香椿子多糖提取工艺及体外抗氧化活性研究
丁世洪 刘兵 赵淑伟 李义清 李万忠
摘要：目的 优选香椿子多糖提取工艺条件，初步确定其体外抗氧化活性。方法 以香椿子多糖含量为评价指标，提取时间、选择料液比、提取次数为考察因素，采用L9（34）正交试验设计优选提取工艺；采用总还原力法、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法测定香椿子多糖抗氧化能力。结果 香椿子多糖水提工艺优化条件为液料比1∶12，提取120 min，提取3次。香椿子多糖具有一定还原能力，对DPPH自由基（DPPH·）具有较好清除能力，随多糖浓度增加清除能力增强，并对曲线进行了方程拟合。结论 该工艺简便可行、稳定可靠，适合香椿子多糖提取的小试研究。香椿子多糖具有一定的抗氧化活性。
关键词：香椿子多糖；提取工艺；抗氧化
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.025
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）03-0091-04
Abstract： Objective To optimize the conditions of extraction process of polysaccharides from seeds of Toona sinensis； To preliminary determinate the antioxidant activity in vitro. Methods The content of polysaccharides from Toona sinensis was chosen as evaluation index； the extraction time， material liquid ratio， and extraction times were chosen as factors； L9（34） orthogonal design was used to optimize extraction process； antioxidant activity of polysaccharides from Toona sinensis was investigated by the total reducing power and 1，1-diphenyl-2-picryhydrazyl （DPPH） method. Results From the statistical data of processing， the optimal extracting conditions were as follows： liquid to material was 1：12， extraction time was 120 min， and extracted for 3 times. Polysaccharides from seeds of Toona sinensis had certain reducing capacity and had better scavenging ability on DPPH· and the scavenging rate significantly increased with the concentration. The effect was simulated by curve equation. Conclusion The process is simple， feasible， stable and reliable and can be used for the small-scale study on extraction of polysaccharides from seeds of Toona sinensis. Polysaccharides from seeds of Toona sinensis have antioxidant activity.
Key words： polysaccharides from seeds of Toona sinensis； extraction process； antioxidation
香椿是一种资源丰富、用途广泛、成本低廉、药食两用的植物，具有较好开发利用价值。香椿子系楝科植物香椿的果实。据《四川中药志》记载，香椿子性温、味辛苦，无毒，入肝、肺经，具祛风、散寒、止痛功效，主治风寒感冒、心胃气痛、风湿关节痛等。香椿子中含有酚类、鞣质、生物碱、皂苷、甾体、萜类、挥发油、多糖等成分[1-4]。植物来源多糖具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、调节免疫力、抗衰老、抗疲劳等生物活性[5-6]。为了更好地开发和利用香椿子资源，本研究初步探讨香椿子多糖提取工艺及体外抗氧化活性，为香椿子深入开发和生物活性评价奠定基础。
