甲壳动物免疫系统回路分析
王孟孟+马寨璞+管越强+张凯利
摘要：利用构建的甲壳动物免疫系统图，运用系统生物学方法对各免疫因子的相关关系进行探讨。将免疫系统图中重要的免疫因子抽象为节点，节点之间的边代表着因子之间的相关关系，则将整个免疫系统图抽象为一个充满节点的系统网络图。通过所构建的系统网络图，寻找了两个或多个因子之间的作用机制，以及各免疫路径之间的关系；利用建立的物理数学原理来揭示因子之间的免疫反应作用机制，解答免疫中的反应现象。揭示免疫刺激剂的免疫作用机理，促进整个免疫系统的免疫水平评价。
关键词：甲壳动物；免疫回路；图论；节点
随着水产养殖业的大规模发展，养殖过程中各种病毒和细菌对水产品产量的影响越来越严重；因此，对于怎样提高甲壳动物免疫力来抵抗病害是研究的重点。对各种免疫刺激剂如免疫多糖、中草药等的研究越来越多，例如Deng等[1]研究了从冬虫夏草菌丝体中提取的多糖类物质对于凡纳滨对虾生长、免疫和抗氧化能力的影响。但仅凭几个免疫相关酶的指标来直接判断甲壳动物的免疫能力，显然不全面。甲壳动物免疫包括多条路径，如包囊作用，吞噬作用等，并且各路径之间相互影响、相互作用，一条路径的变化不能衡量整个免疫系统的能力。然而对于免疫刺激剂的研究，大部分研究都是通过测免疫指标的变化来评价的，具体的作用机理尚不清楚；例如陈昌福等[2]研究了免疫多糖对南美白对虾免疫相关酶的激活作用。本文利用系统生物学的思想，将免疫系统网络图抽象为多节点图，利用图论的方法进行研究，并运用数学物理原理来揭示免疫因子之间或路径之间的作用机制，同时对于免疫刺激剂的免疫应答做出重要说明。
1甲壳动物免疫系统网络关系模型总图
甲壳动物免疫系统是一个内部相互联系、相互影响的复杂网络，其中包括多条免疫路径：如吞噬作用、包囊作用、修复作用等。由参考文献[3]得到甲壳动物免疫网络系统图（图1）。图中标示：代表反应物质，代表作用过程；代表杀死病原体；代表着反应流程或物质生成，代表促进作用，代表阻抑作用。
2图论分析
对于建立的全面的免疫系统图，运用图论的知识进行整理分析。1969年，Kauffman提出了著名的布尔网络（Boolean Network，BN）模型，用以研究基因调控网络和细胞分化过程[4-5]。借助于此类思想，通过构建网络模型来研究免疫调控网络。将甲壳动物免疫系统图抽象为一个免疫网络有向图，其中免疫网络中的物质及反应过程抽象为节点，免疫网络中节点之间的关系对应图中的边。图中的节点和边可以带有本身的属性，边分为有向或无向的，分别代表着生化反应或免疫作用关系[6]。
2.1节点的出入度统计与分析
到目前为止，甲壳免疫系统中主要免疫途径的物质及因子，可以确定下来的有51个，将其作为节点，与节点相关联的边数即为度数，输入的边数为入度，输出的边数为出度，入度与出度之和即为总度。各节点的名称及出入度统计，如表1。
聚糖结合蛋白（βGBP），脂多糖（LPS），脂多糖结合蛋白（LGBP），肽聚糖结合蛋白（PGBP），细胞粘附因子（76ku），乙二胺四乙酸（EDTA），过氧化氢酶（CAT），过氧化物酶（SOD），酚氧化酶原激活酶原（proPPA），酚氧化酶原激活酶（PPA），酚氧化酶原（proPO），酚氧化酶（PO），透明细胞（HC），半颗粒细胞（SGC），颗粒细胞（GC），过氧亚硝酸盐阴离子（ONOO-）。
对于各节点度的分布情况表（表1），对节点度的分布进行统计分析并绘制直方图（图2和图3）。可知节点入度为1的有16个，为0的有12个；同时出度为1的有30个，只有少数的节点的出度大于3。
