新疆圆柏叶中芦丁含量测定
李晨阳 高慧 陈燕 谭为 赵军 徐芳
摘要：目的 建立新疆圆柏叶中芦丁的含量测定方法，为其质量控制提供依据。方法 采用高效液相色谱法测定。色谱条件：Phenomenex ODS-A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.036 mol/L磷酸二元梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃，检测波长：266 nm。结果 芦丁在0.022～0.88 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 9），加样回收率为101.52%，RSD=1.67%（n=6）；样品溶液在32 h内稳定。结论 该方法操作简便，重复性好，可用于规范和控制新疆圆柏叶的药材质量。
关键词：新疆圆柏；芦丁；高效液相色谱法；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.025
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0090-03
Content Determination of Rutin in Leaves of Juniperus Sabina L. LI Chen-yang1， GAO Hui2， CHEN Yan1， TAN Wei1， ZHAO Jun1， XU Fang1 （1. Key Laboratory of Uyghur Medicine， Xinjiang Institute of Materia Medica， Urumqi 830004， China； 2. Yili Institute for Food and Drug Control， Yining 835000， China）
Abstract： Objective To establish an HPLC method for content determination of rutin in leaves of Juniperus sabina L.； To provide references for its quality control. Methods The HPLC separation was performed on a Phenomenex ODS-A column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） in gradient elute mode with a mixture consisting of acetonitrile and 0.036 mol/L phosphate acid solution at 30 ℃； the flow rate was 1.0 mL/min； the detection wavelength was set at 266 nm. Results Rutin was in a good linear range with peak area within 0.022–0.88 μg （r=0.999 9）， and the average recovery of rutin was 101.52% （RSD=1.67%， n=6）. The properties of sample solution kept steady within 32 hours. Conclusion The method is simple and reproducible， and can be used for the quality standardization and control in leaves of Juniperus sabina L.
Key words： Juniperus sabina L.； rutin； HPLC； content determination
新疆圆柏Juniperus sabina L.，又名砂地柏、臭柏，为柏科圆柏属常绿匍匐灌木，主要分布于新疆、内蒙古、甘肃等地[1]。新疆圆柏叶在新疆民间常用于治疗风湿性关节炎、类风湿关节炎、布氏杆菌病、皮肤瘙痒、小便不利、迎风流泪、视物不清、头痛等，收载于《维吾尔药志》等医药文献中[2]。黄酮类成分是柏科圆柏属植物的主要特征性成分之一[3-5]。目前对新疆圆柏的研究主要集中在化学成分及人工种植技术上[6-8]。为开发这一植物资源，提高其药材质量标准，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对不同产地新疆圆柏叶中的芦丁进行含量测定。
1 仪器与试药
LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外可
芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号100080-200707，纯度92.5%）；乙腈，色谱纯（Fisher）；甲醇，色谱纯（Fisher）；水，屈臣氏纯净水；磷酸等其他试剂为分析纯。新疆圆柏叶于2014年6月在新疆乌鲁木齐、伊犁、阿勒泰等地采集，由新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定为新疆圆柏Juniperus sabina L.的叶。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Phenomenex ODS-A柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.036 mol/L磷酸二元梯度洗脱（0 min→20 min→25 min，乙腈14%→20%→14%）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：266 nm；进样量：10 μL。
2.2 系统适用性试验
芦丁理论塔板数n=5.54（tR/Wh/2）2=19 658，说明在选定条件下，色谱柱的柱长、载体性能及色谱柱填充均符合要求，测定效果良好。芦丁分离度R=2（tR2-tR1）÷（W1+W2）=2.53，符合2010年版《中华人民共和国药典》规定分离度应大于1.5的要求。在上述色谱条件下，芦丁的色谱峰与其他成分分离度良好。色谱图见图1。
2.3 供试品溶液的制备
取新疆圆柏叶，粉碎过40目筛，脱脂，取0.1 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超声提取（功率280 W，频率25 kHz）30 min，放至室温，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4 对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.22 mg的芦丁对照品储备溶液。
2.5 线性关系考察
精密量取芦丁对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取各对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=17 720 172.68X-8910.90，r=0.999 9，表明芦丁在0.022～0.88 μg范围内线性关系良好。
2.6 日内及日间精密度试验
取同一份供试品溶液，连续进样6次测定，测得芦丁的RSD=0.83%；将上述药材连续6 d在相同时间段取样处理并测定，测得芦丁RSD=2.32%。结果表明方法精密度良好。
2.7 重复性试验
准确称取同一样品，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，并按上述色谱条件测定，测得芦丁RSD=2.59%，表明本方法重复性良好。
2.8 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0、2、5、8、24、32 h进样测定，测得芦丁RSD=1.05%，结果表明供试品溶液在32 h内稳定。
2.9 加样回收率试验
精密称取已知含量样品粉末6 份，每份约0.05 g，分别加入0.088 mg/mL芦丁对照品溶液1.9 mL，再加入甲醇20 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液并测定，结果芦丁平均回收率为101.52%，RSD=1.67%，见表1。
2.10 样品含量测定
取13批新疆圆柏叶样品粉末，约0.1 g，平行3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定芦丁含量，结果见表2。
3 讨论
新疆圆柏药材中含有大量油脂类成分，这些成分的存在影响芦丁含量测定，故测定前必须先对药材进行脱脂处理。供试品提取方法考察了不同提取溶剂、提取次数、提取时间及溶剂倍数对加热回流法的影响，确定最佳提取方法为0.1 g药材加入30 mL甲醇溶液，加热回流2次，每次1.5 h，测得芦丁含量为2.82 mg/g。同时考察了不同提取溶剂、提取时间及溶剂倍数对超声提取的影响，确定最佳提取方法为0.1 g药材加入20 mL甲醇，超声0.5 h，测得芦丁含量为3.29 mg/g。从样品提取率及节约时间考虑，确定样品制备方法为0.1 g药材加入20 mL甲醇，超声0.5 h。流动相选择考察了甲醇-磷酸水溶液和乙腈-磷酸水溶液，结果表明，乙腈-磷酸水溶液对芦丁的分离度和峰形更好，故采用乙腈-磷酸水溶液系统[9]。
本试验采样基数充足、范围广，涵盖地产新疆圆柏多数产地。13批新疆圆柏叶中芦丁含量差异较大，说明不同产地新疆圆柏叶的化学成分含量有差异，可能受气候、环境、土壤和海拔等因素的影响。本研究结果可为新疆圆柏叶药材质量标准的提高及其市场规范提供依据。
参考文献：
[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：111.
