响应面法优化桑椹黄酮超声辅助提取工艺及对酪氨酸酶活性抑制研究
王英豪 陈志春 张理平 陈桂芬 宋泽杰
摘要：目的 优选桑椹黄酮的提取工艺及其对酪氨酸酶活性的抑制。方法 在单因素试验基础上，采用响应面Box-Behnken中心组合设计试验，以乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度为自变量，黄酮含量为响应值，建立二次回归方程，研究各因素对黄酮含量的影响，同时运用多巴速率氧化法测定提取液对酪氨酸酶活性的影响。结果 通过二次回归模型响应面分析确定了超声辅助提取桑椹黄酮的最佳条件：40%乙醇，料液比1∶30，超声温度60 ℃，超声时间50 min。在此条件下，黄酮含量为（19.16±0.23）mg/g，与理论预测值吻合，酪氨酸酶抑制率为（61.47±1.79）%。结论 由响应面法优化得到的桑椹黄酮提取工艺方便可行，且具有较强的酪氨酸酶活性抑制作用。
关键词：桑椹；黄酮；响应面分析法；超声提取法；酪氨酸酶
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.026
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0093-05
Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Flavonoids from Mori Fructus by Response Surface Methodology and Study on Anti-tyrosinase Activity WANG Ying-hao1， CHEN Zhi-chun2， ZHANG Li-ping1， CHEN Gui-fen1， SONG Ze-jie1 （1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China； 2. Pingshan Pharmaceutical Factory of Fuzhou， Fuzhou 350001， China）
Abstract： Objective To optimize the extraction technology of flavonoids from Mori Fructus and study its anti-tyrosinase activity. Methods Response surface methodology Box-Behnken center combination was adopted to design the experiment based on the results of the single-factor experiments. Ethanol concentration， solid-liquid ratio， ultrasonic temperature and time were set as independent variables and flavonoid content was set as response value to establish a quadratic regression model. In addition， the effects of the extract on tyrosinase were investigated by using the rate of dopamine oxidation method. Results The optimum ultrasonic-assisted extraction technology was confirmed by response surface of quadratic regression model： ethanol concentration of 40%， solid-liquid ratio of 1：30， ultrasonic temperature of 60 ℃， and ultrasonic time of 50 min. Under these conditions， the actual contents of total flavonoids were （19.16±0.23）mg/g， which were in accordance with the theoretically predicted values. And its inhibition rate of tyrosinase activity was （61.47±1.79）%. Conclusion The extraction technology of flavonoids from Mori Fructus by response surface methodology is convenient and feasible， and has good effect of anti-tyrosinase activity.
Key words： Mori Fructus； flavonoids； response surface methodology； ultrasonic-assisted extraction technology； tyrosinase
酪氨酸酶是催化人体色素生成的限速酶，若人体的酪氨酸酶活性增强则会引起色素大量生成、沉淀，导致黄褐斑、老年斑等皮肤色素沉淀性疾病[1]。皮肤色素沉淀性疾病是皮肤科疑难病证，西医采用维甲酸、曲酸等药物治疗，但存在一定不良反应[2]。寻找有效抑制黑素生成的天然脱色剂是目前研究的热点。
