高效液相色谱法测定连花清瘟颗粒中连翘酯苷A含量
蔡清宇 唐慧慧 李曼玲 康琛
摘要：目的 建立连花清瘟颗粒中连翘酯苷A含量的高效液相色谱测定方法，为更好地控制连花清瘟颗粒质量提供参考。方法 采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为乙腈-0.4%冰醋酸（15∶85），流速为1 mL/min，柱温为室温，检测波长330 nm。结果 连翘酯苷A在0.1～1.4 μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=1240X-16.82（r=0.999 9），平均回收率为101.53%，RSD=1.71%。结论 本方法准确、可靠、重复性好，能测定连花清瘟颗粒中连翘酯苷A含量，可作为连花清瘟颗粒质量控制的含量检测方法。
关键词：连花清瘟颗粒；连翘酯苷A；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.027
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-098-03
Content Determination of Forsythoside A in Lianhua Qingwen Granules by HPLC CAI Qing-yu1， TANG Hui-hui1， LI Man-ling2， KANG Chen2 （1. Navy General Hospital， Beijing 100048， China； 2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
Abstract： Objective To provide a better reference for the quality control of Lianhua Qingwen Granules by establishing the method for the content determination of Forsythoside A in Lianhua Qingwen Granules by HPLC. Methods The chromatographic conditions were Agilent C18 as chromatographic column， acetonitrile-0.4% acetic acid （15∶85） as the mobile phase； the flow rate was 1.0 mL/min； the column temperature was at room temperature； the detection wavelength was 330 nm. Results Forsythoside A was in a good linear range between 0.1–1.4 μg； regression equation was Y=1240X?16.82 （r=0.999 9）； the average recovery was 101.53%， RSD=1.71%.Conclusion The method is accurate， reliable， and with good repeatability， which can be used for the content determination of Forsythoside A in Lianhua Qingwen Granules and the quality control of Lianhua Qingwen Granules.
Key words： Lianhua Qingwen Granules； Forsythoside A； HPLC
连花清瘟颗粒收载于2010年版《中华人民共和国药典》第二增补本，同时收载的其他剂型还有连花清瘟片、连花清瘟胶囊[1]，均由连翘、金银花、麻黄（炙）、苦杏仁（炒）、石膏、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、广藿香、大黄、红景天、薄荷脑、甘草13味中药组成。该组方源于麻杏石甘汤与银翘散，功能清瘟解毒、宣肺泄热，临床广泛用于中医辨证属表寒里热证患者的治疗，对非重症社区获得性肺炎在联合西医抗感染治疗的基础上治愈率更高，安全性好[2-4]。关于连花清瘟颗粒及另2个剂型的质量标准，目前只收载了连翘苷的含量测定项，未见制剂中连翘酯苷A的含量测定及限度规定。本研究建立高效液相色谱法（HPLC）测定其主要成分连翘酯苷A含量的方法，为提高该制剂质量标准提供依据。
1 仪器与试药
安捷伦1100液相色谱仪，CHEM32工作站，G1314A UV检测器；色谱柱kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；超声波清洗器KQ-100（昆山市超声仪器有限公司）。
连翘酯苷A对照品购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用（批号111810-201304）；连花清瘟颗粒为市售，北京以岭药业有限公司生产（批号1402080、1403004、1403079）；乙腈，甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 称取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0. 1 mg的溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70% 甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.3 阴性对照溶液的制备 取阴性样品（除连翘外其他药材制成的成药），按“2.1.2”项下方法制备，即得。
2.2 色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈- 0.4%冰醋酸（15∶85）为流动相，检测波长330 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，理论板数按连翘酯苷A峰计算不低于3 000[5]。
2.3 线性关系考察
精密吸取对照品溶液1、4、10、12、14 μL分别进样测定，记录色谱图，以对照品的峰面积为纵坐标，对照品量（μg）为横坐标进行线性回归，连翘酯苷A回归方程为Y=1240X+16.82，r=0.999 9，表明连翘酯苷A在0.1～1.4 μg范围内线性关系良好。
2.4 精密度试验
取上述已制备的供试品溶液，连续进样6次，记率录色谱图，结果计算得连翘酯苷A峰面积RSD=0.82%，表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验
