石英晶体微天平和原子力显微镜识别糖类化合物的苯硼酸接枝聚合物多层薄膜
袁文静+钟+彤+闫晶+薛中原+齐伟+王桦
摘 要 硼酸受体识别体系近年来被广泛用于糖的分子识别研究，硼酸在一定酸度条件下，可特异性结合含顺式邻位多羟基的物质（如二醇、糖等）。本实验利用EDC/NHS化学交联，3-氨基苯硼酸 （APBA） 与聚丙烯酸 （PAA） 反应，制得苯硼酸接枝的聚合物PAA-PBA，进而将此聚合物进行层层组装，获得苯硼酸功能化薄膜。利用石英晶体微天平（QCM）和原子力显微镜（AFM）分别从宏观和微观的角度监测分析了此薄膜表面对糖类化合物的识别性质。结果表明此类薄膜对一定浓度（>50 μg/mL）的糖类化合物均能表现出明显识别，其中，对果糖识别最为明显。此体系抗干扰性好，可重复使用，长期保存后仍能较好保持性能。微观表面形貌观察发现糖类化合物在薄膜表面识别均匀，识别后薄膜表面粗糙度发生明显变化。本研究成果可望用于开发高选择性、高灵敏度的糖识别体系。
关键词 苯硼酸； 层层组装技术； 糖识别； 石英晶体微天平； 原子力显微镜
1 引 言
糖作为生物体能源物质，在生命活动中起着不可替代的作用。识别生物体中各种糖已成为生命科学各领域的主要研究内容，建立高灵敏和高选择性的糖分子识别方法在生命科学领域中有着重要意义。近年来，硼酸受体识别体系被广泛用于糖的分子识别研究，硼酸在一定酸度条件下，可特异性结合含顺式邻位多羟基的物质（如二醇、糖等）。与酶法相比，硼酸受体识别体系无需酶介体且识别作用是可逆的，但多数在溶液中进行，其用作功能膜识别糖的研究尚较少开展[1～3]。
近年来，层层组装多层膜在生物传感器、药物传输载体、光学器件、电催化等方面开展了许多工作，并引起广泛关注。层层组装技术是由带相反电荷的聚电解质通过静电作用层层组装形成多层膜的技术[4～7]。由于具有组装过程操作简便，适用范围广泛，薄膜厚度易于控制，成分易于调节等优点，而引起了人们极大的兴趣。
石英晶体微天平（QCM）具有高度的灵敏性，可监测到纳米范围内薄膜的厚度变化和纳克范围内痕量物质质量的变化，特别适合薄膜的质量、厚度的测量，生物/化学传感器及痕量物质在表面的吸附过程研究，在分析科学研究中应用广泛，特别在聚合物多层薄膜的结构与性能研究中的应用备受关注[8，9]。原子力显微镜（AFM）是重要的表面分析工具，适用于各种体系的表面分析及各环境的现场测定，其分辨率可达原子级水平[8，10]。QCM获得的宏观动态数据和AFM获得的微观静态信息相结合，有利于在分子水平上理解硼酸受体与糖分子间的识别作用及机理。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Nicolet iS5傅里叶变换红外光谱（美国尼高力公司）；UV-3600紫外光谱（日本岛津公司）；ESCALab 250XiX光电子能谱（XPS，美国赛默飞公司）测试；Q-Sense E4 QCM（瑞典）；Nanoscope IIIa扫描探针显微镜（美国Digital Instruments公司）。
聚丙烯酸（PAA，Mn 130000）、3-氨基苯硼酸半硫酸盐（APBA）、N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、50% （w/V）聚乙烯亚胺（PEI）、Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate （TRITC）、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸 N-（2-羟乙基）哌嗪-N′-（2-乙磺酸）（HEPES）、抗坏血酸（AA）、尿素（UA）和多巴胺（DA）均购自美国Sigma-Aldrich公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、葡萄糖等购自天津市广成化学试剂有限公司。实验所用缓冲溶液为50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液和50 mmol/L HEPES缓冲溶液，所有实验用水均为Millipore超纯水。
2.2 苯硼酸接枝聚合物PAA-PBA的合成