[2] 刘勇民.维吾尔药志：上册[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：550-553.
[3] 赵军，闫明，黄毅，等.新疆圆柏黄酮类成分的研究[J].林产化学与工业，2008，28（19）：33-37.
[4] 赵军，闫明，黄毅，等.新疆圆柏化学成分研究[J].中国药学杂志， 2008，32（12）：1461-1463.
[5] 田旭平，胡开峰，侯秀云，等.新疆圆柏叶挥发油化学成分变化的研究[J].林产化学与工业，2012，32（4）：123-127.
[6] 郭爱莲，朱志诚，岳明.不同季节新疆圆柏总黄酮含量的变化[J].生物技术通讯，2006，17（3）：387-388.
[7] 许芳，赵军，徐芳，等.新疆圆柏枝叶化学成分研究[J].中药材，2013， 36（12）：1957-1959.
[8] 玛依拉·买买提依明，满尔哈巴·海如拉，于睿，等.新疆圆柏叶药材质量标准的探讨[J].时珍国医国药，2010，21（7）：1686-1687.
[9] 张文斌，赵汝海，程斌.HPLC法测定新疆圆柏叶中槲皮素的含量[J].解放军药学学报，2004，20（3）：223-224.
（收稿日期：2015-04-08）
（修回日期：2015-04-16；编辑：陈静）
摘要：目的 建立新疆圆柏叶中芦丁的含量测定方法，为其质量控制提供依据。方法 采用高效液相色谱法测定。色谱条件：Phenomenex ODS-A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.036 mol/L磷酸二元梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃，检测波长：266 nm。结果 芦丁在0.022～0.88 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 9），加样回收率为101.52%，RSD=1.67%（n=6）；样品溶液在32 h内稳定。结论 该方法操作简便，重复性好，可用于规范和控制新疆圆柏叶的药材质量。
关键词：新疆圆柏；芦丁；高效液相色谱法；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.025
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0090-03
Content Determination of Rutin in Leaves of Juniperus Sabina L. LI Chen-yang1， GAO Hui2， CHEN Yan1， TAN Wei1， ZHAO Jun1， XU Fang1 （1. Key Laboratory of Uyghur Medicine， Xinjiang Institute of Materia Medica， Urumqi 830004， China； 2. Yili Institute for Food and Drug Control， Yining 835000， China）
Abstract： Objective To establish an HPLC method for content determination of rutin in leaves of Juniperus sabina L.； To provide references for its quality control. Methods The HPLC separation was performed on a Phenomenex ODS-A column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） in gradient elute mode with a mixture consisting of acetonitrile and 0.036 mol/L phosphate acid solution at 30 ℃； the flow rate was 1.0 mL/min； the detection wavelength was set at 266 nm. Results Rutin was in a good linear range with peak area within 0.022–0.88 μg （r=0.999 9）， and the average recovery of rutin was 101.52% （RSD=1.67%， n=6）. The properties of sample solution kept steady within 32 hours. Conclusion The method is simple and reproducible， and can be used for the quality standardization and control in leaves of Juniperus sabina L.