取本品颗粒剂，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于第0、1、2、4、8、12、24 h进行测定，每次进样10 μL，结果供试品中连翘酯苷A含量的RSD=0.85%，表明该方法制备的供试品溶液在24 h内含量基本不变。
2.6 重复性试验
选择同一批号样品，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，测定峰面积。结果供试品中连翘酯苷A含量RSD=1.88%，重复性良好。
2.7 加样回收率试验
取已知含量的连花清瘟颗粒，按1∶1比例分别添加连翘酯苷A对照品，按“2.2”项下色谱条件，分别进样，记录色谱图，测定，结果表明平均回收率为101.53%，RSD=1.71%，见表1。
2.8 空白试验
取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，进样10 μL，结果连花清瘟颗粒的阴性对照溶液，在连翘酯苷A处未出现相同保留时间的色谱峰，表明无干扰，此方法可行。色谱图见图1。
2.9 样品测定
取连花清瘟颗粒3批，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件，平行测定3次，采用外标法计算含量，结果见表2。
3 讨论
本试验主要参考2010年版《中华人民共和国药典》（一部）中连翘药材中连翘酯苷A测定条件测定连花清瘟颗粒中连翘酯苷A含量，流动相为乙腈- 0.4%冰醋酸（15∶85），同时对流动相比例乙腈-0.4%冰醋酸（17∶83）及乙腈-0.4%冰醋酸（20∶80）进行了研究，结果均不理想，故仍选用乙腈-0.4%冰醋酸（15∶85）为流动相。
根据文献[5]确定采用甲醇后分别对60%、70%、80%不同浓度的溶剂进行试验，结果表明70%甲醇制备的样品测得含量较高，故选用70%甲醇作为提取溶剂。本研究分别对15、20、25 mL溶剂用量进行试验，结果表明，25 mL甲醇制备的样品测得含量较高，故选择加入25 mL甲醇。确定以上条件后，分别对冷浸、超声处理、回流3种不同提取方法进行试验，结果表明，超声处理及回流方法测得样品含量接近，冷浸略低，故选用超声处理作为提取方法。然后分别对超声处理20、30、40 min进行试验，结果表明，超声处理20 min略低，30、40 min测得样品含量接近，故选用超声处理30 min。
另外，本研究测得3批样品中的连翘酯苷A含量分别为15.42、17.34、18.70 mg/袋，故暂定其每袋含连翘酯苷A不得少于13 mg。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中国人民共和国药典：第二增补本[M].北京：中国医药科技出版社，2013：35-36.
[2] 李彬，孟泳.莲花清瘟颗粒治疗急性上呼吸道感染60例临床观察[J].中国民族民间医药，2014，17（9）：38-39.
[3] 周三军，方强.连花清瘟颗粒治疗痰热壅肺型社区获得性肺炎46例[J].浙江中医杂志，2014，48（11）：805.
[4] 王代平，黄巍.连花清瘟颗粒治疗非重症社区获得性肺炎疗效观察[J].热带病与寄生虫学，2014，12（3）：176-177.
[5] 国家药典委员会.中国人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：159-160.
（收稿日期：2015-05-14）
（修回日期：2015-06-01；编辑：陈静）
摘要：目的 建立连花清瘟颗粒中连翘酯苷A含量的高效液相色谱测定方法，为更好地控制连花清瘟颗粒质量提供参考。方法 采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为乙腈-0.4%冰醋酸（15∶85），流速为1 mL/min，柱温为室温，检测波长330 nm。结果 连翘酯苷A在0.1～1.4 μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=1240X-16.82（r=0.999 9），平均回收率为101.53%，RSD=1.71%。结论 本方法准确、可靠、重复性好，能测定连花清瘟颗粒中连翘酯苷A含量，可作为连花清瘟颗粒质量控制的含量检测方法。
关键词：连花清瘟颗粒；连翘酯苷A；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.027
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-098-03
Content Determination of Forsythoside A in Lianhua Qingwen Granules by HPLC CAI Qing-yu1， TANG Hui-hui1， LI Man-ling2， KANG Chen2 （1. Navy General Hospital， Beijing 100048， China； 2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
Abstract： Objective To provide a better reference for the quality control of Lianhua Qingwen Granules by establishing the method for the content determination of Forsythoside A in Lianhua Qingwen Granules by HPLC. Methods The chromatographic conditions were Agilent C18 as chromatographic column， acetonitrile-0.4% acetic acid （15∶85） as the mobile phase； the flow rate was 1.0 mL/min； the column temperature was at room temperature； the detection wavelength was 330 nm. Results Forsythoside A was in a good linear range between 0.1–1.4 μg； regression equation was Y=1240X?16.82 （r=0.999 9）； the average recovery was 101.53%， RSD=1.71%.Conclusion The method is accurate， reliable， and with good repeatability， which can be used for the content determination of Forsythoside A in Lianhua Qingwen Granules and the quality control of Lianhua Qingwen Granules.