PAA-PBA利用EDC/NHS交联法使PAA的羧基与APBA的氨基反应，形成酰胺键[11，12]：3 mmol PAA溶于HEPES缓冲溶液中，调节至pH 8.5，加入25 mL 0.06 mol/L APBA溶液， 4 mL 0.03 mol/L NHS和等量EDC，搅拌12 h。用清水透析1周后，冻干，即得PAA-PBA。
2.3 PEI/PAA-PBA多层膜的组装
在石英晶体电极（13.7 mm石英晶体和5.1 mm金电极）表面组装时，先将金电极表面彻底清洁。首先，加入500 μL 10% SDS溶液，用棉棒擦拭，用超纯水洗去剩余溶液，并用氮气吹干表面。然后用3 μL Piranha溶液（浓H2SO4-30% H2O2，7∶3，V/V）覆盖整个金电极表面，10 min后，用超纯水清洗。在清洁的金表面开始组装第一层，取500 μL PEI溶液（含0.2 mol/L NaCl）加入检测池，直到仪器信号稳定，20 min后，用超纯水清洗3次，加入第二层组装，500 μL PAA-PBA溶液（含0.2 mol/L NaCl）加入检测池，直到信号稳定，依此循环，直到所需层数。QCM实时记录组装过程频率变化。
在石英片、硅片表面组装PEI/PAA-PBA多层膜进行同样的操作，分别用紫外可见光谱和原子力显微镜表征。
3 结果与讨论
3.1 苯硼酸接枝聚丙烯酸PAA-PBA的合成与表征
苯硼酸接枝的聚丙烯酸是借助EDC和NHS的化学交联合成获得的，合成原理如图1所示。首先，产物PAA-PBA利用傅里叶变换红外光谱仪进行了光谱测试，红外谱图（图2）中2950 cm
对应PAA中亚甲基的伸缩振动，1565和1678 cm1为酰胺键的伸缩振动峰，由于苯环的特征峰也在附近，因而交联体的峰更强一些，这在PAA-PBA中均检测到。1361 cm
为硼酸基团中BO键的伸缩振动吸收峰；1438 cm为苯环变形振动特征位置，这表明PAA和APBA已发生了交联反应，形成了PAA-PBA。
另外，通过XPS测试获得产物PAA-PBA的元素分析结果（图3）表明，产物中存在B，N等元素，含量较低，信号较弱，但仍可计算出，APBA在PAA上的接枝率约为38%。因此，PAA-PBA中仍然有大量的自由羧基存在，这为后期的静电组装提供了便利。
图1 3-氨基苯硼酸接枝聚丙烯酸反应示意图
Fig.1 Synthetic scheme of poly（acrylic acid）-phenylboronic acid （PAA-PBA）
3.2 PEI/PAA-PBA多层薄膜的表征
带正电的聚乙烯亚胺作为第一层组装在处理过的石英晶体电极上，含较多羧基的PAA-PBA在
图2 3-氨基苯硼酸和接枝产物PAA-PBA的红外光谱图
Fig.2 FTIR spectra of 3-aminophenylboronic acid hemisulfate （APBA） and PAA-PBA
pH 9.0时带明显负电荷，作为第二层进行组装，依此循环，直至所需层数。组装的多层膜分别用紫外-可见光谱、QCM和AFM进行了观测。
图3 接枝产物PAA-PBA的XPS图
Fig.3 XPS spectra of PAA-PBA
为了更清楚监测其组装过程，用TRITC对PEI进行了荧光标记，由图4可见，550 nm峰强随着组装层数的增加而明显增强，表明组装的成功进行。QCM也可监测到层层组装的发生，由共振频率的减少反映出电极表面质量的增加，随着组装层数增加，共振频率降低越来越显著，证明了薄膜的成功组装（图5）。AFM也可以观察到组装不同层数的表面形貌变化，如图6所示，分别表示组装2个双层、4个双层、6个双层的PEI/PAA-PBA薄膜。原子力显微镜下呈现典型的层层组装多层膜的表面形貌，表面由连续的结节组成，随着组装层数增加，结节逐渐变大。
图4 （PEI/PAA-PBA）n 多层膜组装紫外光谱图（A）及其石英晶体微天平监测共振频率变化图（B）
Fig.4 UV-vis spectra （A） and frequency shift （B） observed during assembly of （PEI/PAA-PBA）n multilayer
PEI： Poly（ethyleneimine）.
