鱼类部分白介素研究进展

    孙鹤+臧林+王秀利

    摘要：白介素是一种由免疫细胞分泌的，能够参与多种细胞间相互作用，增强机体免疫的细胞因子。近年来为了满足市场需求，渔业养殖密度大、品种多，导致病害发生频率逐年升高。为了避免抗生素等药物投放对水环境和食品安全的影响，学者们将目光放在了增强鱼体自身免疫及天然免疫蛋白产品上。本文综述了三种重要白介素在鱼类方面的研究进展，以期为鱼类健康养殖奠定基础。

    关键词：鱼类；白介素1；白介素2；白介素15

    白细胞介素（interleukins，IL）是一组多效小分子多肽，具有广泛的生物活性。早在1960年就有研究者发现被活化的T淋巴细胞能够产生一种可溶性的因子，且该因子具有活化B淋巴细胞及促进抗体产生的作用[1]，随后此类能够影响细胞免疫应答的因子相继被发现，也被不同研究者命以不同名字。直至1979年，国际淋巴因子专题讨论会将这类由单核巨噬细胞和T淋巴细胞分泌的，非特异性发挥免疫调节并在炎症反应中发挥重要作用的细胞因子统一命名为白细胞介素，以阿拉伯数字区分不同的因子[2]。过去认为白介素主要参与白细胞间相互作用，但是许多研究已表明，白细胞介素还参与造血干细胞、血管内皮细胞、造血细胞、纤维母细胞、神经细胞、成骨和破骨细胞等其它细胞的相互作用[3-4]。除此之外，白介素还参与致炎反应、并在免疫系统中起重要调控作用。其调控机制主要依靠免疫细胞表面的白介素受体能够特异地结合白介素，促进免疫细胞的活化、增殖及分化，从而行使调控功能[5]。这些功能表明，白介素在机体抵御外界病原的过程中扮演重要的角色。

    近年来，世界人口数量逐渐增加，预计至2050，世界人口数目会接近100亿之多，而鱼类将成为人类食物蛋白来源的重要产品之一[6]。然而，在鱼类养殖过程中，高密度和集约化的养殖模式使得病害的发生频率逐年增高[7]，长久以来对病害的防治多采用投放药物的方式，这种做法不仅会影响食品安全，同时也会引起水环境的污染，水环境的污染会使养殖状况更加恶化[8]。因此，安全有效的疾病预防措施就显得非常重要。由于白介素的免疫学功能，许多研究者们都将研究重点放在白介素功能的深入研究及异源表达制备重组蛋白产品上，本文主要介绍鱼类中几种重要的白介素的研究进展。

    1白介素1

    白介素1是一种可溶性的细胞因子，主要由血液中的单核细胞和组织中的巨噬细胞产生，在增强NK细胞杀伤活性及炎症反应中具有重要作用。

    首次发现白介素1（IL-1）是在1972年Gery等[9]研究老鼠和人类的淋巴细胞时，并将其命名为淋巴细白激活因子（lymphocyte activating factor，LAF）。IL-1家族共包括IL-1α，IL-1β，IL-18三种亚型。其中IL-1β是鱼类中第一个被鉴定的白介素，随后是IL-18[10]。最早在鱼类体内发现IL-1是1986年，Sigel等[11]发现鲶鱼外周血淋巴细胞能对人IL-1作出应答反应，并从鲤鱼上皮细胞中分离到了IL-1活性物质。1999年Zou等[12]在虹鳟体内首次发现并克隆了IL-1β基因，这也是第一个被克隆的鱼类IL-1基因。通过对虹鳟IL-1β基因进行序列分析还发现该基因cDNA全长1 343 bp，与人类IL-1β氨基酸序列