Key words： Lianhua Qingwen Granules； Forsythoside A； HPLC
连花清瘟颗粒收载于2010年版《中华人民共和国药典》第二增补本，同时收载的其他剂型还有连花清瘟片、连花清瘟胶囊[1]，均由连翘、金银花、麻黄（炙）、苦杏仁（炒）、石膏、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、广藿香、大黄、红景天、薄荷脑、甘草13味中药组成。该组方源于麻杏石甘汤与银翘散，功能清瘟解毒、宣肺泄热，临床广泛用于中医辨证属表寒里热证患者的治疗，对非重症社区获得性肺炎在联合西医抗感染治疗的基础上治愈率更高，安全性好[2-4]。关于连花清瘟颗粒及另2个剂型的质量标准，目前只收载了连翘苷的含量测定项，未见制剂中连翘酯苷A的含量测定及限度规定。本研究建立高效液相色谱法（HPLC）测定其主要成分连翘酯苷A含量的方法，为提高该制剂质量标准提供依据。
1 仪器与试药
安捷伦1100液相色谱仪，CHEM32工作站，G1314A UV检测器；色谱柱kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；超声波清洗器KQ-100（昆山市超声仪器有限公司）。
连翘酯苷A对照品购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用（批号111810-201304）；连花清瘟颗粒为市售，北京以岭药业有限公司生产（批号1402080、1403004、1403079）；乙腈，甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 称取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0. 1 mg的溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70% 甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.3 阴性对照溶液的制备 取阴性样品（除连翘外其他药材制成的成药），按“2.1.2”项下方法制备，即得。
2.2 色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈- 0.4%冰醋酸（15∶85）为流动相，检测波长330 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，理论板数按连翘酯苷A峰计算不低于3 000[5]。
2.3 线性关系考察
精密吸取对照品溶液1、4、10、12、14 μL分别进样测定，记录色谱图，以对照品的峰面积为纵坐标，对照品量（μg）为横坐标进行线性回归，连翘酯苷A回归方程为Y=1240X+16.82，r=0.999 9，表明连翘酯苷A在0.1～1.4 μg范围内线性关系良好。
2.4 精密度试验
取上述已制备的供试品溶液，连续进样6次，记率录色谱图，结果计算得连翘酯苷A峰面积RSD=0.82%，表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验
取本品颗粒剂，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于第0、1、2、4、8、12、24 h进行测定，每次进样10 μL，结果供试品中连翘酯苷A含量的RSD=0.85%，表明该方法制备的供试品溶液在24 h内含量基本不变。
2.6 重复性试验
选择同一批号样品，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，测定峰面积。结果供试品中连翘酯苷A含量RSD=1.88%，重复性良好。
2.7 加样回收率试验
取已知含量的连花清瘟颗粒，按1∶1比例分别添加连翘酯苷A对照品，按“2.2”项下色谱条件，分别进样，记录色谱图，测定，结果表明平均回收率为101.53%，RSD=1.71%，见表1。
2.8 空白试验
取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，进样10 μL，结果连花清瘟颗粒的阴性对照溶液，在连翘酯苷A处未出现相同保留时间的色谱峰，表明无干扰，此方法可行。色谱图见图1。
2.9 样品测定
取连花清瘟颗粒3批，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件，平行测定3次，采用外标法计算含量，结果见表2。
3 讨论
本试验主要参考2010年版《中华人民共和国药典》（一部）中连翘药材中连翘酯苷A测定条件测定连花清瘟颗粒中连翘酯苷A含量，流动相为乙腈- 0.4%冰醋酸（15∶85），同时对流动相比例乙腈-0.4%冰醋酸（17∶83）及乙腈-0.4%冰醋酸（20∶80）进行了研究，结果均不理想，故仍选用乙腈-0.4%冰醋酸（15∶85）为流动相。
根据文献[5]确定采用甲醇后分别对60%、70%、80%不同浓度的溶剂进行试验，结果表明70%甲醇制备的样品测得含量较高，故选用70%甲醇作为提取溶剂。本研究分别对15、20、25 mL溶剂用量进行试验，结果表明，25 mL甲醇制备的样品测得含量较高，故选择加入25 mL甲醇。确定以上条件后，分别对冷浸、超声处理、回流3种不同提取方法进行试验，结果表明，超声处理及回流方法测得样品含量接近，冷浸略低，故选用超声处理作为提取方法。然后分别对超声处理20、30、40 min进行试验，结果表明，超声处理20 min略低，30、40 min测得样品含量接近，故选用超声处理30 min。
另外，本研究测得3批样品中的连翘酯苷A含量分别为15.42、17.34、18.70 mg/袋，故暂定其每袋含连翘酯苷A不得少于13 mg。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中国人民共和国药典：第二增补本[M].北京：中国医药科技出版社，2013：35-36.
[2] 李彬，孟泳.莲花清瘟颗粒治疗急性上呼吸道感染60例临床观察[J].中国民族民间医药，2014，17（9）：38-39.
[3] 周三军，方强.连花清瘟颗粒治疗痰热壅肺型社区获得性肺炎46例[J].浙江中医杂志，2014，48（11）：805.
[4] 王代平，黄巍.连花清瘟颗粒治疗非重症社区获得性肺炎疗效观察[J].热带病与寄生虫学，2014，12（3）：176-177.
[5] 国家药典委员会.中国人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：159-160.
（收稿日期：2015-05-14）
（修回日期：2015-06-01；编辑：陈静）
