人工养殖菲牛蛭性腺分化的组织学观察

    张涛+于翔+龚元+李军+张健

    

    

    

    菲牛蛭（Hirudinaria manillensis）属于无吻蛭目，俗名金边蚂蟥，主要以吸食人和动物的血液为生，在我国华南地区分布较广，福建、海南、香港等地均有发现[1]。近几年，国内外学者通过大量研究发现其体内存在生物活性物质[2-8]，功能与水蛭素相似，具有抗凝活性，对降低血酸和血脂有一定药理作用，在心血管疾病和血栓疾病方面疗效明显。因此，菲牛蛭的人工养殖开发具有广大的市场前景。

    目前，随着我国野生菲牛蛭采捕量逐年减少，人工繁殖菲牛蛭技术至关重要，于翔[9]报道了菲牛蛭产卵茧孵化温度24.0～30.0 ℃下，产卵茧周期一般从几天到几十天；张彬[10]报道了温度对菲牛蛭卵茧孵化影响显著，26 ℃和28 ℃下菲牛蛭卵茧孵化率较高；笔者通过越冬实验发现，菲牛蛭冬季也有产茧孵化现象。因此，能否通过一定物理刺激或强化饲料等因素作用，缩短菲牛蛭繁殖周期，并在发育成熟阶段集中繁殖产卵茧，是人工繁殖菲牛蛭最重要的一环。而本文则通过生物组织学角度来剖析菲牛蛭在饲喂强化饲料条件下的性腺发育成熟度，为人工繁殖菲牛蛭技术的发展提供了一定的科学依据。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    菲牛蛭由湖北省荆州市民康生物技术公司提供，挑选健康无病，平均每条体重为1.24±0.13 g亚成体菲牛蛭。

    1.2 方法

    实验在室内进行，将实验小水蛭暂养到土壤厚度为20～30 mm 的380 mm×275 mm×140 mm的60目网箱中，再将网箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，用水调节干湿度至70%～80%。每箱实验组投放100尾小水蛭，并设三个平行组，暂养周期为7 d。

    在养殖室温为21～28 ℃，土层温度为19～24 ℃条件下，试验饲料采用人工配合饲料（NP90血球粉30 g，NP2002血浆粉5 g，基础液，鸡蛋100 mL）灌肠后饲喂，每次饲喂前挑取全部试验小水蛭放到380 mm×275 mm×140 mm的60 目空网箱中，再将网箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，塑料箱中放入少量的37 ℃左右的温水，最后将配好的饲料放入网箱中，每5～10 d饲喂一次。每次饲喂前后要称量全部水蛭个体体重，并在饲喂前随机采取3～5条体质健壮、体色正常、无伤病的小水蛭，用吸水滤纸擦拭干净后称其体重，经麻醉剂麻醉，解剖截取精巢和卵巢后用波恩氏液固定24 h、梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡（56～60 ℃）包埋；通过DQP-9010电脑切片机连续切片，厚度7～8 μm，再进行苏木精—曙红（H.E）染色、中性树胶封片，最后用ECLIPSE E600光学显微镜观察、拍照[11-12]。

    1.3 数据统计与分析

    试验数据用平均值±标准差（Mean±SD）表示， 每次饲料实验前与实验后代谢5～10 d的体重增重率（W，%）。

    W（%）=（W2-W1）/W1×100%

    2 结果与分析

    2.1 人工饲料饲喂菲牛蛭前后体重与形态变化

    2014年6月14日至2014年9月19日期间，用人工饲料饲喂菲牛蛭14次。每次饲料实验前与实验后代谢5～10 d的平均体重增重率（%）达到14.1±1.32%。饲喂后菲牛蛭全身肿胀，行动迟缓，经过5～10 d的代谢过程，身体基本恢复到饲喂前状态，体表颜色无显著变化，身体健康。当水蛭体重达到6 g左右时，发现部分菲牛蛭前端有黄色生殖环带出现。

    2.2 人工饲料饲喂菲牛蛭的精巢发育及组织学特征

    菲牛蛭精巢位于身体两侧，为球形，共11对。每个精巢有输精小管通到输精管，各自膨大成贮精囊，再通到射精管，两侧的射精管在中部汇合到一个精管膨腔。不同发育时期的精巢，其特征不同。

    本实验中，菲牛蛭通过人工饲料强化喂养，精巢才逐步成熟，其集中的高峰成熟期是在8月24日—9月19日的6次喂养过程中。本文为便于描述，将精巢发育过程分为5个时期。

    2.2.1 精巢发展适应期Ⅰ（6月14日—6月24日）

    解剖后肉眼观察精巢为圆形，白色透明，精巢最大直径为110 μm。由图1-1可知，组织切片观察：精巢由结缔组织分割成许多不规则的小室，小室内生殖细胞大量增值成精原细胞，聚集成团，精原细胞大小不一，不规则的排列于精巢之中，组织學为第Ⅰ时期。该结构为初生期精囊。

