太芪培元颗粒体外抗HIV—1病毒活性研究
马秀兰 马建萍 张颖 等
摘要：目的 评价太芪培元颗粒体外对HIV-1病毒的抑制活性。方法 MTT法检测太芪培元颗粒细胞毒性；通过细胞病变法检测太芪培元颗粒对HIV-1急性感染的抑制活性；应用HIV-1 p24抗原ELISA检测太芪培元颗粒对HIV-1急性感染细胞中病毒复制的抑制活性，并计算药物治疗指数。结果 太芪培元颗粒细胞毒性实验CC50为（3.761±0.370）mg/mL；合胞体抑制实验EC50为（0.454 5±0.204 6）mg/mL，治疗指数为5.84～12.97；p24抑制实验EC50为（0.56±0.27）mg/mL，治疗指数为5.30～8.74。结论 太芪培元颗粒体外抗HIV-1活性较弱。
关键词：太芪培元颗粒；人类免疫缺陷病毒；体外抗病毒活性；免疫机制
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0061-03
Study on Vitro Anti-HIV-1 Activity of Taiqi Peiyuan Granules MA Xiu-lan1， MA Jian-ping1， ZHANG Ying1， ABUDUREYIMU Aihemaiti1， LI Jing-ru1， ZENG Lin1， ZHENG Yong-tang2， YANG Liu-meng2， MA Li-xue2 （1. Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University， AIDS Lab of National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine， Urumqi 830000， China； 2. Laboratory of Molecular Immunopharmacology， Kunming Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650223， China）
Abstract： Objective To evaluate the vitro anti-HIV-1 activity of Taiqi Peiyuan Granules. Methods MTT was used to detect cytotoxicity of Taiqi Peiyuan Granules； cytopathy method was used to detect the inhibitory activity of Taiqi Peiyuan Granules on acute infection of HIV-1； HIV-1 p24 antigen ELISA detection was used to detect inhibitory activity of Taiqi Peiyuan Granules for virus replication of HIV-1 acute infection cells， and count the medical therapeutic indexes. Results CC50 of Taiqi Peiyuan Granules in cytotoxicity test was 3.761±0.370 mg/mL； the EC50 of inhibition syncytial test was 0.454 5±0.204 6 mg/mL； the therapeutic index was between 5.84 and 12.97； p24 of Taiqi Peiyuan Granules in inhibition experiments was 0.56±0.27 mg/mL， and the therapeutic index was between 5.30 and 8.74. Conclusion Anti-HIV-1 activity of Taiqi Peiyuan Granules is relatively weak.
Key words： Taiqi Peiyuan Granules； human immunodeficiency virus； vitro antiviral activity； immunologic mechanism
艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的传染性疾病，以严重损害全身免疫系统为特征。目前，抗HIV药物依然是AIDS防治的主要手段。太芪培元颗粒是新疆医科大学附属中医医院院内制剂，其主要功效为益气养阴、补益脾肾，临床主要用于治疗AIDS证属气阴两虚、肺肾不足者。经长期临床观
基金项目：国家科技重大专项（2014ZX10005003）；新疆医科大学科研创新基金项目（XJC201181）
通讯作者：马建萍，E-mail：majianpingm@163.com