图5 原子力显微镜观测不同层数（PEI/PAA-PBA）n 多层膜的表面形貌图（5 μm×5 μm）： （A） （PEI/PAA-PBA）2； （B） （PEI/PAA-PBA）4； （C） （PEI/PAA-PBA）6
Fig.5 AFM height images of （A） （PEI/PAA-PBA）2 multilayer， （B） （PEI/PAA-PBA）4 multilayer and （C） （PEI/PAA-PBA）6 multilayer
3.3 PEI/PAA-PBA多层薄膜对葡萄糖的识别
薄膜对葡萄糖的识别通过QCM技术实时监测，记录不同层数的薄膜对相同浓度的葡萄糖溶液（100 μg/mL）的识别时间曲线（图6）。图7显示了典型的共振频率变化，在空白电极表面，在监测时间范围内没有看到频率变化。在1个双层薄膜表面，观察到频率的变化，但是频率减少较弱，说明识别在薄膜上的糖分子少，表明两者间的识别作用弱。随着组装层数增加，薄膜表面PBA基团越来越多，对糖的识别作用逐渐增强，频率减少程度增大，直到达到5个双层后，识别不再有明显增加，说明在薄膜表面的识别已达到饱和。
为准确探讨薄膜与糖的识别作用，选4个双层的薄膜为模型体系，监测了不同浓度葡萄糖溶液在此膜表面的识别性质。图7表明，当葡萄糖浓度较低时，如50 μg/mL，共振频率变化很小，表明二者识别作用弱，而当葡萄糖浓度达到100 μg/mL时，共振频率有了显著的变化，这时识别作用增强，进一步地增加葡萄糖浓度到300 μg/mL后，识别作用又有了明显增强，但当葡萄糖溶液浓度增加至500 μg/mL时，识别作用不再有明显的增强，表明此时识别作用已达平衡。
图6 不同层数PEI/PAA-PBA多层膜对100 μg/mL的葡萄糖溶液的QCM频率变化曲线
Fig.6 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）n multilayer to glucose at concentration of 100 μg/mL
图7 （PEI/PAA-PBA）4膜对不同浓度葡萄糖溶液的QCM频率变化曲线
Fig.7 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose with different concentrations
图8 （PEI/PAA-PBA）4膜对葡萄糖识别前后的原子力显微镜观察图（10 μm×10 μm）： （A）识别前形貌图； （B）识别前相图；（C）识别平衡后形貌图； （D）识别平衡后相图
Fig.8 （A） AFM height images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer before recognition to glucose， （B） AFM phase images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer before the recognition to glucose， （C） AFM height images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer in recognition equilibrium to glucose and （D） AFM phase images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer in recognition equilibrium to glucose
利用AFM技术对葡萄糖在薄膜表面的被识别行为进行了表面分析。图8显示了识别前和识别平衡后的薄膜表面，表面粗糙度Ra在2.494～3.502 nm之间明显变化，同时，PEI/PAA-PBA膜表面识别结合葡萄糖比较均匀。
3.4 PEI/PAA-PBA多层薄膜对其他糖类化合物的识别
图9显示了此薄膜对其它糖类化合物的识别性质，相比相同浓度的葡萄糖、甘露糖及半乳糖，薄膜对果糖识别更明显，而对其它3种糖识别性能相似，这是因为果糖是唯一含2个顺式二元醇的分子，会与硼酸基产生更强的识别作用[12]。
图9 （PEI/PAA-PBA）4膜对相同浓度100 μg/mL的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖的QCM频率变化曲线
Fig.9 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose， fructose， mannose and galactose with same concentration of 100 μg/mL
3.5 PEI/PAA-PBA多层薄膜的干扰实验、重复利用和稳定性
为了进一步考察此类薄膜材料用于实际样品检测的可能性，分别考察了生命体内常见干扰物质AA、UA、DA等，研究其抗干扰能力。由图10可见，加入干扰物质未影响此薄膜对糖类化合物的识别，并且此薄膜对AA、UA、DA等干扰物质都完全没有识别作用。这表明此类薄膜的抗干扰性好，能用于实际样品的检测。