    2.2.2 精巢发展适应期Ⅱ（6月24日—7月9日）

    解剖后肉眼观察精巢为圆形，白色透明，精巢最大直径150 μm。由图1-2可知，组织切片观察：生精囊之间较为宽松，精小叶之间可见精原细胞和初级精母细胞，精原细胞大量增殖聚集成初级精母细胞，核染色较深，结缔组织有明显的血管分布，精小叶无腔隙或腔隙较小，精小囊内初级精母细胞同步发育，细胞体积与精原细胞相差不多，组织学为第Ⅱ时期。

    2.2.3 精巢发展启动期（7月9日—7月29日）

    解剖后肉眼观察精巢为圆形，白色半透明，精巢最大直径为190 μm。由图1-3，1-4可知，组织切片观察：生精囊有丰富的微血管分布，精母细胞发育不同步性，除少数精原细胞外，大多数为初级精母细胞和次级精母细胞，细胞嗜碱性很强，被苏木精染成蓝色，细胞核明显，生精囊中空存在，生精囊壁较薄，组织学为第Ⅲ时期。

    2.2.4 精巢发展生长期（7月29日—8月24日）

    解剖后肉眼观察精巢为圆形，白色，精巢最大直径为240 μm。由图1-5可知，组织切片观察：精小叶生精囊破裂，中空消失，腔隙增大，精小叶主要以次级精母细胞为主，同时伴有少量的精原细胞，初级精母细胞和精子细胞，这些不同发育阶段的各类精母细胞在一个精小叶内是以同型的细胞群排列，组织学为第Ⅳ时期。

    2.2.5 精巢发展成熟期（8月24日—9月19日）

    解剖后肉眼观察精巢为圆形，白色，精巢最大直径为270 μm。由图1-6，1-7可知，组织切片观察：精小叶生精囊破裂，中空消失，次级精母细胞很少，几乎看不到精原细胞和初级精母细胞，成熟的精子细胞进入腔隙挤满整个空间，精小叶中腔隙缩小，精小叶的小叶腔隙充满大量的成熟精子，组织学为第Ⅴ时期。

    2.3 人工饲料饲喂菲牛蛭的卵巢发育及组织学特征

    菲牛蛭卵巢被上皮结缔和脂肪组织包裹明显，位于雌性生殖孔第36，37环节中间的环沟上，蛋白腺两侧，为圆形或椭圆形，与输卵管相连，共1对。不同发育时期的卵巢，其特征不同。

    本实验中，菲牛蛭通过人工饲料强化喂养，卵巢才逐步成熟，其集中的高峰成熟期也是在8月24日—9月19日的6次喂养过程中。本文为便于描述，将卵巢发育过程分为5个时期。

    2.3.1 卵巢发育适应期（6月14日—7月9日）

    卵巢发育到第Ⅰ期时，肉眼观察卵巢为浅灰色半透明，椭圆形，最大直径为100 μm。由图2-1可知，组织切片观察：生殖细胞成团，不规则的排列在卵巢中，主要以卵原细胞为主，细胞质分布均匀，并表现为明显的嗜碱性，细胞核圆形，较大，位于细胞中央，占据整个细胞体积的1/3-1/2左右，卵母细胞直径0.8～1.2 μm。

    2.3.2 卵巢发育启动期（7月9日—8月8日）

    卵巢发育到第Ⅱ期时，肉眼观察卵巢为白色半透明，椭圆形或圆形，最大直径为120 μm。由图2-2， 2-3可知，组织切片观察：生殖细胞由卵原细胞向初级卵母细胞过渡，细胞质嗜碱性减弱，细胞核多位于细胞中央，细胞为卵圆形或圆形，部分细胞核仁增多，核区嗜酸性增强，卵母细胞质膜外层出现皮质液泡层并向内延伸，细胞直径1.5～2.1 μm。

    2.3.3 卵巢发育小生长期（8月8日—8月24日）

    卵巢发育到第Ⅲ期时，肉眼观察卵巢体积增大不明显，为白色透明，椭圆形或圆形，最大直径为145 μm。由图2-4，2-5可知，组织切片观察：初级卵母细胞进入卵黄积累时期，细胞质嗜碱性继续减弱，细胞膜和细胞核界限模糊不清，细胞核向细胞一侧移动，核仁已经排出，皮质液泡层液泡减小，并出现嗜酸性卵黄颗粒，呈放射状和浅紫色，卵母细胞直径1.8～2.4 μm。

