高效液相色谱法同时测定赶黄草中槲皮素和山柰酚含量
罗兴平 杨玲霞
摘要：目的 建立高效液相色谱法同时测定赶黄草中槲皮素和山柰酚含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为Kromasil C18柱（4.0 mm×250 mm，5.0 ?m），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（50∶50），流速1.0 mL/min，检测波长360 nm，检测温度为室温。结果 槲皮素、山柰酚分别在0.105 6～2.112 0 μg和0.023 6～0.472 μg范围内具有良好线性关系，平均回收率分别为98.46%（RSD=2.29%）和98.17%（RSD=1.99%）。结论 该法准确、灵敏，可用于赶黄草中槲皮素和山柰酚的含量测定。
关键词：赶黄草；槲皮素；山柰酚；高效液相色谱法；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.021
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）03-0077-03
Abstract： Objective To establish an HPLC method for the simultaneous content determination of quercetin and kaempferol in Penthorum Chinense Pursh. Methods The HPLC analysis was carried out on Kromasil C18 （250 mm× 4.0 mm， 5.0 μm） with a mixture of methanol-0.1% phosphate （50：50） as the mobile phase. The determination wavelength was set at 360 nm with the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at room temperature. Results The quercetin and kaempferol showed good linearity in the range of 0.105 6–2.112 0 μg and 0.023 6–0.472 μg respectively. The average recovery rates of quercetin and kaempferol were 98.46% （RSD=2.29%） and 98.17% （RSD=1.99%） respectively. Conclusion The method is accurate and sensitive， which can be used for the content determination of quercetin and kaempferol in Penthorum Chinense Pursh.
Key words： Penthorum Chinense Pursh； quercetin； kaempferol； HPLC； content determination
赶黄草为虎耳草科Saxifragaceae扯根菜属Penthorum植物扯根菜Penthorum chinense Pursh.的干燥地上部分，始载于明代《救荒本草》，苗族民间历来作为药食两用植物，被誉为“神仙草”。其性温、味甘、无毒，具有清热解毒、活血散瘀、利水消肿、退黄、平肝的功效，主要分布于华北、华东、中南及陕西、甘肃、四川和贵州等地[1-2]，近年来逐渐驯化为家种，于四川省泸州市古蔺县境内大量种植。
目前关于赶黄草的化学、药理、临床研究已取得一定进展[3-9]，以其为原料开发的肝苏片、肝苏颗粒、肝苏胶囊已在临床得到广泛应用[10-11]，有关赶黄草及其制剂的质量标准评价多为单一的槲皮素、没食子酸或总黄酮测定[12-15]。本研究采用高效液相色谱法
（HPLC）同时测定赶黄草中槲皮素和山柰酚的含量，为有效控制赶黄草及其制剂的质量，促进其进一步开发应用提供技术支持。
1 仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；梅特勒XS205DU电子天平，瑞士Mettler toledo公司；B3200S-T型超声波清洗器，上海必能信超声有限公司；MILLI Q超纯水系统，美国Millipore公司。
槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号100081-200406）；山柰酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号110861-2004050）。赶黄草分别采自四川省古蔺县、四川省成都市新都区、甘肃省康县、甘肃省天水市，由甘肃省食品药品检验所杨玲霞副主任药师鉴定为虎耳草科扯根菜属植物扯根菜Penthorum chinense Pursh.的干燥全草。甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