图10 （PEI/PAA-PBA）4膜对300 μg/mL葡萄糖（A）在100 μg/mL AA和100 μg/mL UA的干扰下；（B）在100 μg/mL DA的干扰下的QCM频率变化曲线
Fig.10 Time courses of frequency shift observed during the recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose concentration of 300 μg/mL （A） in the absence and the presence of ascorbic acid （AA）， uric acid （UA）； （B） in the absence and presence of dopamine （DA）
如前所述，硼酸基与顺式二元醇的识别是可逆的，这种识别高度依赖体系酸度，图11A表明，此薄膜在pH 8.0体系中，原已识别的葡萄糖会脱落，两者不再存在相互作用；而在pH 10.0时，体系没有明显变化，说明此条件下识别作用能够稳定存在；pH≤8.0时，已经识别的葡萄糖会从薄膜表面脱落，此薄膜可重复使用。将重复使用1次、2次的薄膜分别与新鲜制备的薄膜对比，发现三者对相同浓度葡萄糖的识别基本没有差别，这些结果进一步证明了PEI/PAA-PBA薄膜对糖的识别是可逆的，并可重复使用，这也正是此类薄膜拟作为传感识别体系的优势所在。
图11 （A）识别了葡萄糖的（PEI/PAA-PBA）4膜在pH 8.0和pH 10.0时的QCM频率变化曲线 ；（B）重复利用的（PEI/PAA-PBA）4膜识别300 μg/mL葡萄糖的QCM频率变化曲线
Fig.11 Time courses of frequency shift observed （A） （PEI/PAA-PBA）4 multilayer recognized with glucose at pH 8.0 and pH 10.0， respectively； （B） during the recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer newly fabricated， that recycled once and twice to glucose at the concentration of 300 μg/mL， respectively
考察了此薄膜的长期稳定性，将薄膜修饰的晶体电极置于4℃条件下保存，每周测试其对相同浓度葡萄糖的识别响应，在4周内，QCM响应曲线基本没有发生变化，表明此薄膜长期保存后仍能较好地保持对糖的识别性能。这是与酶法体系相比的另一优势，蛋白类氧化酶虽然催化活性高，但易受环境干扰而失活。
4 结 论
合成了苯硼酸接枝的高分子化合物PAA-PBA，通过静电层层组装获得了PBA功能化表面，并分别用QCM和AFM技术表征了此表面对葡萄糖等糖类化合物的识别性能。结果表明，此类薄膜能够明显识别葡萄糖、果糖、甘露糖及半乳糖等糖类化合物，其中对果糖识别最为明显，并且，此体系抗干扰性和稳定性好，可重复使用，同时，此方法体系可扩展至其他苯硼酸接枝聚合物，适用性广，可望应用于食品、医药等相关领域传感识别体系的开发。
References
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摘 要 硼酸受体识别体系近年来被广泛用于糖的分子识别研究，硼酸在一定酸度条件下，可特异性结合含顺式邻位多羟基的物质（如二醇、糖等）。本实验利用EDC/NHS化学交联，3-氨基苯硼酸 （APBA） 与聚丙烯酸 （PAA） 反应，制得苯硼酸接枝的聚合物PAA-PBA，进而将此聚合物进行层层组装，获得苯硼酸功能化薄膜。利用石英晶体微天平（QCM）和原子力显微镜（AFM）分别从宏观和微观的角度监测分析了此薄膜表面对糖类化合物的识别性质。结果表明此类薄膜对一定浓度（>50 μg/mL）的糖类化合物均能表现出明显识别，其中，对果糖识别最为明显。此体系抗干扰性好，可重复使用，长期保存后仍能较好保持性能。微观表面形貌观察发现糖类化合物在薄膜表面识别均匀，识别后薄膜表面粗糙度发生明显变化。本研究成果可望用于开发高选择性、高灵敏度的糖识别体系。
关键词 苯硼酸； 层层组装技术； 糖识别； 石英晶体微天平； 原子力显微镜
1 引 言
糖作为生物体能源物质，在生命活动中起着不可替代的作用。识别生物体中各种糖已成为生命科学各领域的主要研究内容，建立高灵敏和高选择性的糖分子识别方法在生命科学领域中有着重要意义。近年来，硼酸受体识别体系被广泛用于糖的分子识别研究，硼酸在一定酸度条件下，可特异性结合含顺式邻位多羟基的物质（如二醇、糖等）。与酶法相比，硼酸受体识别体系无需酶介体且识别作用是可逆的，但多数在溶液中进行，其用作功能膜识别糖的研究尚较少开展[1～3]。