    2.3.4 卵巢发育大生长期（8月24日—9月9日）

    卵巢发育到第Ⅳ期时，肉眼观察卵巢体积明显增大，为淡黄色 ，椭圆形或圆形，最大直径为210 μm。由图2-6可知，组织切片观察：细胞质减少，核膜开始消失，核仁溶解，皮质液泡层消失，卵黄颗粒由外向内延伸，充满卵母细胞，卵母细胞直径2.7～3.2 μm。

    2.3.5 卵巢发育成熟期（9月9日—9月19日）

    卵巢发育到第Ⅴ期时，肉眼观察卵巢体积，形状与Ⅳ期变化不明显，颜色为黄色，最大直径为215 μm。由图2-7可知，组织切片观察：卵母细胞已经达到成熟标准，卵黄颗粒在卵母细胞聚集成卵黄，并充满整个卵母细胞， 卵母细胞直径2.8～3.4 μm。

    3 讨论

    3.1 菲牛蛭繁殖生物学特性

    菲牛蛭是雌雄同体，雄性先成熟[1]的环节动物，这与本实验组织切片观察结果相似。菲牛蛭行异体受精，由身体前端产茧后茧繁殖后代。其有一可以翻出的阴茎，交配时两个体身体相反的腹部贴紧，一个个体阴茎插入另一个体阴道内，一般是单方面输送精子到另一方。当一方个体的卵巢成熟后，卵巢囊中的卵与来自另一方个体的精子结合形成受精卵，最后被输卵管的蛋白包上，此时受精卵就通过雌孔迅速地产到水蛭前端生殖体节的腺体中，这是为什么我们在观察水蛭在产茧结束前，身体前部有黄色的生殖环带的主要原因。

    3.2 人工饲料饲喂次数、体重对菲牛蛭繁殖性能的影响

    菲牛蛭在经过三个月时间，14次人工饲料饲喂后，每次饲料实验前与实验后代谢5～10 d的平均体重增重率W（%）达到14.1±1.32%。 随着人工饲料饲喂次数增多，当菲牛蛭体重为6 g左右时，发现部分水蛭前端出现黄色的生殖环带，表明水蛭性腺已经达到成熟标准。这与张斌[10]报道的当菲牛蛭体重在5～15 g范围内，性腺系数随体重的增加而增大的内容一致。但是，水蛭成熟时躯体大小与饲喂次数并非固定，而是具有一定的可塑性[13]。生长情况良好的菲牛蛭个体可能提前性成熟。同一种群中菲牛蛭性腺成熟的时间与个体大小有可能来自遗传的差异[14]，也有可能來自对同一环境的适应性不同的影响[15]。

    3.3 人工饲料饲喂菲牛蛭性腺成熟时间与周期

    精小叶的小叶腔隙中是否充满大量的成熟精子是判断精母细胞成熟的标志，而卵黄的发生是卵子发育过程中极为重要的代谢活动，是卵母细胞能否发育成熟的关键。本实验切片观察可知，7月29日饲喂人工饲料前的菲牛蛭生精囊中出现少量精子，此为组织学雄性生殖器官第Ⅳ时期；8月24日饲喂人工饲料前的菲牛蛭生精囊破裂，精小叶的小叶腔隙中充满大量精子，精母细胞成熟，此为组织学雄性生殖器官第Ⅴ时期。8月8日饲喂人工饲料前的菲牛蛭卵母细胞出现放射状的卵黄颗粒，此为组织学雌性生殖器官第Ⅲ时期；9月9日饲喂人工饲料前的菲牛蛭卵黄颗粒在卵母细胞聚集呈卵黄，并充满整个卵母细胞，此为组织学雌性生殖器官第Ⅴ时期。因此，由以上结论推出菲牛蛭是雄性先成熟个体，这与张斌[10]报道一致。

    4 小结

    通过本实验可得知，平均质量为1.24±0.13 g的亚成体菲牛蛭在夏季自然变温和光照条件下，经过三个多月14次人工饲料的饲喂，部分菲牛蛭性腺出现生殖环带，性腺成熟。其成熟时间远低于谭恩光[16]报道的广东菲牛蛭在自然变温和光照在60 W灯泡，早上8：00 亮灯， 17：30 熄灯， 下雨天不亮灯条件下，菲牛蛭从亚成体通过3次饲喂饲料，10个月才发现菲牛蛭有生殖环带，完成一个生命周期所用的时间，因而适当的增强饲料的饲喂频率，可以有助于菲牛蛭性腺早日成熟。

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    （收稿日期：2017-02-03）