基金项目：福建省自然科学基金（2013J01377）
近十几年来，从植物药中找寻天然酪氨酸酶抑制剂引起广泛关注，如白术、茯苓等[3-4]。桑椹为桑科植物桑Morus alba L.的干燥果穗，味甘酸，性寒，归心、肝、肾经，具有滋阴补血、生津润燥功效。桑椹资源丰富，药食两用，含有丰富的黄酮类物质及多种糖类、氨基酸、脂肪酸、维生素、矿物质元素，具有抗动脉粥样硬化、降糖、抗癌、抗炎和神经保护等作用[5-9]。目前响应面法已被广泛用于同时存在多因素影响的试验优化[10-11]，其具有试验组合少、求得回归方程精准度高，且可同时研究几种因素交互作用等优点。本试验采用响应面法优化桑椹总黄酮的超声辅助提取工艺，并对其抑制酪氨酸酶活性进行初步研究，以期为桑椹的开发利用提供依据。
1 仪器、试药与溶液配制
高效液相色谱仪（LC-20A，日本岛津公司），十万分之一电子天平（DV215CD，美国奥豪斯公司），紫外-可见分光光度计（UV-9100，北京瑞利分析仪器公司），超声微波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司），旋转蒸发仪（RE-52，上海亚荣生化仪器厂），电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240，上海精宏实验设备有限公司），数显恒温水浴锅（HH-4，国华电器有限公司），低速离心机（TDL80-2B，上海安亭科学仪器厂）。
芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号10080-200707），槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号10080-200907），L-多巴（西安润泽生物技术有限公司，批号060108），蘑菇酪氨酸酶（美国Sigma公司，批号CAS9002-10-2）。碳酸氢钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、磷酸二氢钠、无水乙醇等均为分析纯。桑椹药材购于福建中医药大学国医堂门诊部（产地福建省尤溪县，批号20120915），经王河山老师鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥果穗。
磷酸盐缓冲液（PBS，pH=6.8）：氢氧化钠1.9 g，磷酸二氢钠15.6 g溶于1 L双蒸水中。酪氨酸酶：临用前以PBS稀释为1000 U/mL的溶液。L-多巴：以PBS稀释为1.0 g/L的溶液。对照品溶液：分别精密称取芦丁对照品5.2 mg、槲皮素2.5 mg，分别置于25 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.208 mg/mL芦丁对照品溶液和0.208 mg/mL槲皮素对照品溶液。
2 方法与结果
2.1 黄酮含量测定
参考文献[12]方法。分别精密吸取芦丁对照品液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇至10 mL，再加入5%亚硝酸钠溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min，再加入10%硝酸铝溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液5.5 mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后，以70%乙醇作为参比溶液，于波长510 nm处测定吸光度。以吸光度值（Y）和含量（X）进行回归，求得线性回归方程Y=11.671X-0.003（r2=0.999 9），表明黄酮含量在0.104～1.664 mg范围内呈良好线性关系。
2.2 提取工艺单因素试验
2.2.1 乙醇浓度 精密称定干燥的桑椹粉末约3.0 g共5份，分别加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇60 mL，60 ℃超声提取30 min，提取液浓缩定容至10 mL。精密移取浓缩液0.25 mL至25 mL容量瓶中，按“2.1”项下方法测定，重复3次，结果见图1。可见，随着乙醇浓度的增加，提取液中黄酮含量增加，在乙醇浓度为50%时达到峰值，此后出现较大幅度下降。此外，随着乙醇浓度的增加，脂溶性提取物亦增加，会给后续纯化带来麻烦。综合考虑，乙醇浓度以50%为宜。
2.2.2 料液比 精密称定干燥的桑椹粉末约3.0 g共5份，分别加入50%乙醇30、45、60、75、90 mL，60 ℃下提取30 min。提取液浓缩定容至10 mL。按“2.1”项下方法测定，重复3次，结果见图2。可见，随着料液比的增加，黄酮含量呈上升趋势，且在1∶25时达到峰值，此后出现小幅度下降。虽然增加料液比能在一定程度上增加黄酮的提取量，但会增加生产成本且不利于后期浓缩工艺。综合考虑，料液比以1∶25为宜。
2.2.3 超声温度 精密称定干燥的桑椹粉末约3.0 g共5份，分别加入50%乙醇75 mL，分别在40、50、60、70、80 ℃提取30 min，提取液浓缩定容至10 mL。按“2.1”项下方法测定，重复3次，结果见图3。可见，随着温度的升高，黄酮的含量亦增加，但是高温可能会导致一些活性成分失活，而且会增加杂质的溶解度，同时随着温度升高，乙醇挥发更快，导致体积分数下降。综合考虑，超声温度以80 ℃为宜。