1 仪器与试药
紫外分光光度计UV-800A型（上海元析仪器公司）；电子分析天平EL204（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；超声波清洗仪PS-30（深圳市深华泰超声洗净设备有限公司）；旋转蒸发器RE-52系列（上海亚荣生化仪器厂）；精密电热恒温三用水箱HH600-2B（上海比朗仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱101-1AB（天津市泰斯特仪器有限公司）；KDM型调温电热套（山东鄄城创新仪器有限公司）。
香椿子购于购自济南圣科技术开发有限公司，经潍坊医学院生药学教研室许崇梅博士鉴定为楝科香椿属植物香椿Toona sinensis（A.Juss.）Roem.的果实；葡萄糖及其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 香椿子多糖鉴别方法
精密称取样品适量，加水溶解，取样品溶液1 mL，加1～3滴5% α-萘酚乙醇溶液，摇匀后沿试管壁缓缓加入浓硫酸，观察是否在中间出现紫环现象[7]。试验中出现紫环现象，说明样品中含有多糖类物质。
2.2 香椿子多糖含量测定
参照文献[8]，精密称取葡萄糖对照品50 mg，于容量瓶中加水定容，制成0.5 mg/mL对照品溶液，备用。精密称取苯酚6.0 g，置棕色容量瓶中，加水溶解摇匀，即得6%苯酚溶液（4 ℃保存）。精密移取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL对照品溶液，定容于50 mL容量瓶中。分别从中精密移取2 mL于10 mL具塞试管中，加入6%苯酚1.0 mL，再加入5.0 mL浓硫酸混匀，静置10 min，25 ℃水浴15 min，冷却至室温，以2 mL蒸馏水为空白同上操作，于490 nm处测定各样品吸光度。以多糖含量（mg）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得直线方程为Y=15.767X-0.059 8，r=0.999 0。精密称取香椿子多糖适量，按上述方法测定样品吸光度，由方程计算样品中多糖含量。
2.3 香椿子多糖提取工艺研究
2.3.1 香椿子多糖提取方法 香椿子适当粉碎，95%乙醇脱脂处理，过滤后晾干备用。取脱脂香椿子适量，精密称定，加水回流提取，抽滤后减压浓缩。浓缩液采用sevage法脱蛋白处理[9]，向脱蛋白溶液中加乙醇使含量达85%，4 ℃静置过夜，抽滤，无水乙醇洗涤3次，干燥后即得香椿子多糖。
2.3.2 正交试验设计及结果 以香椿子粗多糖含量为指标，选择提取次数、提取时间、料液比三因素三水平进行正交试验，运用正交表L9（34），优选香椿子多糖提取工艺条件，因素与水平见表1，正交试验安排及结果见表2，方差分析见表3。
由表2可知，以多糖含量为指标，各因素作用主次顺序为A>B>C，其中因素A有显著影响（P<0.05），因素B、C无显著影响（P>0.05），所以优化的香椿子多糖提取方案为A3B3C3，即提取3次，提取120 min，料液比为1∶12。
2.3.3 验证试验 根据正交试验得出的最佳组合条件，取同一批香椿子3份，按A3B3C3进行提取。香椿子多糖平均含量为18.54 mg，RSD=2.92%（n=3），说明方案稳定，最终确定较优方案为A3B3C3。
2.4 香椿子多糖体外抗氧化活性测定
2.4.1 试液配制 精密称取香椿子多糖适量，加水定容于50 mL容量瓶中，制成5 mg/mL母液备用；精密移取多糖母液适量于10 mL容量瓶，定容，摇匀，即得系列浓度的多糖溶液。
精密称取维生素C（Vc）适量，加水溶解，制成0.2 mg/mL溶液；精密移取Vc母液适量于10 mL容量瓶，定容，摇匀，即得不同浓度Vc溶液。
2.4.2 香椿子多糖总还原力测定 采用普鲁士蓝法[10]测定香椿子多糖总还原力。分别移取不同浓度Vc溶液与香椿子多糖1.0 mL于10 mL离心管中，加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸缓冲溶液2.5 mL和1%铁氰化钾溶液2.5 mL混匀，50 ℃水浴保温20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL混匀，3000 r/min离心10 min，精密移取上清液2.5 mL，加蒸馏水2.5 mL和0.1 %三氯化铁0.5 mL，静置10 min，于700 nm处测定吸光度，以蒸馏水为参比，测定3次，结果见图1、图2。
由图1可知，Vc总还原力随浓度增加而增加，在0.02～0.20 mg/mL范围内呈线性关系，回归方程为Y=5.410 5X+0.003 71，r=0.999 6；可知，当Vc=0.091 mg/mL时，吸光度为0.50，总还原力达到50%。