构建的甲壳动物节点图中节点数N为51，因其不存在自连接的边和两节点间的相互边，则可能产生的最大边数为Emax=N（N-1），而在整个免疫网络节点图中实际的边E为86条。则E/Emax的结果为3.37%，由此得出，所建的甲壳动物免疫节点图是稀疏的。
对于出入度均为1的节点，在免疫路径中不可替换，属于具有唯一性的节点，此类节点一旦出问题，与此节点有关的网络通路将会失去作用。某一路径受阻，整个免疫系统就会受到一定程度的阻力。例如，当溶菌酶因各种因素失活的时候，整个溶菌酶杀菌系统就会切断，从而加重其他路径的压力。多个出、入度的节点，说明是免疫通路的交汇点，此类节点出现问题，就会影响多条通路，甚至引起免疫系统的瘫痪。脱颗粒作用、吞噬作用、包囊作用等免疫作用的出入度较高，属于比较关键的节点；proPO、PO等免疫因子的出入度也高，属于免疫系统调节的关键因子，在整个甲壳动物免疫系统中具有重要的作用。根据实验中的结论，PO确实在免疫过程中充当关键的免疫枢纽的位置。
所建甲壳动物免疫网络的度分布表现为幂律形式，幂律是指节点具有的连接线与该节点的乘积是一个定值，也即是说，度数小的节点多，度数大的节点少。在所建立的甲壳动物免疫网络节点度的统计中，频率直方图具有“长尾”现象，即节点数存在多的度数小，度数大的节点数少。高连接的节点、度数较高称为中枢节点，在整个免疫系统的演变中，对免疫网络各项性质起着关键性的作用，缺少了这类节点，整个免疫系统能力急剧下降，甚至陷入瘫痪。而连接数较少的节点，只能左右个别路径，在整个免疫系统中影响范围相对较窄。
2.2作图
通过对51个免疫节点的相关关系生成了对应的邻接矩阵，作图得到甲壳动物免疫系统网络节点图（图4）。
3图中各种调节机制的分析
通过构建免疫系统节点间关系，揭示了各免疫因子之间的相互作用。在免疫系统节点图中，本文主要研究三个节点间的相互作用，利用物理原型解释免疫反应的相关过程。从图4可知免疫网络图的相关关系是稀疏的。从整个免疫系統节点图中，分离出多种子图。将其分为两大类：一种是四个及四个以上连续连接且无支路的节点组成的串型结构，如图5；一种是三个或三个以上节点组成一个或多个回路结构的回路结构图，如图6。此处主要讨论三个或四个节点的回路结构图。
3.1串型结构图的特点及作用
在免疫串型结构传递信号的过程中，信号逐渐减弱，像水波一样，在传播过程中越来越弱。只有持续的进行免疫刺激，才能发挥应有的免疫反应作用。免疫反应特点：免疫消除不良刺激，避免不必要的刺激对机体带来的损伤，保证整个网络系统的稳定性。
3.2回路结构图的特点及作用
在图论的知识中，三节点之间的相互作用总共反应类型可分为多种，比较常见的三节点生物关系图有前馈环和反馈环两种[4，7]，从免疫系统节点图中分离出以下9种免疫系统子图，如图6。其中1-7属于前馈环，8属于反馈环，9属于四节点的相互作用。
3.2.1前馈环
前馈环是由三个因子组成。第一个因子调节第二个因子，然后两个因子一起调节第三个因子，所以前馈环拥有2条平行的调节路径，即一条从第一因子到第三因子的直接路径以及一条第二因子到第三因子的间接路径。直接路径由一条边组成，而间接路径则由2条边级联而成，其中边代表的促进和阻抑作用相当于物理中的正信号和负信号。前馈环具有23种不同的形式。文中讨论了协调型前馈环，如图7；非协调型前馈环，如图8两种形式。
①协调型前馈环
在甲壳动物免疫中，PO既催化单酚形成双酚，又可以催化双酚形成醌。在此类免疫过程中，第一步反应生成双酚，随着双酚的积累，达到一定的阈值，PO和双酚作用生成醌。如图7，O的生成，需要M和N两个信号的共同作用，只有当M的作用时间足够长，产生的N积累，达到反应需要的阈值，才可生成O，生成O的过程必须要经过一个延迟。整个过程类似于信号敏感延迟元件，此类元件能防止短暂的输入信号的波动。甲壳动物所处的环境经常是高度波动的，短暂的刺激引发的反应，不仅消耗机体的能量，而且免疫反应产生的一些物质损害机体。这类元件的过滤作用有利于机体的稳定性。