    相似度达49%～56%。仅包括六个外显子和五个内含子，与哺乳动物相比不仅数目上少而且内含子长度也短[13-14]。在此研究基础上，Zou等人后续又对IL-1β进行了更加细致的研究。RT-PCR显示存在两个额外的IL-1β基因的不完全剪接体，说明其转录产物除了包括正常的剪接产物外，还存在两种保留部分内含子的不完全剪接方式。在此之后Pleguezuelos等[15]便得到了虹鳟IL-1β基因的第二个克隆，两个IL-1β基因之间差异较小，仅在外显子和内含子的大小上有所区别，两者都没有IL-1转换酶切割位点。2012年，杨莹莹等[16]利用RACE技术从大鳍鳠中克隆出IL-1β基因全cDNA序列，共计1 196 bp，其中ORF区域共计888 bp，编码296个氨基酸。经过信号肽分析软件分析发现，大鳍鳠IL-1β基因不存在信号肽序列，也不存在ICE（interleukin-1 convetingenzylne）切割位点。2017年，段荟芹[17]等以齐口裂腹鱼脾脏 cDNA为模板成功克隆出了IL-β基因。齐口裂腹鱼IL-1β基因全长1252 bp，编码276个氨基酸，其氨基酸序列与目前报道的鲤的氨基酸同源性最高，达81%左右。信号肽预测结果显示齐口裂腹鱼IL-1β基因编码的蛋白质序列未发现信号肽序列及IL-1转换酶切割位点。组织表达谱结果显示，IL-1β在该鱼的脾脏、肾脏中表达量最高，在心脏、肌肉和肝脏中次之 ；在肠道中最弱。

    除此之外，在斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）、黄鳍鲷（Acanthopagrus latus）、黑石斑鱼（Sebastes schlegeli）及斑点叉尾鮰中均被克隆出了IL-1β基因[18-21]，其中斑点叉尾鮰中成功克隆出了两种IL-1β基因。

    这些鱼类IL-1β基因被成功克隆后，有学者对IL-1β表达调控进行研究，结果显示，IL-1β在机体免疫中是一把双刃剑，在含量极微的状况下能够增强机体免疫，但是在表达量增加后就会损伤以神经细胞为最显著的许多细胞[22]。总的来说这些研究均极大地促进了鱼类分子免疫学的发展。

    2白介素2

    白介素2（interleukins-2，IL-2）是在研究T细胞长时间生长的条件下发现的一类能够在免疫细胞和白细胞之间相互作用的细胞因子[23]，主要由活化的T淋巴细胞分泌。研究表明IL-2与含有α，β，γ三条链的复杂受体IL-2R结合后触发胞内信号反应，从而在T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞的复制与分化过程中发挥重要作用[24-25]。由于白介素2在机体免疫和获得性免疫中的重要地位，使其倍受研究者们重视[26]。白介素-2最初是由Morgan等于1976年在外周淋巴血细胞内发现的[27]，由于当时发现其具有促进T细胞分泌并维持其分裂的作用，便将其命名为T细胞生长因子（TCGF）[28]。直至日内瓦免疫学大会上才将其正式命名为白细胞介素-2[29]。经过一系列研究发现，白介素-2在免疫系统中扮演重要角色，其主要作用为：促进CD4+T细胞，CD8+T细胞，B淋巴细胞和NK细胞的增殖与分化，增强抗原呈递作用；活化自然杀伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞；以及促进其他细胞因子释放等[30]。1984年Caspire等[31]在經过PHA刺激的鲤鱼外周血淋巴细胞培养液中发现了淋巴细胞生长促进因子，这也是首次在鱼类中发现IL-2。1993年Xia等[32]证实了在经过PHA刺激的日本鳗鲡鱼外周血淋巴细胞培养液中同样存在IL-2活性物质。陆续至2001年，研究者们在草鱼等鱼类体内均发现了IL-2活性物质[33]。但是人们对鱼类IL-2在分子水平上的研究仍然相对滞后。直至2005年，红鳍东方鲀IL-2基因成为世界上第一个被克隆出的IL-2基因，其基因组包括四个外显子和三个内含子，编码149个氨基酸。该基因二级结构包含三个α螺旋，其中含有由两个半胱氨酸形成的二硫键。红鳍东方鲀IL-2基因序列与其他已知的IL-2基因序列的同源性仅24%～34%[25]。从此开始，鱼类IL-2基因水平上的研究才正式起步。2008年，王建平等[34]在国内首次克隆了红鳍东方鲀IL-2基因。2009年，P.D az-Rosales等成功克隆了虹鳟鱼IL-2基因，并将该基因在大肠杆菌中进行表达制备出重组IL-2蛋白，重组蛋白免疫鱼体结果表明，该蛋白能够诱导STAT5和Blimp-1两个转录因子的表达，这两个转录因子参与IL-2信号转导（在哺乳动物中已被证实）。该结果是迄今为止第一份关于鱼体中验证鱼类重组IL-2蛋白的活性的报告[35]。

