嗜酸性氧化亚铁硫杆菌代谢产物的常压化学电离质谱分析
梁钜超 +屈颖 +于苗苗 +徐玲玲 +刘亚洁+孙占学 陈焕文
摘要 本研究以721矿和745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌为研究对象，采用常压化学电离质谱直接分析其代谢产物，分别考察了顶空采样（Headspacesampling）、界面采样（Interfacesampling）和中性解吸采样（Neutraldesorptionsampling）3种进样方式对电离效果的影响。在优化条件下，常压化学电离质谱对微生物纯菌种和混合菌种的代谢产物均具有良好的分析能力，可根据获得的代谢产物指纹谱图结合主成分分析（PCA）方法和聚类分析（CA）方法区分2个放射性强弱不同区域共4类嗜酸性微生物样品，并对主要胺类、酯类等代谢成分进行串联质谱鉴定，为耐辐射微生物的相关研究提供了一种可借鉴的分析方法。
关键词嗜酸性氧化亚铁硫杆菌；常压化学电离；代谢产物；质谱分析
1引言
嗜酸性微生物是指可在极端酸性环境（pH<3.5）中生长良好的微生物，多分布在酸性矿水、酸性热泉、火山湖、地热泉等极端酸性环境中，含硫化物矿物环境中亦有较多分布[1～3＼]。大部分已知的嗜酸性微生物分离自上述酸性环境，并被用于生物湿法冶金，如氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxidans，At.f）、氧化硫硫杆菌（Acidithiobacillusthioxidans，At.t）等，既是典型的嗜酸菌，也是典型的化能自养型微生物。这类微生物能氧化某种特定的无机物，并利用所产生的化学能还原二氧化碳和生成有机碳化合物[4～6＼]，At.f能将Fe2+氧化为Fe3+，获得能量而生长，而Fe3+又是冶金工艺中良好的氧化剂，At.t可以低价硫或单质硫为能源并生成硫酸，运用于冶金工艺中可以降低酸耗，大大节约生产成本[7～9＼]。同时，由于贫矿、尾矿、品外矿的增加，微生物浸矿工艺已成为许多地区首选的浸矿技术。因此，通过微生物代谢产物研究生物冶金中目标矿体环境中嗜酸性微生物特异性，对目标菌种的筛选及构建生物浸出体系中优势冶金菌群具有很重要的指导作用[10＼]。
基于代谢产物对微生物种类进行识别鉴定具有快速无损的优势，开发微生物代谢产物快速检测的方法，已成为了热门的研究课题。目前，微生物代谢产物的分析方法很多，传统方法的包括化学传感、光谱学、“电子鼻”、离子迁移谱等[11＼]。由于质谱技术具有较高的化学特异性，得到越来越广泛的应用，但传统的质谱方法常与气相色谱或液相色谱联用，样品预处理较复杂，耗时较长。直接质谱分析技术能够在无需样品预处理的情况下对复杂基体样品中痕量待測物进行快速分析，因此得到了极大的关注和广泛的应用[12＼]。Liang等[13＼]利用常压化学电离，无需任何预处理，对临床上5种常见的致病菌进行指纹谱图分析，并得到其挥发性代谢产物生物标志物作为快速识别的信号。Yang等[14＼]利用表面解吸常压化学电离（SDAPCI）质谱法，在无需样品预处理的情况下，直接测定了奶粉中三聚氰胺，实现了奶粉中三聚氰胺的半定量和批量检测。常压化学电离质谱法作为一种常用的直接质谱分析技术，通过高电压的针尖电晕放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+和O+等离子，这些离子与待测物分子发生离子分子反应，使待测物分子离子化，反应过程包括由质子转移和电荷交换产生正离子，质子脱离和电子捕获产生负离子等[15＼]。该方法对易挥发半极性的小分子化合物具有较高的灵敏度，特别适宜在环境监测和生物表征中发挥作用。本实验以721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌及745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌为研究对象，比较了顶空、界面、中性解吸3种进样方式的特点，分析了嗜酸性微生物代谢成分，并结合主成分分析（PCA）和聚类分析（CA）对不同矿区的嗜酸性微生物进行快速区分。
2实验部分
2.1仪器与试剂
常压化学电离源为本实验室搭建[13＼]；LTQXL线性离子阱质谱仪并配有Xcalibur数据处理系统（美国ThermoScientific公司）。
微生物样品：721矿嗜酸性混合菌种分离自721矿生物堆浸浸出液；721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种由721矿嗜酸性混合菌种进一步纯化得到；745矿嗜酸性混合菌种富集分离自745矿生物堆浸矿渣；745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种由745矿嗜酸性混合菌种进一步纯化得到。
9k培养基：（NH4）2SO43.0g/L；KCl0.1g/L；K2HPO40.5g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；Ca（NO3）20.01g/L；FeSO4·7H2O25g/L；二次蒸馏水1000mL。菌种选育和样品培育在东华理工大学铀矿生物溶浸工艺实验室提供的帮助下完成。
2.2微生物培育