察发现，该制剂可明显改善AIDS患者症状，提高其生存质量，对患者CD4+T淋巴细胞水平有提高作用[1-6]。本实验通过太芪培元颗粒体外抗HIV-1病毒活性的研究，为该药作用机制研究提供参考。
1 实验材料
1.1 细胞和病毒
人T淋巴细胞系C8166和HIV-1实验株HIV-1ⅢB，英国Medical Research Council AIDS Reagent Project惠赠。按常规方法制备HIV-1ⅢB，滴定并计算病毒半数组织培养感染剂量（TCID50）。将病毒贮存液进行分装，-70 ℃保存。实验过程中细胞和病毒按照常规方法进行冻存及复苏。
1.2 药物
太芪培元颗粒，新疆华世丹药业股份有限公司，批号130808。叠氮胸苷（3'-Azido-3'-deoxythymidine，AZT），Sigma公司。
1.3 主要试剂与仪器
HEPES、MTT、DMF、青霉素、硫酸链霉素、谷氨酰胺，Sigma公司；2-巯基乙醇，Bio-Rad公司；RPMI-1640和胎牛血清，Gibco公司。酶标仪ELX-800（BIO-TEK），微量移液器（Gilson），二级生物安全柜Froma ClassⅡ、CO2细胞培养箱（Thermo Fisher）。
2 实验方法
2.1 HIV-1感染性滴定
HIV-1ⅢB按Johnson&Byington;所述方法改良进行滴定，按Reed&Muench;方法计算病毒的TCID50[7]。
2.2 C8166细胞毒性实验
将100 μL C8166细胞悬液（4×105/mL）与不同浓度待测药物溶液混合，设3个重复孔。同时设置不含任何药物的对照孔，MTT法检测细胞毒性。于酶标仪570 nm波长处测定光密度（OD）值（参考波长630 nm），计算得到对50%细胞产生毒性时的化合物浓度（CC50），即对50%正常T淋巴细胞系C8166细胞产生毒性时的药物浓度。计量资料以—x±s表示，按Reed&Muench;法计算CC50。
细胞存活率（%）=实验孔OD值÷对照孔OD值×100%
2.3 HIV-1ⅢB致细胞病变抑制实验
按100 μL/孔梯度倍比加稀释药物于96孔培养板，再将8×105/mL C8166细胞50 μL/孔接种至培养板，加50 μL HIV-1ⅢB稀释上清液，1300 TCID50/孔。设置重复孔3个，同时以不含任何药物正常细胞作为对照孔。阳性药物对照为AZT。37 ℃、5%CO2培养3 d，100倍倒置显微镜下对合胞体形成计数。50%有效浓度（EC50）为抑制合胞体形成50%时的药物浓度。计量资料以—x±s表示，按Reed&Muench;法计算EC50。
细胞病变抑制率（%）=（1-实验孔合胞体数÷对照孔合胞体数）×100%
2.4 HIV-1ⅢB急性感染C8166细胞中病毒复制抑制实验
将4×105个/mL C8166细胞与HIV-1ⅢB（MOI=0.04）、HIV-1RF（MOI=0.4）37 ℃感染2 h，1500 r/min离心，PBS洗涤3次，去除游离的病毒离子，取100 μL细胞接种至含100 μL不同稀释度待测化合物96孔板，37 ℃、5%CO2培养3 d。将培养上清液3000 r/min离心后收集，用终浓度0.5%Triton X-100裂解灭活。采用捕获p24抗原ELISA检测。2 μL/板抗鼠IgG-Fc抗体4 ℃铺板过夜；5%脱脂奶粉4 ℃封板过夜；加自制的鼠抗p24单抗100 μL/孔，置37 ℃温育60 min；加100 μL/孔裂解感染细胞培养上清，37 ℃、2 h；加100 μL/孔1∶100稀释的自制兔抗p24多抗，置37 ℃温育；加100 μL/孔1∶20 000稀释的羊抗兔IgG-HRP，置37 ℃温育；加OPD底物反应液。10 min后，2 mol/L硫酸终止反应。ELISA测定OD值，测定波长为490 nm，参考波长630 nm。计量资料以—x±s表示，计算p24抗原抑制率。
p24抗原抑制率（%）=（1-实验孔OD值÷对照孔OD值）×100%
3 结果
3.1 太芪培元颗粒的细胞毒性作用
太芪培元颗粒组CC50值为（3.761±0.370）mg/mL，明显高于AZT组（1371.37 ?g/mL）。结果见表1。
3.2 太芪培元颗粒对HIV-1ⅢB诱导C8166细胞病变的抑制作用
太芪培元颗粒组EC50值为（0.454 5±0.204 6）mg/mL与AZT组（0.458 5±0.371 6）mg/mL比较差异不明显。结果见表2。
3.3 太芪培元颗粒对HIV-1ⅢB感染C8166细胞p24表达的抑制作用
太芪培元颗粒对HIV-1复制表达p24抗原的抑制率随药物浓度的增加而升高，而对照药AZT的趋势与其相同，见表3。
3.4 太芪培元颗粒对HIV-1活性治疗指数的影响
根据实验数据及公式（治疗指数=CC50÷EC50），太芪培元颗粒合胞体抑制实验治疗指数为5.84～12.97，对照药AZT治疗指数为1 902 038～6 996 785；p24抑制实验中，太芪培元颗粒治疗指数为5.30～8.74，对照药AZT治疗指数为1 904 680～9 795 500。表明太芪培元颗粒体外抗HIV-1病毒活性较弱。
4 讨论
