PCR快速检测淋病奈瑟菌NspA基因方法的建立及分析
王彦 王琨 刘小林 刘霞 王西珍
【摘要】目的 构建PCR检测淋病奈瑟菌NspA基因的方法，为寻找快速检测淋病奈瑟菌的方法提供理论依据。方法 根据NspA基因序列设计一对引物，从10例已成功培养出淋病奈瑟菌的患者尿道分泌物中用PCR方法扩增NspA基因，并测序鉴定。结果 1.0%琼脂糖凝胶电泳显示成功获得一个约528 bp的基因片段，基因测序鉴定与本实验设计相符。结论 淋球菌常规培养检测和鉴定需2～3天的时间，而PCR快速检测淋病奈瑟菌NspA基因，只需2～3小时便能获得数据，缩短了检测时间，给临床诊治赢得宝贵时间。
【关键词】PCR;淋病奈瑟菌;NspA基因
【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095.6681.2019.29..02
淋病病原体是淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）俗称淋球菌，它的唯一天然宿主是人类。淋病奈瑟菌NspA基因是淋球菌表面蛋白A的表达基因，有研究发现NspA抗原不但在细菌表面持续表达，而且高度保守，淋球菌NspA氨基酸序列在淋球菌菌株之间的同源性高达98%。本研究旨在寻找一种快速检测淋球菌的方法，为临床诊治赢得宝贵时间。
1 材料与方法
1.1? 标本采集
收集自2016年9月～2018年3月我院皮肤性病科、男性科、泌尿外科门诊疑似淋病患者，其中男性取尿道分泌物，女性取距宫颈口1～1.5 cm处分泌物，装入无菌试管，-80℃冷冻备用。从中选取10例经VITEK-2 COMPACT全自动微生物分析仪鉴定为淋病奈瑟菌的患者分泌物用PCR方法扩增NspA基因。
1.2? 方法
1.2.1 设计和合成引物
以淋球菌DNA为模板，根据GeneBank报道的NspA （gi：26324161） 核甘酸序列，利用Primer Premier 5.0软件自行设计引物和探针，由invitrogen公司合成。引物如下：
上游引物 P1： 5′-GCATGAAAAAAGCACTTGCC-3′
下游引物P2： 5′-CCGTCAGAATTTGACGCGCAC-3′
用PCR来验证所设计引物的特异性，并使用淋球菌标准菌株CMCC 29403作为阳性对照;用可能成为尿道感染致病菌的标准菌株大肠埃希菌ATCC25922，作为阴性对照（由江苏省临检中心提供）。
1.2.2 DNA的提取和扩增
1.2.2.1 临床样本的DNA提取
把10例临床样本的棉拭子在磷酸盐缓冲液（PBS）中（2 mL）挤压洗1～2 min，并用Votex漩涡振荡器振荡1min，弃去棉拭子使分泌物尽量溶于生理盐水中，悬浮液放入离心机3000 r/min离心5 min（离心半径16 cm），弃上清液，用1mL无菌生理盐水悬浮细胞，放入离心机，3000 r/min离心5 min（离心半径16 cm），弃上清液，细胞重新溶于1×TE缓冲液中（100 μL），100℃加热煮沸10 min后放入离心机12000 r/min离心10 min（离心半径16 cm），上清液含DNA模板，用于PCR扩增。
1.2.2.2 阳性对照、阴性对照
按照《全国临床检验操作规程》要求，取淋球菌标准菌株CMCC 29403增菌后接种于巧克力培养基中培养，用苯酚-氯仿法提取淋球菌基因组DNA，PCR扩增NspA基因，作为阳性对照。以同样方法取标准菌株大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照。
1.2.2.3 NspA基因的PCR扩增
取已准备好的10例临床样本DNA，用设计的P1和P2为引物，PCR扩增NspA基因，25 μL反应体系如下：10×PCR Buffer 2.5 μL;10 μmol/L上游引物1 μl;10 μmol/L下游引物1 μL;dNTP 1.5 μL;Taq 酶0.5 μL;模板DNA 1μL;去离子水17.5 μL。反应条件为：94℃ 5 min;94℃ 60 S;58℃ 45 S;72℃ 1 min;共35个循环;最后72℃ 10 min。
1.2.2.4 NspA基因核苷酸序列鉴定
按PCR胶回收纯化试剂盒说明书纯化PCR产物，将经柱式胶回收纯化临床PCR产物送往INVITROGEN公司进行测序鉴定。
2 结 果
2.1? PCR扩增NspA基因
采用P1和P2为引物，对已准备好的10例临床样本DNA模板进行PCR扩增，在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，得到一条与NspA预期相符大小约为528 bp的清晰条带，与本实验设计相符，见图1。
2.2? 序列测定
本研究PCR扩增的10例临床NspA基因全长528 bp（含起始密码和终止密码），编码175个氨基酸。对测序结果作Blastn分析，结果发现PCR扩增的临床NspA基因序列与GeneBank报道的淋球菌（CMCC 29403）NspA（gi：215260656）核苷酸序列完全一致，见图2。
3 讨 论
淋球菌能够引起泌尿生殖系统的化脓性感染，临床表现为有典型的尿痛及尿道脓性分泌物，人类是它唯一的天然宿主。淋病好发于尿道引起淋病性尿道炎，如治疗不及时，还可侵入泌尿生殖器的其他部位，引起前列腺炎、附睾炎、盆腔炎、输卵管炎等，也可侵犯眼睛、咽部、直肠，甚至经血液播散到全身形成淋球菌性关节炎、心内膜炎、腱鞘炎等合并症。
目前一种用来放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术是聚合酶链式反应（PCR），其一次性地将反应液加好后进行变性-退火-延伸反应。扩增反应一般在2～4小时内完成，扩增产物一般用电泳分析，无放射性污染、易推广。
细菌培养法是世界卫生组织推荐诊断淋球菌的“金标准”，然而报告时间较长、操作繁琐。不少患者在就诊前都接受过非正规的抗生素治疗，再加上淋球菌生长条件苛刻，对外界抵抗力较低，增加细菌培养难度，影响检出率。而PCR检测法由于有较高的特异性和敏感性，因而广泛应用于医学领域，不管患者分泌物中的活菌或死菌都可检出[1]。一般细菌培养及VITEK.MS质谱鉴定，需要较长时间才能最后确定到菌种[2]，应用VITEK.MS质谱技术来进行细菌鉴定，虽然有较完整的微生物图谱库进行结果比对[3]，但仪器设备价格昂贵，中小型医院难以普及。淋球菌常规培养检测和鉴定也是需2～3天的时间，常常延误诊断和治疗。而PCR检测淋球菌保守的NspA基因只需2～3小时便能获得数据，具有较高的特异性及敏感性，缩短了检测时间，快速做出诊断，早发现、早治疗，给临床诊治赢得宝贵时间。
参考文献
[1] 赵晓兰，冯 琳.四种方法检测淋病奈瑟球菌的临床应用对比研究[J].中国性科学，2015（7）：45-47.
[2] Lim SH，Mix S，Xu Z，et a1.Colorimetric sensor array allows fast detection and simultaneous identification of sepsis-causing bacteria in spiked blood culture[J].J Clin Microbiol，2014，52（2）：592-598.
[3] Altun O，Botero-Kleiven S，Carlsson S，et a1.Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by MALDI-TOF MS following short—term incubation on solid media[J].J Med Microbiol， 2015，64（1 1）：1346-1352.
本文編辑：刘欣悦