所有微生物样品活化之后以20%接种至9k培养基，在35℃条件下120r/min摇床培养24h后取样进行质谱分析。
2.3常压化学电离实验参数
常压化学电离质谱装置图如图1所示。实验室环境为恒温恒湿条件，温度25℃，湿度45%。为使样品分子最大限度地与初级带电离子进行碰撞并发生反应，参考实验室气体检测实验优化条件为：放电针与进样口角度α=30°，样品通道口与质谱口水平距离为l=6mm。设置检测模式为正离子模式，质量范围为100～400Da，放电针电压为4kV，离子传输管温度为150℃，样品载气（氮气，纯度为99.99%），压力为0.1MPa，其他条件为系统自动优化。
3结果与讨论
3.1常压化学电离3种采样方式对电离效率影响
为了考察采样方法对细菌代谢产物检测结果的影响，分别采用了顶空采样、界面采样和中性解吸采样等3种方式进行代谢产物的检测（图1），3种方法均利用N2将培养体系中的物质萃取出来进入质谱进行检测，区别之处在于培养瓶中N2进气口与液面间的距离不同。比较3种不同的进样方式的检测结果，
以745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌为例得出其指纹图谱如图2所示，检测出主要成分质荷比m/z119，139，223，295等区别不大，尤其是顶空采样与界面采样，但是中性解吸采样谱图c与前两种采样方式谱图相比，所得谱图信号略有增加，可能是由于随着N2进样口与液面间距离不断缩短，气体从培养基中萃取的物质也越多，采取中性解吸采样检测到的可能不仅仅是挥发性代谢产物，培养基和培养基中一些非挥发性的代谢产物也有可能被检测到，所以得到了较多复杂的质谱信号。
3.2嗜酸性微生物代谢产物指纹谱图分析
分别对721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种、721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌混合菌种、745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种和745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌混合菌种代谢产物进行质谱分析，得到指纹谱图如图3所示。比较4种样品指纹谱图可知，4种微生物都存在明显的m/z119，139，223，295等离子峰，说明4种微生物样品都会产生一些相同的代谢产物，且相对强度较为一致。
对比721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种和混合菌种，混合菌种中在质荷比m/z158，195，223，295等处质谱信号强度较721矿嗜酸性混合菌种均有不同程度的升高，且在m/z100～300之间出现了一些强度较小的离子峰，如m/z244等，而721纯菌种则相对干净。同样的现象在745矿纯菌种和混合菌种也存在。可能的原因是由于混合菌种中含有微生物种类较多从而产生的化学成分比较复杂，导致在此质荷比区间差异明显。而相比于745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种，721矿纯菌种的m/z119，173信号强度更大，另外，721矿纯菌种还出现m/z158，295，391质谱信号峰，未见m/z301的质谱信号峰。为了快速识别鉴定嗜酸性微生物的种类，选择721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种中丰度较高的一些物质如m/z119等离子进行串联质谱鉴定。
图4为通过碰撞诱导解离实验（CID）得到的串联质谱图。m/z119离子的二级质谱图如图4a所示，产生主要碎片离子m/z91，为母体离子丢失中性碎片C2H4形成的，可能与酯类物质丢失碎片规律一致，推测m/z119为一酯类物质，通过文献和标准品串联质谱进一步确认了m/z119为质子化的乳酸乙酯＼[CH3CH（OH）COOCH2CH3+H＼]+。m/z151的二级质谱图如图4b所示，产生主要碎片离子m/z133，掉落碎片18，同时产生m/z105离子碎片，由此推测其为质子化苯甲酸乙酯，与参考文献对比进一步确认该化合物[16＼]。m/z135的二級质谱图和三级质谱图如图4c所示，产生主要碎片离子为m/z107，因此推测m/z135为酰胺物质，然后通过标准品的三级质谱图和文献对比进一步确认了m/z135为离子化的乙酰苯胺＼[CH3CONHC6H5＼]+。m/z136的二级谱图和三级谱图如图4d所示，与m/z135的串联谱图类似，由乙酰苯胺质子化之后得到＼[CH3CONHC6H5+H＼]+。
3.3常压化学电离质谱主成分分析（PCA）
主成分分析（PCA）在复杂样品的分析检测中已得到广泛地应用[17～20＼]。为了更直观地揭示嗜酸性微生物之间的差异和进一步论证实验结果的正确性，本研究通过Matlab软件将采集的大量质荷比在m/z100～400范围内的一级质谱数据进行规一化处理，利用“Princomp”函数对每一类样品数据进行PCA分析，自动得到各个主成分的得分图及相应的载荷图。