太芪培元颗粒用于治疗气阴两虚、肺肾不足型AIDS，以太子参、生地黄为君药。太子参味甘、微苦，归脾、肺经，功效为补气健脾、生津润肺；生地黄味甘、苦，性寒，归心、肝、肾经，功效为清热凉血、养阴生津。本方重用二药，以达益气养阴之功效。该药在临床应用中可改善患者症状体征，提高免疫力，但本研究体外抗HIV-1病毒结果显示其抗HIV活性较弱。
近年来，中医药对AIDS的防治研究成果初显，但其作用机制的研究依然是难点，尤其是中药复方的作用机制研究。在药物体外抗HIV病毒研究中，筛选了大量中药及其有效成分均有体外抗病毒活性。大量临床研究表明，中药复方在AIDS治疗的各个领域均有所长，例如对带状疱疹的中西医结合治疗，对高效抗逆转录病毒治疗相关血脂异常的研究，对患者免疫重建的研究等，均取得较好的疗效[8-11]。与此同时，研究者也指出，中医药治疗的疗效可能是通过改善患者免疫功能低下等机制起到缓解临床症状的作用，但具体作用机制及如何确定中药介入的指征和时机等问题需要深入研究[12]。
摘要：目的 评价太芪培元颗粒体外对HIV-1病毒的抑制活性。方法 MTT法检测太芪培元颗粒细胞毒性；通过细胞病变法检测太芪培元颗粒对HIV-1急性感染的抑制活性；应用HIV-1 p24抗原ELISA检测太芪培元颗粒对HIV-1急性感染细胞中病毒复制的抑制活性，并计算药物治疗指数。结果 太芪培元颗粒细胞毒性实验CC50为（3.761±0.370）mg/mL；合胞体抑制实验EC50为（0.454 5±0.204 6）mg/mL，治疗指数为5.84～12.97；p24抑制实验EC50为（0.56±0.27）mg/mL，治疗指数为5.30～8.74。结论 太芪培元颗粒体外抗HIV-1活性较弱。
关键词：太芪培元颗粒；人类免疫缺陷病毒；体外抗病毒活性；免疫机制
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0061-03
Study on Vitro Anti-HIV-1 Activity of Taiqi Peiyuan Granules MA Xiu-lan1， MA Jian-ping1， ZHANG Ying1， ABUDUREYIMU Aihemaiti1， LI Jing-ru1， ZENG Lin1， ZHENG Yong-tang2， YANG Liu-meng2， MA Li-xue2 （1. Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University， AIDS Lab of National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine， Urumqi 830000， China； 2. Laboratory of Molecular Immunopharmacology， Kunming Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650223， China）
Abstract： Objective To evaluate the vitro anti-HIV-1 activity of Taiqi Peiyuan Granules. Methods MTT was used to detect cytotoxicity of Taiqi Peiyuan Granules； cytopathy method was used to detect the inhibitory activity of Taiqi Peiyuan Granules on acute infection of HIV-1； HIV-1 p24 antigen ELISA detection was used to detect inhibitory activity of Taiqi Peiyuan Granules for virus replication of HIV-1 acute infection cells， and count the medical therapeutic indexes. Results CC50 of Taiqi Peiyuan Granules in cytotoxicity test was 3.761±0.370 mg/mL； the EC50 of inhibition syncytial test was 0.454 5±0.204 6 mg/mL； the therapeutic index was between 5.84 and 12.97； p24 of Taiqi Peiyuan Granules in inhibition experiments was 0.56±0.27 mg/mL， and the therapeutic index was between 5.30 and 8.74. Conclusion Anti-HIV-1 activity of Taiqi Peiyuan Granules is relatively weak.
