重楼种苗繁育研究进展
罗敏 李娟 章文伟 邓才富 谭秋生
摘要：重楼为我国名贵中药材，极具药用价值。近年来重楼药材需求量逐渐增加，人工栽培存在瓶颈，野生资源开采陷入恶性循环，且已严重透支。因此，在加强重楼资源保护的同时，积极深入开展基础研究，破解种苗繁育问题，推动人工栽培，以满足市场需求，对实现重楼资源的可持续发展和采用具有重要意义。本文综述了重楼种苗繁育现状，包括种子繁殖、茎段繁殖及组织培养等，为重楼规范化种植、资源保护与利用提供参考。
关键词：重楼；种苗繁育；组织培养；综述
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.032
中图分类号：R282.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）01-0120-05
Research Progress in Seeding Breeding of Paridis Rhizoma LUO Min， LI Juan， ZHANG Wen-wei， DENG Cai-fu， TAN Qiu-sheng （Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation， Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Chongqing 408435， China）
Abstract： Paridis Rhizoma is a rare Chinese herbal medicine with variety of medicinal values. In recent years， the demand for Paridis Rhizoma has increased gradually. Artificial cultivation has met difficulties， while exploitation of wild resources was caught in a vicious circle and has overdrawn seriously. So it is of great significance to enhance the protection of Paridis Rhizoma， carry out basic research， in order to solve problems in seeding breeding， promote artificial cultivation to meet the market need and achieve sustainable development and supply. This article reviewed the status qua of seedling breeding of Paridis Rhizoma， including seed breeding， tuber breeding and tissue culture， with a purpose to standardize planting of resource conservation and utilization of Paridis Rhizoma.
Key words： Paridis Rhizoma； seeding breeding； tissue culture； review
中药材重楼为百合科重楼属植物云南重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand. -Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var. chinensis （Franch.）Hara的干燥根[1]。《神农本草经》与《本草纲目》对其药用情况具有较详细的记载，是云南白药系列、宫血宁胶囊等产品的主要原料。近年来对重楼资源需求逐年增加，但忽视了对重楼资源的保护和繁育，乱采滥挖现象凸显，重楼野生资源已陷入开采的恶性循环，导致野生资源严重透支。因此，人工种养亟待升级，其中，种苗繁育是野生资源人工栽培研究、中药材规范化种植及整个中药产业发展的源头。但目前重楼种苗繁育研究出现瓶颈，如何有效、快捷解决“源头之困”已成为当务之急。兹就近年来重楼
种苗繁育技术方面的研究进行系统综述，以期为中药材重楼种苗繁育及人工栽培提供参考。
1 种子繁殖
1.1 种子休眠机理研究