分别精密称取槲皮素10.56 mg、山柰酚2.36 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品储备溶液（槲皮素浓度为211.2 μg/mL，山柰酚浓度为47.2 μg/mL）。精密吸取对照品储备溶液5 mL，加甲醇定容至10 mL，即得对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
取赶黄草细粉约0.25 g，精密称定，精密加入甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，用0.46 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.3 色谱条件
色谱柱为Kromasil C18柱（4.0 mm×250 mm，5.0 ?m），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（50∶50），检测波长为360 nm，流速1.0 mL/min，温度为室温，进样量10 μL。
2.4 系统适用性试验
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按“2.3”项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。结果表明，在此色谱条件下，槲皮素和山柰酚均与样品中其他组分色谱峰基线分离，理论塔板数按槲皮素峰计算为8491，按山柰酚峰计算为5862。
2.5 线性关系考察
精密量取对照品贮备液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，用0.46 μm微孔滤膜过滤，依次进样10 μL。以槲皮素、山柰酚峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行回归计算，得回归方程。槲皮素：A=4 200 023C+34 097，r=1.000 0，槲皮素线性范围为0.105 6～2.112 0 μg；山柰酚：A=4 044 914C+113 159，r=0.999 9，山柰酚的线性范围为0.023 6～0.472 μg。结果表明，在给定的范围内槲皮素和山柰酚线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件重复进样5次，每次10 ?L，分别计算得槲皮素峰面积RSD=1.02%，山柰酚峰面积RSD=1.43%，表明精密度良好。
2.7 重复性试验
精密称取同一批赶黄草药材（四川省古蔺县1号）5份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件依次进样测定，结果槲皮素平均含量RSD=1.82%，山柰酚平均含量RSD=2.31%，表明本法重复性良好。
2.8 稳定性试验
取同一供试品溶液（四川省古蔺县1号），分别在0、2、4、8、12、16、24 h进样10 ?L，测定槲皮素和山柰酚的峰面积，结果槲皮素峰面积的RSD=2.12%，山柰酚峰面积的RSD=1.69%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.9 加样回收率试验
取已知含量的赶黄草样品（四川省古蔺县1号，槲皮素和山柰酚含量分别为5.14、0.92 mg/g）6份，精密称定，分别精密加入对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3”项下色谱条件测定，计算回收率，结果表明，槲皮素和山柰酚的平均回收率分别为98.46%（RSD=2.29%）和98.17%（RSD=1.99%），见表1、表2。本方法具有良好的准确性。
2.10 样品测定结果
采用本试验所建立的方法对5批赶黄草样品中槲皮素和山柰酚含量进行测定，计算含量，结果见表3。
3 讨论
赶黄草作为药食两用的药材资源，自明代《救荒本草》至《全国中草药汇编》均有收载，以其为原料研究开发的保健食品也因其解酒醒酒、保肝护肝作用日益受到重视。赶黄草野生资源遍及全国24个省市，但目前仅有四川省泸州市古蔺县境内有大量种植，这一宝贵的自然资源尚未被《中华人民共和国药典》收载。因此，应用现代科技手段，进一步阐明赶黄草的药效物质基础，提高赶黄草的质量标准，促进该药材的进一步推广应用具有重要的意义。
赶黄草主要含有槲皮素、山柰酚及其苷等黄酮类化合物。本试验中曾以甲醇超声提取后直接进样测定，结果槲皮素及山柰酚含量低，杂质峰多，分离度差。采用本文方法，以甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）为溶剂加热回流水解提取，槲皮素和山柰酚含量明显提高，杂质峰显著减少，各成分分离度良好。
水解条件的选择系参考2010年版《中华人民共和国药典》（一部）垂盆草项下的含量测定方法，以甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）为溶剂加热回流水解1 h。曾对提取时间进行考察，采用四川省古蔺县1号样品分别水解提取30、60、90、120 min，测定槲皮素含量分别为5.09、5.14、5.13、5.15 mg/g，山柰酚含量分别为0.87、0.92、0.93、0.90 mg/g，结果表明水解提取1 h即可提取完全。
参考文献：
[1] 王萌，吴霞，江云，等.赶黄草的研究进展[J].食品与药品，2013，15（3）：202-204.
[2] 中国植物志编委会.中国植物志（第二分册）[M].北京：科学出版社， 1992：2.
[3] 冯浩，王智民，董歌扬，等.赶黄草化学成分的研究[J].中国中药杂志， 2001，26（4）：260-261.