图3 超声温度对黄酮含量的影响
2.2.4 超声时间 精密称定干燥的桑椹粉末约3.0 g共5份，分别加入50%乙醇75 mL，在80 ℃分别提取10、20、30、40、50 min，提取液浓缩定容至10 mL。按“2.1”项下方法测定，重复3次，结果见图4。可见，在10～30 min内，黄酮含量迅速上升，但超过30 min后黄酮含量仅小幅提升，故超声时间以30 min为宜。
2.3 最佳工艺的响应面法优化
2.3.1 响应面试验 利用响应面法中Box-Behnken中心组合的试验设计，在单因素试验基础上，确定4个因素（自变量）的3个水平，以黄酮含量为考察指标，进行响应面法优化，采用Design-Expert 8.0.5软件进行回归分析，预测桑椹黄酮的最佳工艺参数。因素水平及编码见表1，结果见表2。
通过Design-Expert 8.0.5软件对表2数据进行多元回归拟合，获得黄酮含量（Y）对乙醇浓度（X1）、料液比（X2）、超声时间（X3）、超声温度（X4）的二次多项回归模型方程：Y=13.83-0.81X1+0.27X2+0.40X3+0.43X4-0.81X1X2+0.21X1X3+0.44X1X4-0.14X2X3+0.65X2X4-0.16X3X4-0.022X12+0.33X22+1.69X32+1.33X42。
方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对指标值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向[13]。由此可知，影响桑椹黄酮含量的因素主次顺序为：乙醇浓度>超声温度>超声时间>料液比。
2.3.2 方差分析 为了检验得到的多元二次回归模型的有效性，对该模型和模型系数显著性检验。结果显示，一次项乙醇浓度（X1）偏回归系数较为显著，二次项X32、X42偏回归系数极显著，其余变量的系数影响均不显著，表明乙醇浓度、超声时间和超声温度对桑椹黄酮含量影响较大。整体分析可知，模型P=0.027，表明选用的模型较为显著；而失拟项P>0.05，表明该模型的拟合程度良好；决定系数R2=0.958 6，表明预测值和实测值之间具有高度相关性，响应值的变化有95.86%与所选变量相关，试验结果具有较好的可靠性，可用该模型对桑椹黄酮含量进行分析和预测，见表3。
2.3.3 响应面分析与优化 通过对各因素的响应面图和等高线图的分析，可以直观地判断各因素之间的交互作用程度及各单因素的变化趋势。根据回归分析结果所得响应面图和等高线图见图5。
当超声温度和超声时间为0水平时，随着乙醇浓度的增加，黄酮含量呈下降趋势，黄酮含量最大值出现在低乙醇浓度（40%）与高料液比（1∶30）的交汇处。当料液比和超声时间为0水平时，黄酮含量随着乙醇浓度的增加而下降，在超声温度达到70 ℃前，黄酮含量小幅上升，当温度超过70 ℃后，黄酮含量显著增加。同时，黄酮含量随着超声时间的增加显著增加，最大值出现在低乙醇浓度（40%）与长超声时间（50 min）交汇处。
通过Design-Expert 8.0.5软件优化分析，获得了模型预测的最佳条件及黄酮含量理论预测值，见表4。考虑到实际操作的可行性，确定最佳条件为：乙醇体积分数40%、料液比1∶30、超声温度60 ℃、超声时间50 min。在此条件下进行验证试验，平行3次测得黄酮含量分别为19.23、19.36、18.91 mg/g，平均值19.16 mg/g，与模型预测值误差仅为3.1%，且与课题组前期试验测定的传统提取工艺中桑椹黄酮含量[（11.87±1.06）mg/g，n=3）]相比，含量显著提高（P<0.01）。因此，基于响应曲面法所得的优化工艺参数准确可靠，具有一定的实用价值。
2.4 酪氨酸酶活性抑制研究
参考文献[12]方法。采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法检测，吸取L-多巴溶液（1.0 mg/mL）1.5 mL，加PBS（pH=6.8）1.0 mL，25 ℃温浴10 min，然后加提取液（75 mg/mL）0.5 mL，同时加蘑菇酪氨酸酶（1000 U/mL）0.04 mL，在475 nm处测定样品的吸光度（加入蘑菇酪氨酸酶后立刻计时，记录5 min内每分钟末的吸光度值）。取3个样品，每个样品平行测定3次。用曲酸（0.1 mg/mL）代替提取物作为阳性组，同法测定吸光度，取平均值，计算酪氨酸酶抑制率。酪氨酸酶活性抑制率（%）=[（A1-A2）-（A3-A4）]÷（A1-A2）×l00%。式中，A1为未加提取液的加酶混合液，A2为未加提取液和酶的混合液，A3为加提取液和酶的混合液，A4为加提取液而未加酶的混合液。
桑椹提取液和曲酸阳性药对酪氨酸酶活性的抑制作用见图6。可知，桑椹提取液和曲酸对酪氨酸酶活性的抑制均在第2分钟达峰值，最佳工艺条件桑椹提取液[黄酮含量（19.16±0.23）mg/g]的酪氨酸酶活性抑制率为（61.47±1.79）%，与阳性药曲酸的抑制率[（59.70±2.02）%]相当，显著高于传统工艺桑椹提取液[黄酮含量（11.87±1.0 6）mg/g]的抑制率[（29.62±3.53）%]。提示桑椹对酪氨酸酶有较强的抑制作用，活性成分可能为黄酮类物质。随着黄酮含量的增加，抑制率亦显著增加。
3 讨论
通过单因素试验和响应面设计对桑椹黄酮超声辅助提取工艺进行优化，得到最佳工艺条件为：乙醇浓度40%、料液比1∶30、超声温度60 ℃、超声时间50 min。在此条件下，桑椹黄酮含量为（19.16±0.23）mg/g，与理论预测值19.77 mg/g误差仅为3.1%，表明所得模型拟合程度高，准确可靠，可用于桑椹黄酮超声提取工艺的优化筛选。