Key words： Taiqi Peiyuan Granules； human immunodeficiency virus； vitro antiviral activity； immunologic mechanism
艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的传染性疾病，以严重损害全身免疫系统为特征。目前，抗HIV药物依然是AIDS防治的主要手段。太芪培元颗粒是新疆医科大学附属中医医院院内制剂，其主要功效为益气养阴、补益脾肾，临床主要用于治疗AIDS证属气阴两虚、肺肾不足者。经长期临床观
基金项目：国家科技重大专项（2014ZX10005003）；新疆医科大学科研创新基金项目（XJC201181）
通讯作者：马建萍，E-mail：majianpingm@163.com
察发现，该制剂可明显改善AIDS患者症状，提高其生存质量，对患者CD4+T淋巴细胞水平有提高作用[1-6]。本实验通过太芪培元颗粒体外抗HIV-1病毒活性的研究，为该药作用机制研究提供参考。
1 实验材料
1.1 细胞和病毒
人T淋巴细胞系C8166和HIV-1实验株HIV-1ⅢB，英国Medical Research Council AIDS Reagent Project惠赠。按常规方法制备HIV-1ⅢB，滴定并计算病毒半数组织培养感染剂量（TCID50）。将病毒贮存液进行分装，-70 ℃保存。实验过程中细胞和病毒按照常规方法进行冻存及复苏。
1.2 药物
太芪培元颗粒，新疆华世丹药业股份有限公司，批号130808。叠氮胸苷（3'-Azido-3'-deoxythymidine，AZT），Sigma公司。
1.3 主要试剂与仪器
HEPES、MTT、DMF、青霉素、硫酸链霉素、谷氨酰胺，Sigma公司；2-巯基乙醇，Bio-Rad公司；RPMI-1640和胎牛血清，Gibco公司。酶标仪ELX-800（BIO-TEK），微量移液器（Gilson），二级生物安全柜Froma ClassⅡ、CO2细胞培养箱（Thermo Fisher）。
2 实验方法
2.1 HIV-1感染性滴定
HIV-1ⅢB按Johnson&Byington;所述方法改良进行滴定，按Reed&Muench;方法计算病毒的TCID50[7]。
2.2 C8166细胞毒性实验
将100 μL C8166细胞悬液（4×105/mL）与不同浓度待测药物溶液混合，设3个重复孔。同时设置不含任何药物的对照孔，MTT法检测细胞毒性。于酶标仪570 nm波长处测定光密度（OD）值（参考波长630 nm），计算得到对50%细胞产生毒性时的化合物浓度（CC50），即对50%正常T淋巴细胞系C8166细胞产生毒性时的药物浓度。计量资料以—x±s表示，按Reed&Muench;法计算CC50。
细胞存活率（%）=实验孔OD值÷对照孔OD值×100%
2.3 HIV-1ⅢB致细胞病变抑制实验
按100 μL/孔梯度倍比加稀释药物于96孔培养板，再将8×105/mL C8166细胞50 μL/孔接种至培养板，加50 μL HIV-1ⅢB稀释上清液，1300 TCID50/孔。设置重复孔3个，同时以不含任何药物正常细胞作为对照孔。阳性药物对照为AZT。37 ℃、5%CO2培养3 d，100倍倒置显微镜下对合胞体形成计数。50%有效浓度（EC50）为抑制合胞体形成50%时的药物浓度。计量资料以—x±s表示，按Reed&Muench;法计算EC50。
