一株海水氨氮降解菌的分离、筛选与鉴定

    刘世昌 李彦芹 李凤超 康现江

    摘 要:从秦皇岛对虾养殖池采集底泥,通过富集、分离、纯化,筛选出4株具有氨氮降解能力的菌株,其中菌株F1508对氨氮的去除能力最强,其24 h和48 h的氨氮去除率分别为81.87%和97.74%。对菌株F1508进行了生理生化鉴定和16S rRNA同源性序列分析,结果表明菌株F1508与迈索尔节杆菌Arthrobacter mysorens序列相似性为99%。

    关键词:氨氮降菌解;筛选;生理生化鉴定

    随着水产养殖业的不断发展,养殖水体污染不断增加[1]。水体中氨氮是危害水产养殖动物健康生长的主要理化因子之一[2],研究表明生物脱氮是去除水体氨氮污染物最有效方法之一[3]。一直以来,硝化-反硝化模式是处理含氮污染废水的主要路线,在硝化过程中,硝化细菌在起主要作用[4],而硝化作用过程中占据主要地位的是自养型硝化细菌[5]。近年来研究表明,有些异养微生物也能进行硝化作用,如芽孢杆菌属(Bacillus sp.)[6]、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)[7]、副球菌属(Paracoccus sp.)[8]等。

    本实验从对虾养殖池底泥取得样品,通过富集、分离、纯化,筛选出一株具有较强去除氨氮能力的异养硝化细菌F1508,对其进行生理生化鉴定和16S rRNA 同源性序列分析,以期为该菌株在生产中的应用提供理论支持。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 样品来源 实验样品采集于秦皇岛对虾养殖池底泥。

    1.1.2 培养基

    LB培养基(g/L):牛肉膏3.0,蛋白胨10.0,NaCl 30.0,pH:7.0~7.2。

    富集培养基(g/L):柠檬酸钠5.0,(NH4)2SO4 2.0,K2HPO4 1.0,KH2PO4 1.0,MgSO4·7H2O 0.2,NaCl 30.0,pH:7.0~7.2。

    异养硝化培养基(g/L):(NH4)2·SO4 0.47,柠檬酸钠8.2,NaCl 30,pH:7.0~7.2;50mL维氏盐溶液。

    维氏盐溶液(g/L):K2HPO4·3H2O 5.0,FeSO4·7H2O 0.05,MgSO4·7H2O 2.5, MnSO4·4H2O 0.05。

    1.2 方法

    1.2.1 氨氮降解菌的富集分离 分装100 mL 富集培养基于500 mL 三角瓶,加入玻璃珠数粒,灭菌后加入25 mL 泥样,20 ℃,150 r/min 振荡培养2~3 d。吸取富集液25 mL 接入新的富集培养基中,如上条件培养2~3 d,反复操作3次,以富集目的菌。

    取10 mL 上述富集培养液至90 mL 无菌水中,梯度稀释,涂布于LB平板,20 ℃培养2~3 d。从LB平板上挑取单菌落,经过5輪划线,纯化得到纯培养物,转接到试管斜面。斜面培养2~3 d 备用。

    1.2.2 氨氮降解菌筛选 接斜面菌种2环到装有100 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中,150 r/min活化24 h;再将活化的菌液按5%的接种量接到装有100 mL的异养硝化培养基的250 mL的三角瓶,20 ℃,150 r/min摇瓶48 h,每隔24 h测定一次氨氮浓度。

    采用纳氏试剂分光光度法[9]测定氨氮浓度。测定氨氮浓度时,培养液需8 000 r/min 离心10 min,吸取上清液测定。

    脱氮率(A)的计算公式:A=(c1-c2)/c1,其中c1为体系中所添加氨氮的初始浓度,c2为培养后体系中剩余氨氮浓度。

    1.2.3 菌株鉴定 形态及生理生化鉴定:20 ℃培养48 h,观察菌落形态;革兰氏染色显微镜下观察菌体形态,生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[10]。

    16S rDNA 序列测定:将筛选得到的菌株保存斜面送往北京美吉生物医药有限公司测序。

    1.2.4 生长曲线的测定 从斜面培养基上挑取一环到装有30 mL LB 培养基的三角瓶中活化12 h,将活化好的按5%的接种量接种到装有100 mL LB 培养基三角瓶中,每隔3 h测定OD值。

    2 结果与分析

    2.1 氨氮降解菌的富集分离与筛选

    将对虾养殖池底泥接入富集培养基进行富集培养,之后再接入LB培养基,经过5轮划线培养进行分离,最终获得能在LB固体培养基上生长的纯菌株4株,分别编号为F1502、F1504、F1507、F1508。