由图2可知，香椿子多糖具有一定还原力，总还原力随多糖浓度增加而增加，呈剂量依赖关系，在0.2～1.6 mg/mL范围内有良好线性关系，回归方程为Y=0.483 8X+0.020 2，r=0.999 5。当香椿子多糖总还原力为50 %时，多糖浓度为0.991 mg/mL。
2.4.3 香椿子多糖DPPH自由基清除率测定 参照文献[11-13]，精密移取2.0 mL不同浓度香椿子多糖溶液和Vc溶液于试管中，加入2.0 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液混匀，暗处反应30 min，517 nm处测定吸光度（Ai），同时测定2.0 mL DPPH溶液（0.04 mg/mL）与等体积蒸馏水混合溶液的吸光度（A0），不同浓度香椿子多糖溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度（Aj），以Vc作为阳性对照，平行测定3次，取平均值。根据公式DPPH·清除率（%）=（A0-Ai+Aj）÷A0×100%计算。结果见图3、图4。可见，在一定浓度范围内，香椿子多糖对DPPH·有一定清除能力；清除能力随多糖浓度增加而增加，但低于Vc对DPPH·的清除能力。
在0.002～0.007 mg/mL范围内，根据Vc清除率，利用Excel2010软件对曲线进行拟合，得方程Y=0.005 58e385.03X，r=0.998 7，可知Vc对DPPH·的IC50为0.005 7 mg/mL；在0.2～1.6 mg/mL范围内，根据香椿子多糖清除率，同法拟合方程Y=0.326 8lnX+0.779 4，r=0.986 0，可知香椿子多糖对DPPH·的IC50为0.43 mg/mL。
3 小结
本研究以多糖含量为指标，采用正交设计优化香椿子多糖提取工艺，初步建立了香椿子多糖制备方法，为后续香椿子多糖进一步分离纯化及活性评价奠定了研究基础。
香椿子多糖有一定抗氧化活性，本研究初步建立了数学模型，可为从中寻找新的清除体内自由基的抗氧化剂提供理论依据。
香椿子多糖具有抗氧化生物活性，本研究尚未对其进行分离纯化及理化性质分析，香椿子多糖构效与量效关系有待于进一步研究。
参考文献：
[1] 陈铁山，罗忠萍.香椿化学成分的初步研究[J].陕西林业科技， 2000（2）：1-2，20.
[2] 王茂丽，涂炳坤，何丹.香椿的化学成分研究进展[J].湖北林业科技， 2006（4）：38-40.
[3] 陈玉丽，阮志鹏，林立珊，等.香椿的化学成分及药理作用研究进展[J].长治医学院学报，2008，22（4）：315-317.
[4] 邢莎莎，陈超.香椿化学成分及药理作用研究进展[J].安徽农业科学， 2010，38（17）：8978-8979.
[5] 李宝霞，董双涛，霍乃蕊.黄芪多糖抗氧化活性研究[J].山西中医学院学报，2011，12（5）：18-19.
[6] 徐莹，王颖，张弢，等.杜氏藻多糖生物活性研究[J].药物生物技术， 2008，15（4）：289-292.
[7] 匡学海.中药化学[M].北京：中国中医药出版社，2002：59-60.
[8] 尼玛卓玛，刘涛，尼珍，等.苯酚-浓硫酸法测定西藏天麻中多糖含量的条件优化[J].安徽农业科学，2011，39（8）：132-134.
[9] 慧琴，霍秀文，王阳，等.山药多糖脱蛋白方法的研究[J].食品科技， 2014，39（10）：210-214.
[10] 蔡凌云，周江菊，乐利，等.空心莲子草多糖的体外抗氧化活性[J].食品科学，2011，32（17）：186-189.
[11] LUO A X， HE X J， ZHOU S D， et al. Purification， composition analysis and antioxidant activity of the polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl[J]. Carbohydrate Polymers，2010，79（4）：1014-1019.
[12] KATALINIC V， MILOS M， KULISIC T， et al. Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols[J]. Food Chemistry，2006，94（4）：550-557.
[13] APARICIO I M， PEINADO C M， ESCRIG A J， et al. Multifunctional antioxidant activity of polysaccharide fractions from the soybean byproduct okara[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（2）：245-250.