重楼的种子产量较大，通过种子的有性繁殖是获得大量种苗的有效方法。但重楼种子具有“二次休眠”的生理特性，出苗率极低，不足50.0%，大量种子在漫长的休眠期内丧失了生命力[2]，并且出苗不一致，生长不整齐。因此，研究重楼种子休眠的物质表现、引起休眠的原因及休眠过程中具有的变化等问题，对掌握重楼种子的休眠机理具有重要意义。
种子休眠是物种适应自然的一种生态策略，不同物种具有不同休眠机制。目前公认的种子休眠三大原因，包括种皮吸水障碍、胚休眠和萌发抑制物的存在。黄氏等[3]通过对滇重楼种子吸水特性的研究排除了种皮吸水障碍因素的存在；且该团队将滇重楼种子的二次发育划分为形态-生理后熟休眠类型，且存在胚休眠现象。重楼果实成熟时，种胚生长还停留在球形期[4-5]。
在植物的自然休眠过程中，内源激素是一个重要的影响因子。其中，脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）是控制种子休眠与萌发的主要内源激素[6-7]。研究表明，最终重楼种胚的休眠解除是ABA减少与促萌物质GA3增加和积累的结果[3，8]。另外，滇重楼的外种皮对维持种子休眠也起着重要作用，种皮内存在一定活性的抑制物质[9]，对胚根生长具有明显抑制作用[10-11]。自然条件下，生境中较长的低温时期或许是导致重楼种子休眠时间较长的外界原因。
目前对重楼种子休眠原因的研究中排除了种皮吸水障碍这一因素，主要集中于胚休眠及存在萌发抑制物两方面。其中滇重楼种子的发育程度其实与植株生长环境，如海拔、气候、野生与否及果实采收时间等无关[12]，那么，是否可以推论其胚发育不完全或许是滇重楼的一种稳定遗传性状，主要受基因控制。另外，从内源激素说方面主要考虑的是某种激素（如ABA、GA）含量的变化。然而，种子含有多种激素，可否推测并非某一种或两种物质的变化，而是多种物质间存在着一种平衡，正是这种平衡关系抑制了种子的萌发，导致休眠时间较长。以上推测均有待进一步研究验证。
1.2 休眠破解方法研究
重楼种子休眠程度高、萌发速率慢及萌发率低等客观因素极大地限制了重楼人工栽培，造成种子繁殖一直未能在实际生产中得以广泛应用，成为制约重楼依靠种子繁育种苗的一个重要瓶颈。因此，如何打破其种子休眠期，缩短后熟时间，提高种子的发芽率及出苗整齐率等是目前研究的一大难题。
目前，多数研究采集重楼果实之后均通过清水浸泡或与细沙混合的方式搓去外种皮[13-15]，并刺激内种皮以增加通透性，为子叶的脱壳创造有利条件[16]。研究表明，低温沙藏有益于重楼种子催芽[17]，在4 ℃条件下采用干沙和湿沙层积后种子的萌动率可达65%，但仍不能萌发，而只是解除了形态学休眠[18]。变温层积则可在3个月内打破重楼种子休眠[19]。在培养基中添加GA等植物激素对滇重楼种子休眠破除和种子的萌动萌发具有重要影响[20]，增加环境中GA/ABA值可缩短重楼种子萌发时间，增加出苗率[21]。基于以上研究，有学者综合考虑温度、层积与激素的协同作用，通过设置不同梯度组合，以期筛选出打破重楼种子休眠的最佳处理。如熊氏等[22]将重楼种子经4、40 ℃变温处理，红外光照射后再用硝酸钾、GA3混合液保湿，休眠解除且萌发率达40.0%。去外种皮后利用4 ℃湿沙层积与GA的协同作用使种子萌发率达68.6%[19]。张氏等[23]将重楼种子细沙层积后经5、20 ℃二次交替变温处理，用GA3浸泡后在20 ℃下催芽60 d可使发芽率达到90%以上。另外，杨氏等[24]初步建立了滇重楼种子无菌萌发胚根和胚芽培养体系，但对于用离体培养缩短其形态学和生理学后熟，用处于萌动状态的种子育苗能否缩短种子育苗时间并提高出苗率，仍需进一步深入研究。
综上所述，目前解除重楼种子休眠多采用变温层积与激素处理相结合的方法。利用变温层积打破种子形态学休眠，再利用激素处理解除生理休眠。变温层积低温多为4 ℃或5 ℃，催芽温度为重楼种子萌发最适温度20 ℃，而高温处理具有较大差异，且变温层积的处理时间亦不同，发芽率也存在显著差异。总体而言，目前虽在萌发机制、休眠解除等方面取得了一些效果，但在如何更有效、快捷地解除重楼种子休眠、缩短种子萌发时间、提高萌发率与出苗整齐率等方面仍无突破性进展。笔者建议，今后可开展种子休眠基因的识别与定位、种子休眠相关基因的表达方式和遗传方式等相关研究，通过分子生物学技术来破解休眠。总之，寻求有效而稳定的重楼种子休眠解除方法仍任重而道远。
2 根茎切段繁殖
根茎切段繁殖是迄今重楼生产最为常用的繁殖方式之一。该方法简单易用，常年可种植，且可快速繁殖重楼种苗，又能缩短种植周期，新植株3年后即可采收根茎入药[25]。目前，在实际生产中，根茎的切割研究已相对较为成熟。在切取根茎段时，研究者多以节为基础进行切割，切口位于相邻两节的中部，切段伤口采用草木灰、生石灰或高锰酸钾溶液处理[5，16]。