最佳工艺的桑椹提取液不仅黄酮含量显著提高，且体外酪氨酸酶活性抑制作用亦显著增加，其活性成分可能为黄酮类物质。提示桑椹所含黄酮类物质可进一步开发为天然的酪氨酸酶抑制剂，用于治疗皮肤色素沉淀性疾病或制备美白保健品。
参考文献：
[1] FENOLL L G， PENALVER M J， RODRIGNEZ J N， et al. Tyrosinase kinetics：Discrimination between two models to explain the oxidation mechanism of monophenol and diphenol substrates[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2004， 36（2）：235-246.
[2] 张理平，赵玲玲.抑制酪氨酸酶药物研究新进展[J].海峡药学，2009， 21（12）：124-126.
[3] 李洪武，朱文元，夏明玉，等.白术及茯苓提取物对豚鼠皮肤酪氨酸酶mRNA 基因表达水平的影响[J].中华皮肤科杂志，2001，34（2）：134-135.
[4] ORHAN E， GUNER E， OZTURK N. Enzyme inhibitory and antioxidant activity of Melia azedarach L. naturalized in Anatolia and its phenolic acid and fatty acid composition[J]. Industrial Crops and Products，2012，37：213-218.
[5] CHEN C C， LIU L K， HSU J D. Mulberry extract inhibits the development of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits[J]. Food Chemistry，2005，91：601-607.
[6] ANDALLU B， SURYAKANTHAMA V， SRIKANTHI B L， et a1. Effect of mulberry （Morus indica L.） therapy on plasma and erythrocyte membrane lipids in patients with type 2 diabetes[J]. Clinica Chimica Acta，2001，314（1/2）：47-53.
[7] CHEN P N， CHU S C， CHIOU H L. Mulberry anthocyanins， cyanidin 3-rutinoside and cyaniding 3-glucoside， exhibited an inhibitory effect on the migration and invasion of a human lung cancer cell line[J]. Cancer Letters，2006，235（2）：248-259.
[8] LIN J Y， TANG C Y. Strawberry， loquat， mulberry， and bitter melon juices exhibit prophylactic effects on LPS-induced in flammation using murine peritoneal macrophages[J]. Food Chemistry，2008，107：1587-1596.
[9] KANG T H， HUR J Y， KIM H B， et al. Neuroprotective effects of the cyanidin-3-O-β-D-glucopyranoside isolated from mulberry fruit against cerebral ischemia[J]. Neuroscience Letters，2006， 391（3）：122-126.
[10] WANG H W， LIU Y Q， WEI S L. Application of response surface methodology to optimise supercritical carbon dioxide extraction of essential oil from Cyperus rotundus Linn[J]. Food Chemistry， 2012，132：582-587.
[11] QIU L， ZHAO G， WU H， et al. Investigation of combined effects of independent variables on extraction of pectin from banana peel using response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers， 2010，80：326-331.
[12] 陈志春，王英豪.地骨皮总黄酮的提取及酪氨酸酶活性抑制研究[J].福建中医药，2012，43（4）：54-56.
[13] 肖卫华，韩鲁佳，杨增玲，等.响应面法优化黄芪黄酮提取工艺的研究[J].中国农业大学学报，2007，12（5）：52-56.