（收稿日期：2015-05-08）
（修回日期：2015-06-02；编辑：陈静）
摘要：目的 优选香椿子多糖提取工艺条件，初步确定其体外抗氧化活性。方法 以香椿子多糖含量为评价指标，提取时间、选择料液比、提取次数为考察因素，采用L9（34）正交试验设计优选提取工艺；采用总还原力法、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法测定香椿子多糖抗氧化能力。结果 香椿子多糖水提工艺优化条件为液料比1∶12，提取120 min，提取3次。香椿子多糖具有一定还原能力，对DPPH自由基（DPPH·）具有较好清除能力，随多糖浓度增加清除能力增强，并对曲线进行了方程拟合。结论 该工艺简便可行、稳定可靠，适合香椿子多糖提取的小试研究。香椿子多糖具有一定的抗氧化活性。
关键词：香椿子多糖；提取工艺；抗氧化
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.025
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）03-0091-04
Abstract： Objective To optimize the conditions of extraction process of polysaccharides from seeds of Toona sinensis； To preliminary determinate the antioxidant activity in vitro. Methods The content of polysaccharides from Toona sinensis was chosen as evaluation index； the extraction time， material liquid ratio， and extraction times were chosen as factors； L9（34） orthogonal design was used to optimize extraction process； antioxidant activity of polysaccharides from Toona sinensis was investigated by the total reducing power and 1，1-diphenyl-2-picryhydrazyl （DPPH） method. Results From the statistical data of processing， the optimal extracting conditions were as follows： liquid to material was 1：12， extraction time was 120 min， and extracted for 3 times. Polysaccharides from seeds of Toona sinensis had certain reducing capacity and had better scavenging ability on DPPH· and the scavenging rate significantly increased with the concentration. The effect was simulated by curve equation. Conclusion The process is simple， feasible， stable and reliable and can be used for the small-scale study on extraction of polysaccharides from seeds of Toona sinensis. Polysaccharides from seeds of Toona sinensis have antioxidant activity.
Key words： polysaccharides from seeds of Toona sinensis； extraction process； antioxidation
香椿是一种资源丰富、用途广泛、成本低廉、药食两用的植物，具有较好开发利用价值。香椿子系楝科植物香椿的果实。据《四川中药志》记载，香椿子性温、味辛苦，无毒，入肝、肺经，具祛风、散寒、止痛功效，主治风寒感冒、心胃气痛、风湿关节痛等。香椿子中含有酚类、鞣质、生物碱、皂苷、甾体、萜类、挥发油、多糖等成分[1-4]。植物来源多糖具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、调节免疫力、抗衰老、抗疲劳等生物活性[5-6]。为了更好地开发和利用香椿子资源，本研究初步探讨香椿子多糖提取工艺及体外抗氧化活性，为香椿子深入开发和生物活性评价奠定基础。