    将分离得到4株菌株接入异养硝化培养基中,培养后测定各组培养基中氨氮的浓度,计算脱氮率,见表1。如表1所示,菌株F1508对氨氮降解效率最高,24 h和48 h的氨氮去除率分别为81.87%和97.74%,因此作为后续研究对象。

    2.2 菌株F1508鉴定

    菌株F1508形态特征:细胞呈杆状,革兰氏阳性,菌落圆形,边缘整齐规则,不透明,菌落浅黄色,菌落直径0.5~1 mm。菌株F1508的生理生化特征见表2。菌株F1508能够利用葡糖糖和蔗糖发酵,能够产生淀粉酶,利用柠檬酸盐,不能分解明胶。该菌株能与H2O2反应产生气泡,呈接触酶阳性。该菌株在吲哚、VP色素实验中,吲哚实验为阴性,VP实验为阳性。氧化酶实验呈阴性。

    分离菌株F1508经16S rRNA测序后与菌株Arthrobacter mysorens (GenBank中的登录号为AJ639831.1)进行同源性比较,同源性达99%,结合菌株的形态学及生理生化实验结果,可初步判定所筛选菌株F1508为节杆菌属(Arthrobacter sp.)。

    2.3 生长曲线

    菌株F1508的生长曲线见图1。由图1可见,菌株F1508在0~3 h处于调整期,OD值呈缓慢增长的趋势,在LB培养基中经过短暂适应,3 h后进入对数生长期,OD值呈对数增长,20 h后进入稳定期,OD值变化趋于平缓。

    图1 菌株F1508的生长曲线

    3 讨论与结论

    水产养殖中氨氮的积累与众多的微生物代谢活动相关,不仅影响鱼类等水生生物的生长,甚至会导致水体富营养化,引起水质恶化,污染环境。

    近年来,国内外陆续有大量氨氮降解菌被分离出来,多应用于生活和工业污水处理,但水产养殖中可以应用的脱氮菌株相对较少。如廖小红等从高溶解氧條件下驯化的SBR曝气反应器中筛选出的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WXZ-8的氨氮去除率最高达96.06%[11]。研究表明,能够进行硝化作用的菌株多为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)[7]、副球菌属(Paracoccus sp.)等,然而在节杆菌属中具有氨氮降解能力的细菌报道相对较少。

    目前我国海水养殖废水生物处理研究大多还停留在实验室阶段,水产养殖应用方面相对较少。因此针对河北省水产养殖特定情况,分离筛选出适应性强的本土土著菌群,可显著提高微生物的数量,快速生产出适宜净化本土水质环境的菌群,提高菌群的成活率、利用率和处理效果。

    本实验在好氧条件下,分离筛选出1株高效氨氮降解菌F1508,去除率为97.74%。

    经16S rDNA 同源性分析及形态观察、生理生化鉴定,初步判定菌株F1508属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)。

    参考文献:

    [1]

    张峰峰,谢凤行,周可,等.一株高氨氮去除能力菌株的分离筛选及鉴定[J].华北农学报,2014,29(4):221-225

    [2] 张家顺,苏真真,薛菲菲,等.2株氨氮去除菌的分离鉴定及去除率影响因素分析[J].水产学报,2015,39(10):1549-1557

    [3] 李彦芹,李春青,管鹏悦,等.一株好氧反硝化菌的分离鉴定及脱氮条件研究[J].环境科学与技术,2015(7):33-37

    [4] 刘芳芳,周德平,吴淑杭,等.养殖废水中异养硝化细菌的分离筛选和鉴定[J].农业环境科学学报,2010,29(11):2232-2237

    [5] 王弘宇,马放,杨开,等.两株异养硝化细菌的氨氮去除特性[J].中国环境科学,2009,29(1):47-52

    [6] 郭强,杨云龙,陈宏平.一株地衣芽孢杆菌异氧硝化-好氧反硝化特性研究[J].环境科学与技术,2015(7):38-42

    [7] Koschorreck M,Moore E,Conrad R.Oxidation of nitric oxide by a new heterotrophic Pseudomonas sp.[J].Archives of Microbiology,1996,166(1):23-31

    [8] 王洁,蓝江林,刘波.一株异养硝化细菌的分离鉴定和脱氮特性研究[J].农业环境科学学报,2013,32(4):805-810

    [9] 国家环境保护总局.水和废水监测分析方法[M].第四版.北京:中国环境科学出版社,2002

    [10] 东秀珠,季妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:294-348

    [11] 廖小红,汪苹,刁惠芳,等.蜡状芽孢杆菌WXZ-8的异养硝化/好氧反硝化性能研究[J].环境污染与防治,2009,31(7):17-20

    (收稿日期:2016-11-23)

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