对721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种和混合菌种指纹谱图进行PCA分析（图5a），结果表明，两类生物样品可以得到很好的区分。由3个主成分载荷分布图（图5b）可见，m/z135，136，158，223，295，296等对区分两种样品的贡献较大，说明这些物质在两种样品中的含量存在有较大差异。同样，对745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种和混合菌种指纹谱图进行PCA分析，得到主成分分析图和载荷图如图5c和5d所示。从图5c可见，PC1，PC2和PC3对方差贡献率分别为51.5%，29.8%和7.1%，三者之和达到88.4%，因而这3个主成分包含了被分析样品的绝大部分信息，同时两种样品能够被明显区分开。
3.4常压化学电离质谱聚类分析（CA）
聚类分析是一种静态数据分析的统计学方法，目前已广泛应用于模式识别和图像分析等领域。实验将正离子模式检测下的嗜酸性微生物的质谱数据（已进行PCA分析）导入Matlab软件的聚类分析程序中进行分析，结果如图6所示。嗜酸性微生物样本为120个，其中721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种、721矿嗜酸性混合菌种、745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种、745矿嗜酸性混合菌种各30个。
分析结果表明，721矿纯菌种与745矿纯菌种样本具有一定的相似度，说明在不同矿区中同一纯菌种代谢非常接近，而721矿混合菌种代谢产物中包含了部分纯菌种代谢产物，表明混合菌种中包含有嗜酸性氧化亚铁硫杆菌。721矿混合菌种与745矿混合菌种差异较大，说明不同矿区的混合菌种代谢具有较大的差异。从图6可见，A，B，C，D分别自聚成一类，反应不同嗜酸性微生物样品被区分开，这与PCA的分析结果相印证。
4结论
本研究采用常压化学电离技术，在无需样品预处理的情况下，直接快速分析不同矿区嗜酸性氧化亚铁硫杆菌代谢产物，从而高通量地实现对微生物的快速识别鉴定。尤其是对于化能自养型微生物的快速识别能够实现对目标菌种的筛选及构建生物浸矿体系具有重要的指导作用，有望在生物冶金中得到很好地应用。同时，本方法具有操作简单、灵敏度高、重现性好、分析速度快等特点，为微生物的快速识别和鉴定提供了一种可靠的途径。
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AbstractAmethodforrapiddeterminationofacidithiobacillusferrooxidans（At.f）metabolitesbyambientcoronadischargeionizationmassspectrometrywasestablished.Threeinjectionmodeswereappliedtostudytheeffectssuchasheadspacesampling，interfacesamplingandneutraldesorptionsampling.Undertheoptimizedexperimentalconditions，themetabolites，suchassmallmoleculeestersandaminesweredetectedbyambientcoronadischargeionizationmassspectrometryandconfirmedusingtandemmassspectrometry（MS/MS）.Furtherprincipalcomponentanalysis（PCA）andclusteranalysis（CA）ofthemassspectrometricresultsallowedaconfidentdiscriminationofdifferentbacterialsamples.Ambientcoronadischargeionizationmassspectrometryhastheadvantagesofnosamplepretreatment，convenientoperation，highsensitivityandhighanalyticalspeed，whichwillbeanattractivemethodtorapidlyidentificationofmicroorganisms.
KeywordsAcidithiobacillusferrooxidans；Ambientcoronadischargeionization；Metabolites；Massspectrometry
HQWT6JY（Received12July2016；accepted2September2016）
ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.81460327），ProgramforChangjiangScholarsandInnovationResearchTeaminUniversities（PCSIRT）（No.IRT13054），ScienceandtechnologysupportprogramofJiangxiProvince（Nos.20152ACB21013，20152ACG70014）.