（收稿日期：2015-04-26）
（修回日期：2015-05-17；编辑：陈静）
摘要：目的 优选桑椹黄酮的提取工艺及其对酪氨酸酶活性的抑制。方法 在单因素试验基础上，采用响应面Box-Behnken中心组合设计试验，以乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度为自变量，黄酮含量为响应值，建立二次回归方程，研究各因素对黄酮含量的影响，同时运用多巴速率氧化法测定提取液对酪氨酸酶活性的影响。结果 通过二次回归模型响应面分析确定了超声辅助提取桑椹黄酮的最佳条件：40%乙醇，料液比1∶30，超声温度60 ℃，超声时间50 min。在此条件下，黄酮含量为（19.16±0.23）mg/g，与理论预测值吻合，酪氨酸酶抑制率为（61.47±1.79）%。结论 由响应面法优化得到的桑椹黄酮提取工艺方便可行，且具有较强的酪氨酸酶活性抑制作用。
关键词：桑椹；黄酮；响应面分析法；超声提取法；酪氨酸酶
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.026
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0093-05
Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Flavonoids from Mori Fructus by Response Surface Methodology and Study on Anti-tyrosinase Activity WANG Ying-hao1， CHEN Zhi-chun2， ZHANG Li-ping1， CHEN Gui-fen1， SONG Ze-jie1 （1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China； 2. Pingshan Pharmaceutical Factory of Fuzhou， Fuzhou 350001， China）
Abstract： Objective To optimize the extraction technology of flavonoids from Mori Fructus and study its anti-tyrosinase activity. Methods Response surface methodology Box-Behnken center combination was adopted to design the experiment based on the results of the single-factor experiments. Ethanol concentration， solid-liquid ratio， ultrasonic temperature and time were set as independent variables and flavonoid content was set as response value to establish a quadratic regression model. In addition， the effects of the extract on tyrosinase were investigated by using the rate of dopamine oxidation method. Results The optimum ultrasonic-assisted extraction technology was confirmed by response surface of quadratic regression model： ethanol concentration of 40%， solid-liquid ratio of 1：30， ultrasonic temperature of 60 ℃， and ultrasonic time of 50 min. Under these conditions， the actual contents of total flavonoids were （19.16±0.23）mg/g， which were in accordance with the theoretically predicted values. And its inhibition rate of tyrosinase activity was （61.47±1.79）%. Conclusion The extraction technology of flavonoids from Mori Fructus by response surface methodology is convenient and feasible， and has good effect of anti-tyrosinase activity.
Key words： Mori Fructus； flavonoids； response surface methodology； ultrasonic-assisted extraction technology； tyrosinase
酪氨酸酶是催化人体色素生成的限速酶，若人体的酪氨酸酶活性增强则会引起色素大量生成、沉淀，导致黄褐斑、老年斑等皮肤色素沉淀性疾病[1]。皮肤色素沉淀性疾病是皮肤科疑难病证，西医采用维甲酸、曲酸等药物治疗，但存在一定不良反应[2]。寻找有效抑制黑素生成的天然脱色剂是目前研究的热点。