[4] 张旭，杨明.赶黄草有效成分的研究[J].成都中医药大学学报，2002， 25（4）：46-51.
[5] 冯浩，王智民，董歌扬，等.赶黄草化学成分的研究[J].中国中药杂志， 2001，26（4）：260-261.
[6] 付明，魏麟，余娟，等.扯根菜的化学成分研究[J].中国药学杂志，2013， 48（22）：1911-1944.
[7] 赵建勤，杨明，赵连三，等.扯根菜及其系统提取物抗乙型肝炎病毒体外实验研究[J].中西医结合肝病杂志，2002，12（1）：26-27.
[8] 张中贤，黄剑臻.赶黄草水提取物利胆退黄作用的研究[J].热带医学杂志，2008，8（2）：125-127.
[9] 成霈，顾慧莹，宋敏，等.赶黄草对预防醉酒及解酒效能研究[J].医药世界，2006（5）：142-144.
[10] 唐荣珍.肝苏颗粒治疗慢性乙型肝炎疗效观察[J].中西医结合肝病杂志，2001，11（4）：225-226.
[11] 贺劲松，郑颖俊，陈亮，等.肝苏颗粒治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床研究[J].中西医结合肝病杂志，2007，17（3）：136-138.
[12] 尚远宏，刘圆，彭镰心，等.RP-HPLC测定扯根菜中槲皮素的含量[J].华西药学杂志，2005，20（6）：559-560.
[13] 余听，朱烨，向芬，等.不同采收期赶黄草中总黄酮的含量测定[J].泸州医学院学报，2010，33（4）：370-371.
[14] 贺晓华，许龙，杜方麓，等.反相高效液相色谱法测定赶黄草中没食子酸的含量[J].中南药学，2008，6（6）：717-719.
[15] 徐珽，杨林，唐尧.高效液相色谱法测定肝苏颗粒中槲皮素的含量[J].中国医院药学杂志，2007，27（1）：123-124.
（收稿日期：2015-04-09）
（修回日期：2015-05-06；编辑：陈静）
摘要：目的 建立高效液相色谱法同时测定赶黄草中槲皮素和山柰酚含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为Kromasil C18柱（4.0 mm×250 mm，5.0 ?m），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（50∶50），流速1.0 mL/min，检测波长360 nm，检测温度为室温。结果 槲皮素、山柰酚分别在0.105 6～2.112 0 μg和0.023 6～0.472 μg范围内具有良好线性关系，平均回收率分别为98.46%（RSD=2.29%）和98.17%（RSD=1.99%）。结论 该法准确、灵敏，可用于赶黄草中槲皮素和山柰酚的含量测定。
关键词：赶黄草；槲皮素；山柰酚；高效液相色谱法；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.021
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）03-0077-03
Abstract： Objective To establish an HPLC method for the simultaneous content determination of quercetin and kaempferol in Penthorum Chinense Pursh. Methods The HPLC analysis was carried out on Kromasil C18 （250 mm× 4.0 mm， 5.0 μm） with a mixture of methanol-0.1% phosphate （50：50） as the mobile phase. The determination wavelength was set at 360 nm with the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at room temperature. Results The quercetin and kaempferol showed good linearity in the range of 0.105 6–2.112 0 μg and 0.023 6–0.472 μg respectively. The average recovery rates of quercetin and kaempferol were 98.46% （RSD=2.29%） and 98.17% （RSD=1.99%） respectively. Conclusion The method is accurate and sensitive， which can be used for the content determination of quercetin and kaempferol in Penthorum Chinense Pursh.