重楼根茎切段繁殖包括带顶芽部位与不带顶芽部位两种。虽然两者均可出苗，但带顶芽好于不带顶芽，其茎尖出苗率为79.3%，而中下部的出苗率仅10.7%[16]；带顶芽切段根茎的生长量是不带顶芽切段的1.5～2.5倍[26]；且带顶芽切段亦比种子繁殖好，其成苗率达98%以上[5]。李氏等[17]研究发现，带顶芽切段于种植的翌年成苗，出苗率可达100%，并开花结实；而不带顶芽切段第3年才萌发出土，出苗率为92%左右。经3年种植后，顶芽切段的根茎鲜重达42.3 g，而无顶芽的仅8.2 g。
以上研究表明，重楼根茎切块繁殖技术已趋于成熟。但在实际大田种植时，由于土壤温度与湿度无法控制，切段伤口愈合不理想，易感染菌类而致根茎溃烂，种质材料损失大；加之潜伏芽萌发时间长，萌发率较低，多芽同时萌发更少，导致总的繁殖系数降低，生产出的种苗质量亦不高。或许外缘植物生长调节剂的使用对切段进行处理将取得更好的效果[27]。陈氏等[28]用不同浓度的GA3、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、生根粉（ABT1）溶液处理重楼根茎切段，结果表明，用2 mg/L 6-BA和适宜浓度ABT1能提高根茎切段繁殖率，且2 mg/L 6-BA处理可显著提高切段多芽率，ABT1能促进根状茎切段不定根的产生，同时对潜伏芽的萌动亦具有显著作用。
重楼根茎切块繁殖是目前最为成功的繁殖方式，但根茎本是其药用部位，利用根茎切块生产种苗耗种量大，增加了生产成本。加之存在种苗退化、切面大而易感染病害、出苗不整齐等问题。因此，根茎切块繁殖方法仍需进一步改进与完善。
3 组织培养繁殖
利用组织培养技术可在短时间内大量繁殖性状优良的幼苗，且不受地区、季节等因素限制，全年均可生产，是解决珍稀濒危药用植物资源的重要途径之一，且已在多种药用植物上取得成功[29-30]。鉴于组织培养途径的优越性，目前该技术已成为业界最为关注的用于突破重楼无性快繁瓶颈的方法之一。早在20世纪已有研究者试图建立重楼的离体快繁体系，但至今尚未取得令人满意的结果。
3.1 愈伤组织诱导
目前已对重楼不同器官进行愈伤组织诱导培养开展了研究，但结果不甚理想。李氏等[31-32]在筛选外植体时发现，重楼根、茎、叶片和花蕾不能诱导出愈伤组织，接种后极少启动，约2个月后则干枯死亡；根茎、子房及幼芽能不同程度地诱导出愈伤组织，且幼芽诱导出的愈伤组织数最多，诱导频率最高（26.7%），甚至诱导出小球茎。但由根茎诱导的愈伤组织质地较疏松，易纤维化，从而失去增殖能力；子房形成的愈伤组织也较疏松，易褐变。熊氏等[33]发现，种胚在胚乳看护培养的条件下能成功诱导出愈伤组织，比李氏等[31]以芽为材料的诱导率更高，且不受外植体取材时间的限制；但诱导出的愈伤组织偏紧密，不利于其快速繁殖；茎尖作为外植体时能诱导出愈伤组织，但生长缓慢，并且不含原植物中的皂苷。另外，外植体的不同取材时期对愈伤组织的诱导亦具有一定影响。研究显示，以展叶期旺盛生长的根茎诱导频率最高（16.6%），萌芽期次之；而在花冠露白期和倒苗期，根茎则很难诱导出愈伤组织[32]。
由此可见，利用组织培养来繁殖重楼种苗的难度很大，只有幼芽能成功诱导出植株，而茎尖的诱导虽能成功启动，但效率较低，且不含皂苷成分。种胚、根茎和子房虽也可产生愈伤组织，但其增殖受到极大限制。目前关于采用重楼其他外植体成功组织培养的研究也鲜有报道。另外，愈伤组织增殖分化时间长、速率缓慢等问题也需进一步研究与解决。
3.2 无菌培养物建立
目前的重楼组织培养过程中污染问题严重，对实验造成极大影响。其外因主要是在接种或培养过程中由于环境因素及操作不当而引起，该污染可通过对接种室、培养室环境消毒及加强人员无菌操作意识等加以避免；内因则是由外植体表面或内部带菌所引起。由于内生真菌培养在初期未立刻显现出来，在继代过程中才不断出现，污染材料，导致诱导率下降。鉴于此，今后研究需对外植体采取相应的消毒措施。
尽管早期研究以200 mg/L羧苄西林钠和头孢唑林钠的抑菌效果最好，但目前常用0.5%消毒灵液、70%或75%酒精和0.1%氯化汞（HgCl2）进行消毒[34]。王氏等[35]将带芽根茎用0.5%消毒灵液浸泡10 min，流水冲洗干净并晾干后，在超净工作台上用70%酒精消毒30 s，再用0.1% HgCl2处理数分钟后无菌水冲洗干净，结果用HgCl2消毒8 min时，其污染率较低，为（11.97±0.91）%，启动率高达（84.82±2.59）%。
3.3 培养基配方