基金项目：福建省自然科学基金（2013J01377）
近十几年来，从植物药中找寻天然酪氨酸酶抑制剂引起广泛关注，如白术、茯苓等[3-4]。桑椹为桑科植物桑Morus alba L.的干燥果穗，味甘酸，性寒，归心、肝、肾经，具有滋阴补血、生津润燥功效。桑椹资源丰富，药食两用，含有丰富的黄酮类物质及多种糖类、氨基酸、脂肪酸、维生素、矿物质元素，具有抗动脉粥样硬化、降糖、抗癌、抗炎和神经保护等作用[5-9]。目前响应面法已被广泛用于同时存在多因素影响的试验优化[10-11]，其具有试验组合少、求得回归方程精准度高，且可同时研究几种因素交互作用等优点。本试验采用响应面法优化桑椹总黄酮的超声辅助提取工艺，并对其抑制酪氨酸酶活性进行初步研究，以期为桑椹的开发利用提供依据。
1 仪器、试药与溶液配制
高效液相色谱仪（LC-20A，日本岛津公司），十万分之一电子天平（DV215CD，美国奥豪斯公司），紫外-可见分光光度计（UV-9100，北京瑞利分析仪器公司），超声微波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司），旋转蒸发仪（RE-52，上海亚荣生化仪器厂），电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240，上海精宏实验设备有限公司），数显恒温水浴锅（HH-4，国华电器有限公司），低速离心机（TDL80-2B，上海安亭科学仪器厂）。
芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号10080-200707），槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号10080-200907），L-多巴（西安润泽生物技术有限公司，批号060108），蘑菇酪氨酸酶（美国Sigma公司，批号CAS9002-10-2）。碳酸氢钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、磷酸二氢钠、无水乙醇等均为分析纯。桑椹药材购于福建中医药大学国医堂门诊部（产地福建省尤溪县，批号20120915），经王河山老师鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥果穗。
磷酸盐缓冲液（PBS，pH=6.8）：氢氧化钠1.9 g，磷酸二氢钠15.6 g溶于1 L双蒸水中。酪氨酸酶：临用前以PBS稀释为1000 U/mL的溶液。L-多巴：以PBS稀释为1.0 g/L的溶液。对照品溶液：分别精密称取芦丁对照品5.2 mg、槲皮素2.5 mg，分别置于25 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.208 mg/mL芦丁对照品溶液和0.208 mg/mL槲皮素对照品溶液。
2 方法与结果
2.1 黄酮含量测定
参考文献[12]方法。分别精密吸取芦丁对照品液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇至10 mL，再加入5%亚硝酸钠溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min，再加入10%硝酸铝溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液5.5 mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后，以70%乙醇作为参比溶液，于波长510 nm处测定吸光度。以吸光度值（Y）和含量（X）进行回归，求得线性回归方程Y=11.671X-0.003（r2=0.999 9），表明黄酮含量在0.104～1.664 mg范围内呈良好线性关系。
2.2 提取工艺单因素试验
2.2.1 乙醇浓度 精密称定干燥的桑椹粉末约3.0 g共5份，分别加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇60 mL，60 ℃超声提取30 min，提取液浓缩定容至10 mL。精密移取浓缩液0.25 mL至25 mL容量瓶中，按“2.1”项下方法测定，重复3次，结果见图1。可见，随着乙醇浓度的增加，提取液中黄酮含量增加，在乙醇浓度为50%时达到峰值，此后出现较大幅度下降。此外，随着乙醇浓度的增加，脂溶性提取物亦增加，会给后续纯化带来麻烦。综合考虑，乙醇浓度以50%为宜。
2.2.2 料液比 精密称定干燥的桑椹粉末约3.0 g共5份，分别加入50%乙醇30、45、60、75、90 mL，60 ℃下提取30 min。提取液浓缩定容至10 mL。按“2.1”项下方法测定，重复3次，结果见图2。可见，随着料液比的增加，黄酮含量呈上升趋势，且在1∶25时达到峰值，此后出现小幅度下降。虽然增加料液比能在一定程度上增加黄酮的提取量，但会增加生产成本且不利于后期浓缩工艺。综合考虑，料液比以1∶25为宜。
2.2.3 超声温度 精密称定干燥的桑椹粉末约3.0 g共5份，分别加入50%乙醇75 mL，分别在40、50、60、70、80 ℃提取30 min，提取液浓缩定容至10 mL。按“2.1”项下方法测定，重复3次，结果见图3。可见，随着温度的升高，黄酮的含量亦增加，但是高温可能会导致一些活性成分失活，而且会增加杂质的溶解度，同时随着温度升高，乙醇挥发更快，导致体积分数下降。综合考虑，超声温度以80 ℃为宜。