1 仪器与试药
紫外分光光度计UV-800A型（上海元析仪器公司）；电子分析天平EL204（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；超声波清洗仪PS-30（深圳市深华泰超声洗净设备有限公司）；旋转蒸发器RE-52系列（上海亚荣生化仪器厂）；精密电热恒温三用水箱HH600-2B（上海比朗仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱101-1AB（天津市泰斯特仪器有限公司）；KDM型调温电热套（山东鄄城创新仪器有限公司）。
香椿子购于购自济南圣科技术开发有限公司，经潍坊医学院生药学教研室许崇梅博士鉴定为楝科香椿属植物香椿Toona sinensis（A.Juss.）Roem.的果实；葡萄糖及其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 香椿子多糖鉴别方法
精密称取样品适量，加水溶解，取样品溶液1 mL，加1～3滴5% α-萘酚乙醇溶液，摇匀后沿试管壁缓缓加入浓硫酸，观察是否在中间出现紫环现象[7]。试验中出现紫环现象，说明样品中含有多糖类物质。
2.2 香椿子多糖含量测定
参照文献[8]，精密称取葡萄糖对照品50 mg，于容量瓶中加水定容，制成0.5 mg/mL对照品溶液，备用。精密称取苯酚6.0 g，置棕色容量瓶中，加水溶解摇匀，即得6%苯酚溶液（4 ℃保存）。精密移取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL对照品溶液，定容于50 mL容量瓶中。分别从中精密移取2 mL于10 mL具塞试管中，加入6%苯酚1.0 mL，再加入5.0 mL浓硫酸混匀，静置10 min，25 ℃水浴15 min，冷却至室温，以2 mL蒸馏水为空白同上操作，于490 nm处测定各样品吸光度。以多糖含量（mg）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得直线方程为Y=15.767X-0.059 8，r=0.999 0。精密称取香椿子多糖适量，按上述方法测定样品吸光度，由方程计算样品中多糖含量。
2.3 香椿子多糖提取工艺研究
2.3.1 香椿子多糖提取方法 香椿子适当粉碎，95%乙醇脱脂处理，过滤后晾干备用。取脱脂香椿子适量，精密称定，加水回流提取，抽滤后减压浓缩。浓缩液采用sevage法脱蛋白处理[9]，向脱蛋白溶液中加乙醇使含量达85%，4 ℃静置过夜，抽滤，无水乙醇洗涤3次，干燥后即得香椿子多糖。
2.3.2 正交试验设计及结果 以香椿子粗多糖含量为指标，选择提取次数、提取时间、料液比三因素三水平进行正交试验，运用正交表L9（34），优选香椿子多糖提取工艺条件，因素与水平见表1，正交试验安排及结果见表2，方差分析见表3。
由表2可知，以多糖含量为指标，各因素作用主次顺序为A>B>C，其中因素A有显著影响（P<0.05），因素B、C无显著影响（P>0.05），所以优化的香椿子多糖提取方案为A3B3C3，即提取3次，提取120 min，料液比为1∶12。
2.3.3 验证试验 根据正交试验得出的最佳组合条件，取同一批香椿子3份，按A3B3C3进行提取。香椿子多糖平均含量为18.54 mg，RSD=2.92%（n=3），说明方案稳定，最终确定较优方案为A3B3C3。
2.4 香椿子多糖体外抗氧化活性测定
2.4.1 试液配制 精密称取香椿子多糖适量，加水定容于50 mL容量瓶中，制成5 mg/mL母液备用；精密移取多糖母液适量于10 mL容量瓶，定容，摇匀，即得系列浓度的多糖溶液。
精密称取维生素C（Vc）适量，加水溶解，制成0.2 mg/mL溶液；精密移取Vc母液适量于10 mL容量瓶，定容，摇匀，即得不同浓度Vc溶液。
2.4.2 香椿子多糖总还原力测定 采用普鲁士蓝法[10]测定香椿子多糖总还原力。分别移取不同浓度Vc溶液与香椿子多糖1.0 mL于10 mL离心管中，加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸缓冲溶液2.5 mL和1%铁氰化钾溶液2.5 mL混匀，50 ℃水浴保温20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL混匀，3000 r/min离心10 min，精密移取上清液2.5 mL，加蒸馏水2.5 mL和0.1 %三氯化铁0.5 mL，静置10 min，于700 nm处测定吸光度，以蒸馏水为参比，测定3次，结果见图1、图2。
由图1可知，Vc总还原力随浓度增加而增加，在0.02～0.20 mg/mL范围内呈线性关系，回归方程为Y=5.410 5X+0.003 71，r=0.999 6；可知，当Vc=0.091 mg/mL时，吸光度为0.50，总还原力达到50%。