    综合上述研究结果可知，至今已有多种鱼类IL-2基因被克隆，这些序列为今后利用异源表达系统制备具有活性的天然免疫蛋白产品奠定了基础。

    3白介素15

    白介素15（IL-15）最初是由Grabstei等[36]从猿的肾细胞条件培养上清液中发现的分子质量约14～15 KD，能够维持CTLL-2细胞增殖的细胞因子。该功能与IL-2颇为相似，对比两序列发现，它们同属于四螺旋细胞因子家族，并共有相同的受体组成元件。根据这一相似处，研究者们参照IL-2的结构利用转角构建出了IL-15的三级结构模型，IL-15的三级结构显示共包含两个二硫键，且其中一个（cys44-cys88）与IL-2的唯一二硫键类似[37]。虽然在体外实验中IL-2与IL-15有着诸多相似之处，但是Kennedy等[38]在小鼠中利用基因敲除实验证明：敲除IL-2基因后，小鼠免疫能力下降，但NK细胞数目不受影响；敲除IL-15基因后NK细胞缺失，记忆CD8+T细胞减少。因此说明， IL-15在机体内部免疫系统中具有独立的功能，其作用也是不可替代的。

    鱼类是同时具有先天性免疫和获得性免疫的较低等的脊椎动物，虽然在生物进化造成了鱼类与其他高等脊椎动物的差别，使其获得性免疫系统变得并不完善，但是也仍然具备了一定水平的获得性免疫系统。 IL-15及其他四螺旋细胞因子可能在鱼类中参与了免疫功能调控。2006年，Bei等[39]成功的克隆了红鳍东方鲀IL-15基因。在此研究的基础上，马普等[40]按照已有的成熟肽序列设计引物，成功克隆并用PET系列载体进行了表达，并对表达产物进行了活性验证，结果证实该种方法获得的重组红鳍东方鲀IL-15蛋白是具有生物活性的，今后可用于红鳍东方鲀健康养殖中。除此之外，方玮等[41]采用Race的方法成功克隆了黑青斑河豚IL-15基因的cDNA全长，共计1 046 bp，同样将其克隆到PET系列表达载体进行表达并得到了纯化的重组黑青斑河豚IL-15蛋白。后续的组织表达谱结果表明鱼类IL-15可由多种细胞产生，组织分布较为广泛。

    对鱼类等低等脊椎动物中IL-15等具有四螺旋的细胞因子的研究有助于我们更加全面更为透彻的理解四螺旋细胞因子家族起源和进化过程，以及具有该结构的脊椎动物类似基因和功能分化。

    4展望

    随着研究的不断深入以及基因工程技术、分子生物学技术的不断完善，鱼类白介素微观世界的面纱已被慢慢揭开， 除了上述几种白介素在不同种鱼类中的研究外，还将会在新品种鱼类中发现已知或未知的新型白介素，形成一个系统并完善的鱼类白介素体系。这将为今后鱼类的健康养殖、绿色养殖、低成本养殖提供更多有价值的参考信息。

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    （收稿日期：2017-03-01）