图3 超声温度对黄酮含量的影响
2.2.4 超声时间 精密称定干燥的桑椹粉末约3.0 g共5份，分别加入50%乙醇75 mL，在80 ℃分别提取10、20、30、40、50 min，提取液浓缩定容至10 mL。按“2.1”项下方法测定，重复3次，结果见图4。可见，在10～30 min内，黄酮含量迅速上升，但超过30 min后黄酮含量仅小幅提升，故超声时间以30 min为宜。
2.3 最佳工艺的响应面法优化
2.3.1 响应面试验 利用响应面法中Box-Behnken中心组合的试验设计，在单因素试验基础上，确定4个因素（自变量）的3个水平，以黄酮含量为考察指标，进行响应面法优化，采用Design-Expert 8.0.5软件进行回归分析，预测桑椹黄酮的最佳工艺参数。因素水平及编码见表1，结果见表2。
通过Design-Expert 8.0.5软件对表2数据进行多元回归拟合，获得黄酮含量（Y）对乙醇浓度（X1）、料液比（X2）、超声时间（X3）、超声温度（X4）的二次多项回归模型方程：Y=13.83-0.81X1+0.27X2+0.40X3+0.43X4-0.81X1X2+0.21X1X3+0.44X1X4-0.14X2X3+0.65X2X4-0.16X3X4-0.022X12+0.33X22+1.69X32+1.33X42。
方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对指标值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向[13]。由此可知，影响桑椹黄酮含量的因素主次顺序为：乙醇浓度>超声温度>超声时间>料液比。
2.3.2 方差分析 为了检验得到的多元二次回归模型的有效性，对该模型和模型系数显著性检验。结果显示，一次项乙醇浓度（X1）偏回归系数较为显著，二次项X32、X42偏回归系数极显著，其余变量的系数影响均不显著，表明乙醇浓度、超声时间和超声温度对桑椹黄酮含量影响较大。整体分析可知，模型P=0.027，表明选用的模型较为显著；而失拟项P>0.05，表明该模型的拟合程度良好；决定系数R2=0.958 6，表明预测值和实测值之间具有高度相关性，响应值的变化有95.86%与所选变量相关，试验结果具有较好的可靠性，可用该模型对桑椹黄酮含量进行分析和预测，见表3。
2.3.3 响应面分析与优化 通过对各因素的响应面图和等高线图的分析，可以直观地判断各因素之间的交互作用程度及各单因素的变化趋势。根据回归分析结果所得响应面图和等高线图见图5。
当超声温度和超声时间为0水平时，随着乙醇浓度的增加，黄酮含量呈下降趋势，黄酮含量最大值出现在低乙醇浓度（40%）与高料液比（1∶30）的交汇处。当料液比和超声时间为0水平时，黄酮含量随着乙醇浓度的增加而下降，在超声温度达到70 ℃前，黄酮含量小幅上升，当温度超过70 ℃后，黄酮含量显著增加。同时，黄酮含量随着超声时间的增加显著增加，最大值出现在低乙醇浓度（40%）与长超声时间（50 min）交汇处。
通过Design-Expert 8.0.5软件优化分析，获得了模型预测的最佳条件及黄酮含量理论预测值，见表4。考虑到实际操作的可行性，确定最佳条件为：乙醇体积分数40%、料液比1∶30、超声温度60 ℃、超声时间50 min。在此条件下进行验证试验，平行3次测得黄酮含量分别为19.23、19.36、18.91 mg/g，平均值19.16 mg/g，与模型预测值误差仅为3.1%，且与课题组前期试验测定的传统提取工艺中桑椹黄酮含量[（11.87±1.06）mg/g，n=3）]相比，含量显著提高（P<0.01）。因此，基于响应曲面法所得的优化工艺参数准确可靠，具有一定的实用价值。
2.4 酪氨酸酶活性抑制研究
参考文献[12]方法。采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法检测，吸取L-多巴溶液（1.0 mg/mL）1.5 mL，加PBS（pH=6.8）1.0 mL，25 ℃温浴10 min，然后加提取液（75 mg/mL）0.5 mL，同时加蘑菇酪氨酸酶（1000 U/mL）0.04 mL，在475 nm处测定样品的吸光度（加入蘑菇酪氨酸酶后立刻计时，记录5 min内每分钟末的吸光度值）。取3个样品，每个样品平行测定3次。用曲酸（0.1 mg/mL）代替提取物作为阳性组，同法测定吸光度，取平均值，计算酪氨酸酶抑制率。酪氨酸酶活性抑制率（%）=[（A1-A2）-（A3-A4）]÷（A1-A2）×l00%。式中，A1为未加提取液的加酶混合液，A2为未加提取液和酶的混合液，A3为加提取液和酶的混合液，A4为加提取液而未加酶的混合液。
桑椹提取液和曲酸阳性药对酪氨酸酶活性的抑制作用见图6。可知，桑椹提取液和曲酸对酪氨酸酶活性的抑制均在第2分钟达峰值，最佳工艺条件桑椹提取液[黄酮含量（19.16±0.23）mg/g]的酪氨酸酶活性抑制率为（61.47±1.79）%，与阳性药曲酸的抑制率[（59.70±2.02）%]相当，显著高于传统工艺桑椹提取液[黄酮含量（11.87±1.0 6）mg/g]的抑制率[（29.62±3.53）%]。提示桑椹对酪氨酸酶有较强的抑制作用，活性成分可能为黄酮类物质。随着黄酮含量的增加，抑制率亦显著增加。
3 讨论
通过单因素试验和响应面设计对桑椹黄酮超声辅助提取工艺进行优化，得到最佳工艺条件为：乙醇浓度40%、料液比1∶30、超声温度60 ℃、超声时间50 min。在此条件下，桑椹黄酮含量为（19.16±0.23）mg/g，与理论预测值19.77 mg/g误差仅为3.1%，表明所得模型拟合程度高，准确可靠，可用于桑椹黄酮超声提取工艺的优化筛选。