Key words： Juniperus sabina L.； rutin； HPLC； content determination
新疆圆柏Juniperus sabina L.，又名砂地柏、臭柏，为柏科圆柏属常绿匍匐灌木，主要分布于新疆、内蒙古、甘肃等地[1]。新疆圆柏叶在新疆民间常用于治疗风湿性关节炎、类风湿关节炎、布氏杆菌病、皮肤瘙痒、小便不利、迎风流泪、视物不清、头痛等，收载于《维吾尔药志》等医药文献中[2]。黄酮类成分是柏科圆柏属植物的主要特征性成分之一[3-5]。目前对新疆圆柏的研究主要集中在化学成分及人工种植技术上[6-8]。为开发这一植物资源，提高其药材质量标准，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对不同产地新疆圆柏叶中的芦丁进行含量测定。
1 仪器与试药
LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外可
芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号100080-200707，纯度92.5%）；乙腈，色谱纯（Fisher）；甲醇，色谱纯（Fisher）；水，屈臣氏纯净水；磷酸等其他试剂为分析纯。新疆圆柏叶于2014年6月在新疆乌鲁木齐、伊犁、阿勒泰等地采集，由新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定为新疆圆柏Juniperus sabina L.的叶。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Phenomenex ODS-A柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.036 mol/L磷酸二元梯度洗脱（0 min→20 min→25 min，乙腈14%→20%→14%）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：266 nm；进样量：10 μL。
2.2 系统适用性试验
芦丁理论塔板数n=5.54（tR/Wh/2）2=19 658，说明在选定条件下，色谱柱的柱长、载体性能及色谱柱填充均符合要求，测定效果良好。芦丁分离度R=2（tR2-tR1）÷（W1+W2）=2.53，符合2010年版《中华人民共和国药典》规定分离度应大于1.5的要求。在上述色谱条件下，芦丁的色谱峰与其他成分分离度良好。色谱图见图1。
2.3 供试品溶液的制备
取新疆圆柏叶，粉碎过40目筛，脱脂，取0.1 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超声提取（功率280 W，频率25 kHz）30 min，放至室温，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4 对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.22 mg的芦丁对照品储备溶液。
2.5 线性关系考察
精密量取芦丁对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取各对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=17 720 172.68X-8910.90，r=0.999 9，表明芦丁在0.022～0.88 μg范围内线性关系良好。
2.6 日内及日间精密度试验
取同一份供试品溶液，连续进样6次测定，测得芦丁的RSD=0.83%；将上述药材连续6 d在相同时间段取样处理并测定，测得芦丁RSD=2.32%。结果表明方法精密度良好。
2.7 重复性试验
准确称取同一样品，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，并按上述色谱条件测定，测得芦丁RSD=2.59%，表明本方法重复性良好。
2.8 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0、2、5、8、24、32 h进样测定，测得芦丁RSD=1.05%，结果表明供试品溶液在32 h内稳定。
2.9 加样回收率试验
精密称取已知含量样品粉末6 份，每份约0.05 g，分别加入0.088 mg/mL芦丁对照品溶液1.9 mL，再加入甲醇20 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液并测定，结果芦丁平均回收率为101.52%，RSD=1.67%，见表1。
2.10 样品含量测定
取13批新疆圆柏叶样品粉末，约0.1 g，平行3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定芦丁含量，结果见表2。
3 讨论
新疆圆柏药材中含有大量油脂类成分，这些成分的存在影响芦丁含量测定，故测定前必须先对药材进行脱脂处理。供试品提取方法考察了不同提取溶剂、提取次数、提取时间及溶剂倍数对加热回流法的影响，确定最佳提取方法为0.1 g药材加入30 mL甲醇溶液，加热回流2次，每次1.5 h，测得芦丁含量为2.82 mg/g。同时考察了不同提取溶剂、提取时间及溶剂倍数对超声提取的影响，确定最佳提取方法为0.1 g药材加入20 mL甲醇，超声0.5 h，测得芦丁含量为3.29 mg/g。从样品提取率及节约时间考虑，确定样品制备方法为0.1 g药材加入20 mL甲醇，超声0.5 h。流动相选择考察了甲醇-磷酸水溶液和乙腈-磷酸水溶液，结果表明，乙腈-磷酸水溶液对芦丁的分离度和峰形更好，故采用乙腈-磷酸水溶液系统[9]。
本试验采样基数充足、范围广，涵盖地产新疆圆柏多数产地。13批新疆圆柏叶中芦丁含量差异较大，说明不同产地新疆圆柏叶的化学成分含量有差异，可能受气候、环境、土壤和海拔等因素的影响。本研究结果可为新疆圆柏叶药材质量标准的提高及其市场规范提供依据。
参考文献：
[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：111.
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[5] 田旭平，胡开峰，侯秀云，等.新疆圆柏叶挥发油化学成分变化的研究[J].林产化学与工业，2012，32（4）：123-127.
[6] 郭爱莲，朱志诚，岳明.不同季节新疆圆柏总黄酮含量的变化[J].生物技术通讯，2006，17（3）：387-388.
[7] 许芳，赵军，徐芳，等.新疆圆柏枝叶化学成分研究[J].中药材，2013， 36（12）：1957-1959.
[8] 玛依拉·买买提依明，满尔哈巴·海如拉，于睿，等.新疆圆柏叶药材质量标准的探讨[J].时珍国医国药，2010，21（7）：1686-1687.
[9] 张文斌，赵汝海，程斌.HPLC法测定新疆圆柏叶中槲皮素的含量[J].解放军药学学报，2004，20（3）：223-224.
（收稿日期：2015-04-08）
（修回日期：2015-04-16；编辑：陈静）