近年来，层层组装多层膜在生物传感器、药物传输载体、光学器件、电催化等方面开展了许多工作，并引起广泛关注。层层组装技术是由带相反电荷的聚电解质通过静电作用层层组装形成多层膜的技术[4～7]。由于具有组装过程操作简便，适用范围广泛，薄膜厚度易于控制，成分易于调节等优点，而引起了人们极大的兴趣。
石英晶体微天平（QCM）具有高度的灵敏性，可监测到纳米范围内薄膜的厚度变化和纳克范围内痕量物质质量的变化，特别适合薄膜的质量、厚度的测量，生物/化学传感器及痕量物质在表面的吸附过程研究，在分析科学研究中应用广泛，特别在聚合物多层薄膜的结构与性能研究中的应用备受关注[8，9]。原子力显微镜（AFM）是重要的表面分析工具，适用于各种体系的表面分析及各环境的现场测定，其分辨率可达原子级水平[8，10]。QCM获得的宏观动态数据和AFM获得的微观静态信息相结合，有利于在分子水平上理解硼酸受体与糖分子间的识别作用及机理。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Nicolet iS5傅里叶变换红外光谱（美国尼高力公司）；UV-3600紫外光谱（日本岛津公司）；ESCALab 250XiX光电子能谱（XPS，美国赛默飞公司）测试；Q-Sense E4 QCM（瑞典）；Nanoscope IIIa扫描探针显微镜（美国Digital Instruments公司）。
聚丙烯酸（PAA，Mn 130000）、3-氨基苯硼酸半硫酸盐（APBA）、N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、50% （w/V）聚乙烯亚胺（PEI）、Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate （TRITC）、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸 N-（2-羟乙基）哌嗪-N′-（2-乙磺酸）（HEPES）、抗坏血酸（AA）、尿素（UA）和多巴胺（DA）均购自美国Sigma-Aldrich公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、葡萄糖等购自天津市广成化学试剂有限公司。实验所用缓冲溶液为50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液和50 mmol/L HEPES缓冲溶液，所有实验用水均为Millipore超纯水。
2.2 苯硼酸接枝聚合物PAA-PBA的合成
PAA-PBA利用EDC/NHS交联法使PAA的羧基与APBA的氨基反应，形成酰胺键[11，12]：3 mmol PAA溶于HEPES缓冲溶液中，调节至pH 8.5，加入25 mL 0.06 mol/L APBA溶液， 4 mL 0.03 mol/L NHS和等量EDC，搅拌12 h。用清水透析1周后，冻干，即得PAA-PBA。
2.3 PEI/PAA-PBA多层膜的组装
在石英晶体电极（13.7 mm石英晶体和5.1 mm金电极）表面组装时，先将金电极表面彻底清洁。首先，加入500 μL 10% SDS溶液，用棉棒擦拭，用超纯水洗去剩余溶液，并用氮气吹干表面。然后用3 μL Piranha溶液（浓H2SO4-30% H2O2，7∶3，V/V）覆盖整个金电极表面，10 min后，用超纯水清洗。在清洁的金表面开始组装第一层，取500 μL PEI溶液（含0.2 mol/L NaCl）加入检测池，直到仪器信号稳定，20 min后，用超纯水清洗3次，加入第二层组装，500 μL PAA-PBA溶液（含0.2 mol/L NaCl）加入检测池，直到信号稳定，依此循环，直到所需层数。QCM实时记录组装过程频率变化。
在石英片、硅片表面组装PEI/PAA-PBA多层膜进行同样的操作，分别用紫外可见光谱和原子力显微镜表征。
3 结果与讨论
3.1 苯硼酸接枝聚丙烯酸PAA-PBA的合成与表征
苯硼酸接枝的聚丙烯酸是借助EDC和NHS的化学交联合成获得的，合成原理如图1所示。首先，产物PAA-PBA利用傅里叶变换红外光谱仪进行了光谱测试，红外谱图（图2）中2950 cm
对应PAA中亚甲基的伸缩振动，1565和1678 cm1为酰胺键的伸缩振动峰，由于苯环的特征峰也在附近，因而交联体的峰更强一些，这在PAA-PBA中均检测到。1361 cm
为硼酸基团中BO键的伸缩振动吸收峰；1438 cm为苯环变形振动特征位置，这表明PAA和APBA已发生了交联反应，形成了PAA-PBA。
另外，通过XPS测试获得产物PAA-PBA的元素分析结果（图3）表明，产物中存在B，N等元素，含量较低，信号较弱，但仍可计算出，APBA在PAA上的接枝率约为38%。因此，PAA-PBA中仍然有大量的自由羧基存在，这为后期的静电组装提供了便利。
图1 3-氨基苯硼酸接枝聚丙烯酸反应示意图
Fig.1 Synthetic scheme of poly（acrylic acid）-phenylboronic acid （PAA-PBA）
3.2 PEI/PAA-PBA多层薄膜的表征
带正电的聚乙烯亚胺作为第一层组装在处理过的石英晶体电极上，含较多羧基的PAA-PBA在