Key words： Penthorum Chinense Pursh； quercetin； kaempferol； HPLC； content determination
赶黄草为虎耳草科Saxifragaceae扯根菜属Penthorum植物扯根菜Penthorum chinense Pursh.的干燥地上部分，始载于明代《救荒本草》，苗族民间历来作为药食两用植物，被誉为“神仙草”。其性温、味甘、无毒，具有清热解毒、活血散瘀、利水消肿、退黄、平肝的功效，主要分布于华北、华东、中南及陕西、甘肃、四川和贵州等地[1-2]，近年来逐渐驯化为家种，于四川省泸州市古蔺县境内大量种植。
目前关于赶黄草的化学、药理、临床研究已取得一定进展[3-9]，以其为原料开发的肝苏片、肝苏颗粒、肝苏胶囊已在临床得到广泛应用[10-11]，有关赶黄草及其制剂的质量标准评价多为单一的槲皮素、没食子酸或总黄酮测定[12-15]。本研究采用高效液相色谱法
（HPLC）同时测定赶黄草中槲皮素和山柰酚的含量，为有效控制赶黄草及其制剂的质量，促进其进一步开发应用提供技术支持。
1 仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；梅特勒XS205DU电子天平，瑞士Mettler toledo公司；B3200S-T型超声波清洗器，上海必能信超声有限公司；MILLI Q超纯水系统，美国Millipore公司。
槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号100081-200406）；山柰酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号110861-2004050）。赶黄草分别采自四川省古蔺县、四川省成都市新都区、甘肃省康县、甘肃省天水市，由甘肃省食品药品检验所杨玲霞副主任药师鉴定为虎耳草科扯根菜属植物扯根菜Penthorum chinense Pursh.的干燥全草。甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
分别精密称取槲皮素10.56 mg、山柰酚2.36 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品储备溶液（槲皮素浓度为211.2 μg/mL，山柰酚浓度为47.2 μg/mL）。精密吸取对照品储备溶液5 mL，加甲醇定容至10 mL，即得对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
取赶黄草细粉约0.25 g，精密称定，精密加入甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，用0.46 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.3 色谱条件
色谱柱为Kromasil C18柱（4.0 mm×250 mm，5.0 ?m），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（50∶50），检测波长为360 nm，流速1.0 mL/min，温度为室温，进样量10 μL。
2.4 系统适用性试验
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按“2.3”项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。结果表明，在此色谱条件下，槲皮素和山柰酚均与样品中其他组分色谱峰基线分离，理论塔板数按槲皮素峰计算为8491，按山柰酚峰计算为5862。
2.5 线性关系考察
精密量取对照品贮备液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，用0.46 μm微孔滤膜过滤，依次进样10 μL。以槲皮素、山柰酚峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行回归计算，得回归方程。槲皮素：A=4 200 023C+34 097，r=1.000 0，槲皮素线性范围为0.105 6～2.112 0 μg；山柰酚：A=4 044 914C+113 159，r=0.999 9，山柰酚的线性范围为0.023 6～0.472 μg。结果表明，在给定的范围内槲皮素和山柰酚线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件重复进样5次，每次10 ?L，分别计算得槲皮素峰面积RSD=1.02%，山柰酚峰面积RSD=1.43%，表明精密度良好。
2.7 重复性试验
精密称取同一批赶黄草药材（四川省古蔺县1号）5份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件依次进样测定，结果槲皮素平均含量RSD=1.82%，山柰酚平均含量RSD=2.31%，表明本法重复性良好。