最佳工艺的桑椹提取液不仅黄酮含量显著提高，且体外酪氨酸酶活性抑制作用亦显著增加，其活性成分可能为黄酮类物质。提示桑椹所含黄酮类物质可进一步开发为天然的酪氨酸酶抑制剂，用于治疗皮肤色素沉淀性疾病或制备美白保健品。
参考文献：
[1] FENOLL L G， PENALVER M J， RODRIGNEZ J N， et al. Tyrosinase kinetics：Discrimination between two models to explain the oxidation mechanism of monophenol and diphenol substrates[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2004， 36（2）：235-246.
[2] 张理平，赵玲玲.抑制酪氨酸酶药物研究新进展[J].海峡药学，2009， 21（12）：124-126.
[3] 李洪武，朱文元，夏明玉，等.白术及茯苓提取物对豚鼠皮肤酪氨酸酶mRNA 基因表达水平的影响[J].中华皮肤科杂志，2001，34（2）：134-135.
[4] ORHAN E， GUNER E， OZTURK N. Enzyme inhibitory and antioxidant activity of Melia azedarach L. naturalized in Anatolia and its phenolic acid and fatty acid composition[J]. Industrial Crops and Products，2012，37：213-218.
[5] CHEN C C， LIU L K， HSU J D. Mulberry extract inhibits the development of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits[J]. Food Chemistry，2005，91：601-607.
[6] ANDALLU B， SURYAKANTHAMA V， SRIKANTHI B L， et a1. Effect of mulberry （Morus indica L.） therapy on plasma and erythrocyte membrane lipids in patients with type 2 diabetes[J]. Clinica Chimica Acta，2001，314（1/2）：47-53.
[7] CHEN P N， CHU S C， CHIOU H L. Mulberry anthocyanins， cyanidin 3-rutinoside and cyaniding 3-glucoside， exhibited an inhibitory effect on the migration and invasion of a human lung cancer cell line[J]. Cancer Letters，2006，235（2）：248-259.
[8] LIN J Y， TANG C Y. Strawberry， loquat， mulberry， and bitter melon juices exhibit prophylactic effects on LPS-induced in flammation using murine peritoneal macrophages[J]. Food Chemistry，2008，107：1587-1596.
[9] KANG T H， HUR J Y， KIM H B， et al. Neuroprotective effects of the cyanidin-3-O-β-D-glucopyranoside isolated from mulberry fruit against cerebral ischemia[J]. Neuroscience Letters，2006， 391（3）：122-126.
[10] WANG H W， LIU Y Q， WEI S L. Application of response surface methodology to optimise supercritical carbon dioxide extraction of essential oil from Cyperus rotundus Linn[J]. Food Chemistry， 2012，132：582-587.
[11] QIU L， ZHAO G， WU H， et al. Investigation of combined effects of independent variables on extraction of pectin from banana peel using response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers， 2010，80：326-331.
[12] 陈志春，王英豪.地骨皮总黄酮的提取及酪氨酸酶活性抑制研究[J].福建中医药，2012，43（4）：54-56.
[13] 肖卫华，韩鲁佳，杨增玲，等.响应面法优化黄芪黄酮提取工艺的研究[J].中国农业大学学报，2007，12（5）：52-56.
（收稿日期：2015-04-26）
（修回日期：2015-05-17；编辑：陈静）