细胞病变抑制率（%）=（1-实验孔合胞体数÷对照孔合胞体数）×100%
2.4 HIV-1ⅢB急性感染C8166细胞中病毒复制抑制实验
将4×105个/mL C8166细胞与HIV-1ⅢB（MOI=0.04）、HIV-1RF（MOI=0.4）37 ℃感染2 h，1500 r/min离心，PBS洗涤3次，去除游离的病毒离子，取100 μL细胞接种至含100 μL不同稀释度待测化合物96孔板，37 ℃、5%CO2培养3 d。将培养上清液3000 r/min离心后收集，用终浓度0.5%Triton X-100裂解灭活。采用捕获p24抗原ELISA检测。2 μL/板抗鼠IgG-Fc抗体4 ℃铺板过夜；5%脱脂奶粉4 ℃封板过夜；加自制的鼠抗p24单抗100 μL/孔，置37 ℃温育60 min；加100 μL/孔裂解感染细胞培养上清，37 ℃、2 h；加100 μL/孔1∶100稀释的自制兔抗p24多抗，置37 ℃温育；加100 μL/孔1∶20 000稀释的羊抗兔IgG-HRP，置37 ℃温育；加OPD底物反应液。10 min后，2 mol/L硫酸终止反应。ELISA测定OD值，测定波长为490 nm，参考波长630 nm。计量资料以—x±s表示，计算p24抗原抑制率。
p24抗原抑制率（%）=（1-实验孔OD值÷对照孔OD值）×100%
3 结果
3.1 太芪培元颗粒的细胞毒性作用
太芪培元颗粒组CC50值为（3.761±0.370）mg/mL，明显高于AZT组（1371.37 ?g/mL）。结果见表1。
3.2 太芪培元颗粒对HIV-1ⅢB诱导C8166细胞病变的抑制作用
太芪培元颗粒组EC50值为（0.454 5±0.204 6）mg/mL与AZT组（0.458 5±0.371 6）mg/mL比较差异不明显。结果见表2。
3.3 太芪培元颗粒对HIV-1ⅢB感染C8166细胞p24表达的抑制作用
太芪培元颗粒对HIV-1复制表达p24抗原的抑制率随药物浓度的增加而升高，而对照药AZT的趋势与其相同，见表3。
3.4 太芪培元颗粒对HIV-1活性治疗指数的影响
根据实验数据及公式（治疗指数=CC50÷EC50），太芪培元颗粒合胞体抑制实验治疗指数为5.84～12.97，对照药AZT治疗指数为1 902 038～6 996 785；p24抑制实验中，太芪培元颗粒治疗指数为5.30～8.74，对照药AZT治疗指数为1 904 680～9 795 500。表明太芪培元颗粒体外抗HIV-1病毒活性较弱。
4 讨论
太芪培元颗粒用于治疗气阴两虚、肺肾不足型AIDS，以太子参、生地黄为君药。太子参味甘、微苦，归脾、肺经，功效为补气健脾、生津润肺；生地黄味甘、苦，性寒，归心、肝、肾经，功效为清热凉血、养阴生津。本方重用二药，以达益气养阴之功效。该药在临床应用中可改善患者症状体征，提高免疫力，但本研究体外抗HIV-1病毒结果显示其抗HIV活性较弱。
近年来，中医药对AIDS的防治研究成果初显，但其作用机制的研究依然是难点，尤其是中药复方的作用机制研究。在药物体外抗HIV病毒研究中，筛选了大量中药及其有效成分均有体外抗病毒活性。大量临床研究表明，中药复方在AIDS治疗的各个领域均有所长，例如对带状疱疹的中西医结合治疗，对高效抗逆转录病毒治疗相关血脂异常的研究，对患者免疫重建的研究等，均取得较好的疗效[8-11]。与此同时，研究者也指出，中医药治疗的疗效可能是通过改善患者免疫功能低下等机制起到缓解临床症状的作用，但具体作用机制及如何确定中药介入的指征和时机等问题需要深入研究[12]。