摘要 本研究以721矿和745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌为研究对象，采用常压化学电离质谱直接分析其代谢产物，分别考察了顶空采样（Headspacesampling）、界面采样（Interfacesampling）和中性解吸采样（Neutraldesorptionsampling）3种进样方式对电离效果的影响。在优化条件下，常压化学电离质谱对微生物纯菌种和混合菌种的代谢产物均具有良好的分析能力，可根据获得的代谢产物指纹谱图结合主成分分析（PCA）方法和聚类分析（CA）方法区分2个放射性强弱不同区域共4类嗜酸性微生物样品，并对主要胺类、酯类等代谢成分进行串联质谱鉴定，为耐辐射微生物的相关研究提供了一种可借鉴的分析方法。
关键词嗜酸性氧化亚铁硫杆菌；常压化学电离；代谢产物；质谱分析
1引言
嗜酸性微生物是指可在极端酸性环境（pH<3.5）中生长良好的微生物，多分布在酸性矿水、酸性热泉、火山湖、地热泉等极端酸性环境中，含硫化物矿物环境中亦有较多分布[1～3＼]。大部分已知的嗜酸性微生物分离自上述酸性环境，并被用于生物湿法冶金，如氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxidans，At.f）、氧化硫硫杆菌（Acidithiobacillusthioxidans，At.t）等，既是典型的嗜酸菌，也是典型的化能自养型微生物。这类微生物能氧化某种特定的无机物，并利用所产生的化学能还原二氧化碳和生成有机碳化合物[4～6＼]，At.f能将Fe2+氧化为Fe3+，获得能量而生长，而Fe3+又是冶金工艺中良好的氧化剂，At.t可以低价硫或单质硫为能源并生成硫酸，运用于冶金工艺中可以降低酸耗，大大节约生产成本[7～9＼]。同时，由于贫矿、尾矿、品外矿的增加，微生物浸矿工艺已成为许多地区首选的浸矿技术。因此，通过微生物代谢产物研究生物冶金中目标矿体环境中嗜酸性微生物特异性，对目标菌种的筛选及构建生物浸出体系中优势冶金菌群具有很重要的指导作用[10＼]。
基于代谢产物对微生物种类进行识别鉴定具有快速无损的优势，开发微生物代谢产物快速检测的方法，已成为了热门的研究课题。目前，微生物代谢产物的分析方法很多，传统方法的包括化学传感、光谱学、“电子鼻”、离子迁移谱等[11＼]。由于质谱技术具有较高的化学特异性，得到越来越广泛的应用，但传统的质谱方法常与气相色谱或液相色谱联用，样品预处理较复杂，耗时较长。直接质谱分析技术能够在无需样品预处理的情况下对复杂基体样品中痕量待測物进行快速分析，因此得到了极大的关注和广泛的应用[12＼]。Liang等[13＼]利用常压化学电离，无需任何预处理，对临床上5种常见的致病菌进行指纹谱图分析，并得到其挥发性代谢产物生物标志物作为快速识别的信号。Yang等[14＼]利用表面解吸常压化学电离（SDAPCI）质谱法，在无需样品预处理的情况下，直接测定了奶粉中三聚氰胺，实现了奶粉中三聚氰胺的半定量和批量检测。常压化学电离质谱法作为一种常用的直接质谱分析技术，通过高电压的针尖电晕放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+和O+等离子，这些离子与待测物分子发生离子分子反应，使待测物分子离子化，反应过程包括由质子转移和电荷交换产生正离子，质子脱离和电子捕获产生负离子等[15＼]。该方法对易挥发半极性的小分子化合物具有较高的灵敏度，特别适宜在环境监测和生物表征中发挥作用。本实验以721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌及745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌为研究对象，比较了顶空、界面、中性解吸3种进样方式的特点，分析了嗜酸性微生物代谢成分，并结合主成分分析（PCA）和聚类分析（CA）对不同矿区的嗜酸性微生物进行快速区分。
2实验部分
2.1仪器与试剂
常压化学电离源为本实验室搭建[13＼]；LTQXL线性离子阱质谱仪并配有Xcalibur数据处理系统（美国ThermoScientific公司）。
微生物样品：721矿嗜酸性混合菌种分离自721矿生物堆浸浸出液；721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种由721矿嗜酸性混合菌种进一步纯化得到；745矿嗜酸性混合菌种富集分离自745矿生物堆浸矿渣；745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种由745矿嗜酸性混合菌种进一步纯化得到。
9k培养基：（NH4）2SO43.0g/L；KCl0.1g/L；K2HPO40.5g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；Ca（NO3）20.01g/L；FeSO4·7H2O25g/L；二次蒸馏水1000mL。菌种选育和样品培育在东华理工大学铀矿生物溶浸工艺实验室提供的帮助下完成。
2.2微生物培育
所有微生物样品活化之后以20%接种至9k培养基，在35℃条件下120r/min摇床培养24h后取样进行质谱分析。