②非协调型前馈环
在非协调型前馈环中，如图8，物质A的加入，促进物质B和C的产生，同时B对C具有抑制作用。表现在免疫系统中，加入免疫多糖，甲壳动物免疫体内过氧根离子的含量和SOD的含量均上升，最终过氧根离子的含量达到不对机体损害的阈值，趋于稳定。作用原理：SOD将过氧根离子转化为过氧化氢等物质，减少过氧根离子的浓度从而降低其对于机体的损害。此类回路结构具有信号敏感加速器的作用，如图9。
此类免疫作用结构能加速系统的响应时间，响应时间是动力学曲线达到稳态水平一半时所需的时间；如图9所示，非协调型的响应时间远低于简单调节的响应时间；此结构可以快速地达到最高速率。图8中，产生C的同时产生延迟中的阻抑物B来降低C的量，从而达到预期的稳态水平。在甲壳动物免疫中，此类结构可以使得反应迅速进行，提高免疫效率，同时产生的SOD又可以在极短的时间内，使得过氧根离子的含量降低，防止其长时间高浓度存在对甲壳动物机体造成伤害。信号敏感反映了甲壳动物免疫反应的及时性，即在极短的时间内对有害物质进行清除的能力。
3.2.2反馈环
反馈型网络表现出了非线性系统的动态状况，网络系统具有多种稳定状态，当网络从某种初始状态开始运动，生物网络系统收敛于某一种稳定的平衡状态[4]。甲壳动物免疫系统也一样，具有免疫平衡状态，并不断处于动态平衡的稳定状态。酚氧化酶原激活系统中，正是丝氨酸抑制剂的反馈调节机制，使得整个免疫系统处于稳定状态。
4總结
甲壳动物免疫系统错综复杂，各免疫分支途径之间相互协调合作，保证整个免疫系统的高效而稳定。（1）将图中免疫因子或免疫反应抽象为节点，节点间的连线表征了物质之间的关系，构建整个免疫系统网络节点图。（2）分析了网络中节点间的相关关系；并利用相关物
理数学模型，揭示了部分免疫因子对整个免疫系统的影响。（3）从系统的角度看待甲壳动物免疫，对整个免疫系统的高效稳定的免疫机制进行了物理性原理描述，以期探索更加高效的免疫反应机制。但是，对于整个系统网络数据的研究尚缺乏，对于多节点及其之间的机制，尚待研究；对于整个系统缺乏一个动态有效的免疫反应状态，需要进一步探讨；对于免疫增强剂，如免疫多糖和中草药具体作用强弱关系，需进一步确定。
参考文献：
[1]
DENG B，WANG ZP，TAO WJ，et al.Effects of polysaccharides from mycelia of Cordyceps sinensis on growth performance，immunity and antioxidant indicators of the white shrimp Litopenaeus vannamei[J].Aquaculture Nutrition.2014，21：173-179
[2] 陈昌福，陈萱，陈超然，等.水产甲壳动物的免疫防御机能及其免疫预防研究进展[J].华中农业大学学报.2003，22（2）：197-203
[3] 王孟孟，马寨璞，郭林豪，等.甲壳动物免疫系统网络关系模型[J].河北大学学报.2017，37（3）：288-294
[4] U.阿隆.系统生物学导论—生物回路的设计原理[M].王翼飞，等译.北京：化学工业出版社，2010
[5] 邹权，陈启安，曾湘祥，等.系统生物学的网络分析方法[M].西安：西安电子科技大学出版社，2015
[6] 左孝凌，李为鑑，刘永才.离散数学[M]. 上海：上海科学献出版社，2006
[7] 雷锦志.系统生物学+建模+分析+模拟[M]. 上海：上海科学技术出版社，2010