图2 3-氨基苯硼酸和接枝产物PAA-PBA的红外光谱图
Fig.2 FTIR spectra of 3-aminophenylboronic acid hemisulfate （APBA） and PAA-PBA
pH 9.0时带明显负电荷，作为第二层进行组装，依此循环，直至所需层数。组装的多层膜分别用紫外-可见光谱、QCM和AFM进行了观测。
图3 接枝产物PAA-PBA的XPS图
Fig.3 XPS spectra of PAA-PBA
为了更清楚监测其组装过程，用TRITC对PEI进行了荧光标记，由图4可见，550 nm峰强随着组装层数的增加而明显增强，表明组装的成功进行。QCM也可监测到层层组装的发生，由共振频率的减少反映出电极表面质量的增加，随着组装层数增加，共振频率降低越来越显著，证明了薄膜的成功组装（图5）。AFM也可以观察到组装不同层数的表面形貌变化，如图6所示，分别表示组装2个双层、4个双层、6个双层的PEI/PAA-PBA薄膜。原子力显微镜下呈现典型的层层组装多层膜的表面形貌，表面由连续的结节组成，随着组装层数增加，结节逐渐变大。
图4 （PEI/PAA-PBA）n 多层膜组装紫外光谱图（A）及其石英晶体微天平监测共振频率变化图（B）
Fig.4 UV-vis spectra （A） and frequency shift （B） observed during assembly of （PEI/PAA-PBA）n multilayer
PEI： Poly（ethyleneimine）.
图5 原子力显微镜观测不同层数（PEI/PAA-PBA）n 多层膜的表面形貌图（5 μm×5 μm）： （A） （PEI/PAA-PBA）2； （B） （PEI/PAA-PBA）4； （C） （PEI/PAA-PBA）6
Fig.5 AFM height images of （A） （PEI/PAA-PBA）2 multilayer， （B） （PEI/PAA-PBA）4 multilayer and （C） （PEI/PAA-PBA）6 multilayer
3.3 PEI/PAA-PBA多层薄膜对葡萄糖的识别
薄膜对葡萄糖的识别通过QCM技术实时监测，记录不同层数的薄膜对相同浓度的葡萄糖溶液（100 μg/mL）的识别时间曲线（图6）。图7显示了典型的共振频率变化，在空白电极表面，在监测时间范围内没有看到频率变化。在1个双层薄膜表面，观察到频率的变化，但是频率减少较弱，说明识别在薄膜上的糖分子少，表明两者间的识别作用弱。随着组装层数增加，薄膜表面PBA基团越来越多，对糖的识别作用逐渐增强，频率减少程度增大，直到达到5个双层后，识别不再有明显增加，说明在薄膜表面的识别已达到饱和。
为准确探讨薄膜与糖的识别作用，选4个双层的薄膜为模型体系，监测了不同浓度葡萄糖溶液在此膜表面的识别性质。图7表明，当葡萄糖浓度较低时，如50 μg/mL，共振频率变化很小，表明二者识别作用弱，而当葡萄糖浓度达到100 μg/mL时，共振频率有了显著的变化，这时识别作用增强，进一步地增加葡萄糖浓度到300 μg/mL后，识别作用又有了明显增强，但当葡萄糖溶液浓度增加至500 μg/mL时，识别作用不再有明显的增强，表明此时识别作用已达平衡。
图6 不同层数PEI/PAA-PBA多层膜对100 μg/mL的葡萄糖溶液的QCM频率变化曲线
Fig.6 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）n multilayer to glucose at concentration of 100 μg/mL
图7 （PEI/PAA-PBA）4膜对不同浓度葡萄糖溶液的QCM频率变化曲线
Fig.7 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose with different concentrations
图8 （PEI/PAA-PBA）4膜对葡萄糖识别前后的原子力显微镜观察图（10 μm×10 μm）： （A）识别前形貌图； （B）识别前相图；（C）识别平衡后形貌图； （D）识别平衡后相图
Fig.8 （A） AFM height images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer before recognition to glucose， （B） AFM phase images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer before the recognition to glucose， （C） AFM height images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer in recognition equilibrium to glucose and （D） AFM phase images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer in recognition equilibrium to glucose
