及免疫相关酶活性的影响[J].粮食与饲料工业，2007（2）： 37-38

    [4] 陆家昌，黄翔鹄，李活，等.光合细菌对养殖水质及凡纳滨对虾抗病力的影响[J].广东海洋大学学报，2009，29（6）： 87-91

    [5] 张玲华，邝哲师，陈薇，等.荚膜红假单胞菌的分离培养与水质净化效果[J].广州环境科学，2003，18（3）： 7-9

    [6] 金珊，赵青松，薛良义，等.荚膜红假单胞菌的自然选育及培养特性[J].宁波大学学报（理工版），1999，12（4）： 38-41

    [7] 易力，汪洋，陈万光.高活性光合细菌荚膜红假单胞菌培养特性研究[J].内陆水产，2008（5）： 45-46

    （收稿日期：2017-02-07）