由图2可知，香椿子多糖具有一定还原力，总还原力随多糖浓度增加而增加，呈剂量依赖关系，在0.2～1.6 mg/mL范围内有良好线性关系，回归方程为Y=0.483 8X+0.020 2，r=0.999 5。当香椿子多糖总还原力为50 %时，多糖浓度为0.991 mg/mL。
2.4.3 香椿子多糖DPPH自由基清除率测定 参照文献[11-13]，精密移取2.0 mL不同浓度香椿子多糖溶液和Vc溶液于试管中，加入2.0 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液混匀，暗处反应30 min，517 nm处测定吸光度（Ai），同时测定2.0 mL DPPH溶液（0.04 mg/mL）与等体积蒸馏水混合溶液的吸光度（A0），不同浓度香椿子多糖溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度（Aj），以Vc作为阳性对照，平行测定3次，取平均值。根据公式DPPH·清除率（%）=（A0-Ai+Aj）÷A0×100%计算。结果见图3、图4。可见，在一定浓度范围内，香椿子多糖对DPPH·有一定清除能力；清除能力随多糖浓度增加而增加，但低于Vc对DPPH·的清除能力。
在0.002～0.007 mg/mL范围内，根据Vc清除率，利用Excel2010软件对曲线进行拟合，得方程Y=0.005 58e385.03X，r=0.998 7，可知Vc对DPPH·的IC50为0.005 7 mg/mL；在0.2～1.6 mg/mL范围内，根据香椿子多糖清除率，同法拟合方程Y=0.326 8lnX+0.779 4，r=0.986 0，可知香椿子多糖对DPPH·的IC50为0.43 mg/mL。
3 小结
本研究以多糖含量为指标，采用正交设计优化香椿子多糖提取工艺，初步建立了香椿子多糖制备方法，为后续香椿子多糖进一步分离纯化及活性评价奠定了研究基础。
香椿子多糖有一定抗氧化活性，本研究初步建立了数学模型，可为从中寻找新的清除体内自由基的抗氧化剂提供理论依据。
香椿子多糖具有抗氧化生物活性，本研究尚未对其进行分离纯化及理化性质分析，香椿子多糖构效与量效关系有待于进一步研究。
参考文献：
[1] 陈铁山，罗忠萍.香椿化学成分的初步研究[J].陕西林业科技， 2000（2）：1-2，20.
[2] 王茂丽，涂炳坤，何丹.香椿的化学成分研究进展[J].湖北林业科技， 2006（4）：38-40.
[3] 陈玉丽，阮志鹏，林立珊，等.香椿的化学成分及药理作用研究进展[J].长治医学院学报，2008，22（4）：315-317.
[4] 邢莎莎，陈超.香椿化学成分及药理作用研究进展[J].安徽农业科学， 2010，38（17）：8978-8979.
[5] 李宝霞，董双涛，霍乃蕊.黄芪多糖抗氧化活性研究[J].山西中医学院学报，2011，12（5）：18-19.
[6] 徐莹，王颖，张弢，等.杜氏藻多糖生物活性研究[J].药物生物技术， 2008，15（4）：289-292.
[7] 匡学海.中药化学[M].北京：中国中医药出版社，2002：59-60.
[8] 尼玛卓玛，刘涛，尼珍，等.苯酚-浓硫酸法测定西藏天麻中多糖含量的条件优化[J].安徽农业科学，2011，39（8）：132-134.
[9] 慧琴，霍秀文，王阳，等.山药多糖脱蛋白方法的研究[J].食品科技， 2014，39（10）：210-214.
[10] 蔡凌云，周江菊，乐利，等.空心莲子草多糖的体外抗氧化活性[J].食品科学，2011，32（17）：186-189.
[11] LUO A X， HE X J， ZHOU S D， et al. Purification， composition analysis and antioxidant activity of the polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl[J]. Carbohydrate Polymers，2010，79（4）：1014-1019.
[12] KATALINIC V， MILOS M， KULISIC T， et al. Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols[J]. Food Chemistry，2006，94（4）：550-557.
[13] APARICIO I M， PEINADO C M， ESCRIG A J， et al. Multifunctional antioxidant activity of polysaccharide fractions from the soybean byproduct okara[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（2）：245-250.
（收稿日期：2015-05-08）
（修回日期：2015-06-02；编辑：陈静）