利用AFM技术对葡萄糖在薄膜表面的被识别行为进行了表面分析。图8显示了识别前和识别平衡后的薄膜表面，表面粗糙度Ra在2.494～3.502 nm之间明显变化，同时，PEI/PAA-PBA膜表面识别结合葡萄糖比较均匀。
3.4 PEI/PAA-PBA多层薄膜对其他糖类化合物的识别
图9显示了此薄膜对其它糖类化合物的识别性质，相比相同浓度的葡萄糖、甘露糖及半乳糖，薄膜对果糖识别更明显，而对其它3种糖识别性能相似，这是因为果糖是唯一含2个顺式二元醇的分子，会与硼酸基产生更强的识别作用[12]。
图9 （PEI/PAA-PBA）4膜对相同浓度100 μg/mL的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖的QCM频率变化曲线
Fig.9 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose， fructose， mannose and galactose with same concentration of 100 μg/mL
3.5 PEI/PAA-PBA多层薄膜的干扰实验、重复利用和稳定性
为了进一步考察此类薄膜材料用于实际样品检测的可能性，分别考察了生命体内常见干扰物质AA、UA、DA等，研究其抗干扰能力。由图10可见，加入干扰物质未影响此薄膜对糖类化合物的识别，并且此薄膜对AA、UA、DA等干扰物质都完全没有识别作用。这表明此类薄膜的抗干扰性好，能用于实际样品的检测。
图10 （PEI/PAA-PBA）4膜对300 μg/mL葡萄糖（A）在100 μg/mL AA和100 μg/mL UA的干扰下；（B）在100 μg/mL DA的干扰下的QCM频率变化曲线
Fig.10 Time courses of frequency shift observed during the recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose concentration of 300 μg/mL （A） in the absence and the presence of ascorbic acid （AA）， uric acid （UA）； （B） in the absence and presence of dopamine （DA）
如前所述，硼酸基与顺式二元醇的识别是可逆的，这种识别高度依赖体系酸度，图11A表明，此薄膜在pH 8.0体系中，原已识别的葡萄糖会脱落，两者不再存在相互作用；而在pH 10.0时，体系没有明显变化，说明此条件下识别作用能够稳定存在；pH≤8.0时，已经识别的葡萄糖会从薄膜表面脱落，此薄膜可重复使用。将重复使用1次、2次的薄膜分别与新鲜制备的薄膜对比，发现三者对相同浓度葡萄糖的识别基本没有差别，这些结果进一步证明了PEI/PAA-PBA薄膜对糖的识别是可逆的，并可重复使用，这也正是此类薄膜拟作为传感识别体系的优势所在。
图11 （A）识别了葡萄糖的（PEI/PAA-PBA）4膜在pH 8.0和pH 10.0时的QCM频率变化曲线 ；（B）重复利用的（PEI/PAA-PBA）4膜识别300 μg/mL葡萄糖的QCM频率变化曲线
Fig.11 Time courses of frequency shift observed （A） （PEI/PAA-PBA）4 multilayer recognized with glucose at pH 8.0 and pH 10.0， respectively； （B） during the recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer newly fabricated， that recycled once and twice to glucose at the concentration of 300 μg/mL， respectively
考察了此薄膜的长期稳定性，将薄膜修饰的晶体电极置于4℃条件下保存，每周测试其对相同浓度葡萄糖的识别响应，在4周内，QCM响应曲线基本没有发生变化，表明此薄膜长期保存后仍能较好地保持对糖的识别性能。这是与酶法体系相比的另一优势，蛋白类氧化酶虽然催化活性高，但易受环境干扰而失活。
4 结 论
合成了苯硼酸接枝的高分子化合物PAA-PBA，通过静电层层组装获得了PBA功能化表面，并分别用QCM和AFM技术表征了此表面对葡萄糖等糖类化合物的识别性能。结果表明，此类薄膜能够明显识别葡萄糖、果糖、甘露糖及半乳糖等糖类化合物，其中对果糖识别最为明显，并且，此体系抗干扰性和稳定性好，可重复使用，同时，此方法体系可扩展至其他苯硼酸接枝聚合物，适用性广，可望应用于食品、医药等相关领域传感识别体系的开发。
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