2.3常压化学电离实验参数
常压化学电离质谱装置图如图1所示。实验室环境为恒温恒湿条件，温度25℃，湿度45%。为使样品分子最大限度地与初级带电离子进行碰撞并发生反应，参考实验室气体检测实验优化条件为：放电针与进样口角度α=30°，样品通道口与质谱口水平距离为l=6mm。设置检测模式为正离子模式，质量范围为100～400Da，放电针电压为4kV，离子传输管温度为150℃，样品载气（氮气，纯度为99.99%），压力为0.1MPa，其他条件为系统自动优化。
3结果与讨论
3.1常压化学电离3种采样方式对电离效率影响
为了考察采样方法对细菌代谢产物检测结果的影响，分别采用了顶空采样、界面采样和中性解吸采样等3种方式进行代谢产物的检测（图1），3种方法均利用N2将培养体系中的物质萃取出来进入质谱进行检测，区别之处在于培养瓶中N2进气口与液面间的距离不同。比较3种不同的进样方式的检测结果，
以745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌为例得出其指纹图谱如图2所示，检测出主要成分质荷比m/z119，139，223，295等区别不大，尤其是顶空采样与界面采样，但是中性解吸采样谱图c与前两种采样方式谱图相比，所得谱图信号略有增加，可能是由于随着N2进样口与液面间距离不断缩短，气体从培养基中萃取的物质也越多，采取中性解吸采样检测到的可能不仅仅是挥发性代谢产物，培养基和培养基中一些非挥发性的代谢产物也有可能被检测到，所以得到了较多复杂的质谱信号。
3.2嗜酸性微生物代谢产物指纹谱图分析
分别对721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种、721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌混合菌种、745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种和745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌混合菌种代谢产物进行质谱分析，得到指纹谱图如图3所示。比较4种样品指纹谱图可知，4种微生物都存在明显的m/z119，139，223，295等离子峰，说明4种微生物样品都会产生一些相同的代谢产物，且相对强度较为一致。
对比721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种和混合菌种，混合菌种中在质荷比m/z158，195，223，295等处质谱信号强度较721矿嗜酸性混合菌种均有不同程度的升高，且在m/z100～300之间出现了一些强度较小的离子峰，如m/z244等，而721纯菌种则相对干净。同样的现象在745矿纯菌种和混合菌种也存在。可能的原因是由于混合菌种中含有微生物种类较多从而产生的化学成分比较复杂，导致在此质荷比区间差异明显。而相比于745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种，721矿纯菌种的m/z119，173信号强度更大，另外，721矿纯菌种还出现m/z158，295，391质谱信号峰，未见m/z301的质谱信号峰。为了快速识别鉴定嗜酸性微生物的种类，选择721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种中丰度较高的一些物质如m/z119等离子进行串联质谱鉴定。
图4为通过碰撞诱导解离实验（CID）得到的串联质谱图。m/z119离子的二级质谱图如图4a所示，产生主要碎片离子m/z91，为母体离子丢失中性碎片C2H4形成的，可能与酯类物质丢失碎片规律一致，推测m/z119为一酯类物质，通过文献和标准品串联质谱进一步确认了m/z119为质子化的乳酸乙酯＼[CH3CH（OH）COOCH2CH3+H＼]+。m/z151的二级质谱图如图4b所示，产生主要碎片离子m/z133，掉落碎片18，同时产生m/z105离子碎片，由此推测其为质子化苯甲酸乙酯，与参考文献对比进一步确认该化合物[16＼]。m/z135的二級质谱图和三级质谱图如图4c所示，产生主要碎片离子为m/z107，因此推测m/z135为酰胺物质，然后通过标准品的三级质谱图和文献对比进一步确认了m/z135为离子化的乙酰苯胺＼[CH3CONHC6H5＼]+。m/z136的二级谱图和三级谱图如图4d所示，与m/z135的串联谱图类似，由乙酰苯胺质子化之后得到＼[CH3CONHC6H5+H＼]+。
3.3常压化学电离质谱主成分分析（PCA）
主成分分析（PCA）在复杂样品的分析检测中已得到广泛地应用[17～20＼]。为了更直观地揭示嗜酸性微生物之间的差异和进一步论证实验结果的正确性，本研究通过Matlab软件将采集的大量质荷比在m/z100～400范围内的一级质谱数据进行规一化处理，利用“Princomp”函数对每一类样品数据进行PCA分析，自动得到各个主成分的得分图及相应的载荷图。