2.8 稳定性试验
取同一供试品溶液（四川省古蔺县1号），分别在0、2、4、8、12、16、24 h进样10 ?L，测定槲皮素和山柰酚的峰面积，结果槲皮素峰面积的RSD=2.12%，山柰酚峰面积的RSD=1.69%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.9 加样回收率试验
取已知含量的赶黄草样品（四川省古蔺县1号，槲皮素和山柰酚含量分别为5.14、0.92 mg/g）6份，精密称定，分别精密加入对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3”项下色谱条件测定，计算回收率，结果表明，槲皮素和山柰酚的平均回收率分别为98.46%（RSD=2.29%）和98.17%（RSD=1.99%），见表1、表2。本方法具有良好的准确性。
2.10 样品测定结果
采用本试验所建立的方法对5批赶黄草样品中槲皮素和山柰酚含量进行测定，计算含量，结果见表3。
3 讨论
赶黄草作为药食两用的药材资源，自明代《救荒本草》至《全国中草药汇编》均有收载，以其为原料研究开发的保健食品也因其解酒醒酒、保肝护肝作用日益受到重视。赶黄草野生资源遍及全国24个省市，但目前仅有四川省泸州市古蔺县境内有大量种植，这一宝贵的自然资源尚未被《中华人民共和国药典》收载。因此，应用现代科技手段，进一步阐明赶黄草的药效物质基础，提高赶黄草的质量标准，促进该药材的进一步推广应用具有重要的意义。
赶黄草主要含有槲皮素、山柰酚及其苷等黄酮类化合物。本试验中曾以甲醇超声提取后直接进样测定，结果槲皮素及山柰酚含量低，杂质峰多，分离度差。采用本文方法，以甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）为溶剂加热回流水解提取，槲皮素和山柰酚含量明显提高，杂质峰显著减少，各成分分离度良好。
水解条件的选择系参考2010年版《中华人民共和国药典》（一部）垂盆草项下的含量测定方法，以甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）为溶剂加热回流水解1 h。曾对提取时间进行考察，采用四川省古蔺县1号样品分别水解提取30、60、90、120 min，测定槲皮素含量分别为5.09、5.14、5.13、5.15 mg/g，山柰酚含量分别为0.87、0.92、0.93、0.90 mg/g，结果表明水解提取1 h即可提取完全。
参考文献：
[1] 王萌，吴霞，江云，等.赶黄草的研究进展[J].食品与药品，2013，15（3）：202-204.
[2] 中国植物志编委会.中国植物志（第二分册）[M].北京：科学出版社， 1992：2.
[3] 冯浩，王智民，董歌扬，等.赶黄草化学成分的研究[J].中国中药杂志， 2001，26（4）：260-261.
[4] 张旭，杨明.赶黄草有效成分的研究[J].成都中医药大学学报，2002， 25（4）：46-51.
[5] 冯浩，王智民，董歌扬，等.赶黄草化学成分的研究[J].中国中药杂志， 2001，26（4）：260-261.
[6] 付明，魏麟，余娟，等.扯根菜的化学成分研究[J].中国药学杂志，2013， 48（22）：1911-1944.
[7] 赵建勤，杨明，赵连三，等.扯根菜及其系统提取物抗乙型肝炎病毒体外实验研究[J].中西医结合肝病杂志，2002，12（1）：26-27.
[8] 张中贤，黄剑臻.赶黄草水提取物利胆退黄作用的研究[J].热带医学杂志，2008，8（2）：125-127.
[9] 成霈，顾慧莹，宋敏，等.赶黄草对预防醉酒及解酒效能研究[J].医药世界，2006（5）：142-144.
[10] 唐荣珍.肝苏颗粒治疗慢性乙型肝炎疗效观察[J].中西医结合肝病杂志，2001，11（4）：225-226.
[11] 贺劲松，郑颖俊，陈亮，等.肝苏颗粒治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床研究[J].中西医结合肝病杂志，2007，17（3）：136-138.
[12] 尚远宏，刘圆，彭镰心，等.RP-HPLC测定扯根菜中槲皮素的含量[J].华西药学杂志，2005，20（6）：559-560.
[13] 余听，朱烨，向芬，等.不同采收期赶黄草中总黄酮的含量测定[J].泸州医学院学报，2010，33（4）：370-371.
[14] 贺晓华，许龙，杜方麓，等.反相高效液相色谱法测定赶黄草中没食子酸的含量[J].中南药学，2008，6（6）：717-719.
[15] 徐珽，杨林，唐尧.高效液相色谱法测定肝苏颗粒中槲皮素的含量[J].中国医院药学杂志，2007，27（1）：123-124.
（收稿日期：2015-04-09）
（修回日期：2015-05-06；编辑：陈静）