对721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种和混合菌种指纹谱图进行PCA分析（图5a），结果表明，两类生物样品可以得到很好的区分。由3个主成分载荷分布图（图5b）可见，m/z135，136，158，223，295，296等对区分两种样品的贡献较大，说明这些物质在两种样品中的含量存在有较大差异。同样，对745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种和混合菌种指纹谱图进行PCA分析，得到主成分分析图和载荷图如图5c和5d所示。从图5c可见，PC1，PC2和PC3对方差贡献率分别为51.5%，29.8%和7.1%，三者之和达到88.4%，因而这3个主成分包含了被分析样品的绝大部分信息，同时两种样品能够被明显区分开。
3.4常压化学电离质谱聚类分析（CA）
聚类分析是一种静态数据分析的统计学方法，目前已广泛应用于模式识别和图像分析等领域。实验将正离子模式检测下的嗜酸性微生物的质谱数据（已进行PCA分析）导入Matlab软件的聚类分析程序中进行分析，结果如图6所示。嗜酸性微生物样本为120个，其中721矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种、721矿嗜酸性混合菌种、745矿嗜酸性氧化亚铁硫杆菌纯菌种、745矿嗜酸性混合菌种各30个。
分析结果表明，721矿纯菌种与745矿纯菌种样本具有一定的相似度，说明在不同矿区中同一纯菌种代谢非常接近，而721矿混合菌种代谢产物中包含了部分纯菌种代谢产物，表明混合菌种中包含有嗜酸性氧化亚铁硫杆菌。721矿混合菌种与745矿混合菌种差异较大，说明不同矿区的混合菌种代谢具有较大的差异。从图6可见，A，B，C，D分别自聚成一类，反应不同嗜酸性微生物样品被区分开，这与PCA的分析结果相印证。
4结论
本研究采用常压化学电离技术，在无需样品预处理的情况下，直接快速分析不同矿区嗜酸性氧化亚铁硫杆菌代谢产物，从而高通量地实现对微生物的快速识别鉴定。尤其是对于化能自养型微生物的快速识别能够实现对目标菌种的筛选及构建生物浸矿体系具有重要的指导作用，有望在生物冶金中得到很好地应用。同时，本方法具有操作简单、灵敏度高、重现性好、分析速度快等特点，为微生物的快速识别和鉴定提供了一种可靠的途径。
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AbstractAmethodforrapiddeterminationofacidithiobacillusferrooxidans（At.f）metabolitesbyambientcoronadischargeionizationmassspectrometrywasestablished.Threeinjectionmodeswereappliedtostudytheeffectssuchasheadspacesampling，interfacesamplingandneutraldesorptionsampling.Undertheoptimizedexperimentalconditions，themetabolites，suchassmallmoleculeestersandaminesweredetectedbyambientcoronadischargeionizationmassspectrometryandconfirmedusingtandemmassspectrometry（MS/MS）.Furtherprincipalcomponentanalysis（PCA）andclusteranalysis（CA）ofthemassspectrometricresultsallowedaconfidentdiscriminationofdifferentbacterialsamples.Ambientcoronadischargeionizationmassspectrometryhastheadvantagesofnosamplepretreatment，convenientoperation，highsensitivityandhighanalyticalspeed，whichwillbeanattractivemethodtorapidlyidentificationofmicroorganisms.
KeywordsAcidithiobacillusferrooxidans；Ambientcoronadischargeionization；Metabolites；Massspectrometry
HQWT6JY（Received12July2016；accepted2September2016）
ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.81460327），ProgramforChangjiangScholarsandInnovationResearchTeaminUniversities（PCSIRT）（No.IRT13054），ScienceandtechnologysupportprogramofJiangxiProvince（Nos.20152ACB21013，20152ACG70014）.