组织培养技术中培养基筛选同样至关重要。李氏等[31-32]发现，对茎尖启动较好的培养基为植物基本培养基（MS）+2.0 mg/L激动素（KT）+2.0 mg/L吲哚乙酸（IAA）和MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L IAA，启动率超过30%，且IAA比其他生长素（如吲哚丁酸等）更有利于外植体的启动。幼芽在培养基MS+1.0 mg/L BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）+1.0 mg/L IAA上诱导愈伤组织的频率较高，在MS+1.0 mg/L BA+2.0 mg/L IAA和MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L IAA上还可诱导球茎的形成。研究表明，去芽鞘的芽外植体的最佳培养基配方为MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L IAA，诱导率高达57.0%[34]；其愈伤组织增殖最佳培养基配方为MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L萘乙酸（NAA）[36]。在胚乳看护下的种胚则以MS+2 mg/L IAA+0.02 mg/L 6-BA为诱导愈伤组织的最佳培养基，诱导率达53.3%[33]。
目前对重楼组织培养技术研究成功的报道甚少，较为成功的是杨氏等[36]首次在离体条件下实现了滇重楼的植株再生。该研究以芽为外植体，分别经愈伤组织诱导培养基、增殖分化培养基和生根培养基的培养，将根长为2～3 cm的芽移栽至腐殖土180 d左右形成完整植株，出土展叶成活率可达65%。但该研究尚存在愈伤组织增殖分化时间长的问题，其一个增殖周期需210～240 d。
生长素和细胞分裂素种类和配比对愈伤组织诱导效果的影响很大。以上研究生长调节剂的使用主要集中于6-BA、NAA、KT、IAA及2，4-D，但在培养基配方中的添加量存在差异，如6-BA差异最为显著，同为愈伤组织诱导培养基，添加量在0.02～2.00 mg/L均有出现，这或许是因外植体的不同而相异。另外，总体而言愈伤组织诱导率并不高，增殖分化时间过长，均未达理想状态。
总之，培养基的配方至今未有较为统一的模式，愈伤组织诱导、增殖分化及生根培养3种培养基的最佳配方仍需不断摸索。
4 展望
鉴于重楼的药用价值，其生产原料来源一直较为紧张，野外掠夺性采挖致生态环境被人为破坏，因此，急需大规模人工引种栽培。虽然重楼根茎切块繁殖是目前最为常用和成熟的种苗繁殖方式，但耗种量大，生产成本高，且存在种苗退化等问题，因此，该方法仍需改进与完善。
重楼种子产量较大，种子繁殖系数大，是获得大量种苗的有效方法，在对其萌发机制、休眠解除方面研究已取得一定进展，利用变温层积与激素处理相结合的方法得到一定成效，但在如何更高效、快捷地解除种子繁育中的休眠、后熟时间、发芽率、出苗整齐率等方面仍需进一步研究。
重楼组织培养育苗研究进展缓慢，重楼自身的组织细胞脱分化能力较低、细胞分裂速度慢，同时在组培过程中还存在外植体选择、消毒和培养基筛选等限制，使该技术还未能在实际生产中得到广泛应用，今后需加大重楼组织培养育苗的研究力度。
总之，目前对重楼种苗繁育的研究虽已取得了初步成果，但总体而言，基础研究尤其是应用基础方面的研究尚不足，多手段、多渠道有效解决重楼繁殖问题仍需开展大量、更深入的研究，为重楼野生资源的保护、可持续开发利用，以及生产应用中原材料的供应提供有力保障。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：243.
[2] 李运昌.重楼属植物引种栽培的研究——滇重楼的有性繁殖试验初报[J].云南植物研究，1982，4（4）：429-431.
[3] 黄玮，孟繁蕴，张文生，等.滇重楼种子休眠机理研究[J].中国农学通报，2008，24（12）：242-246.
[4] 袁理春，陈翠，杨丽云，等.温度和赤霉素对重楼种子二次发育的影响[J].种子，2003（5）：33-34.
[5] 陈翠，康平德，杨丽云，等.云南重楼种苗繁育技术[J].中国现代中药， 2010，12（2）：23-25.
[6] ABDALLAH A D， BARHOUMI Z， SMAOUI A， et al. ABA， GA， and nitrate may control seed germination of Crithmum maritimum （Apiaceae） under salone conditions[J]. Comptes Rendus Biol，2009，332（8）：704-710.
[7] KUCERA B， COHN MA， LEUBNER-METZGER G. Plant hormone interactions during seed dormancy release and germination[J]. Seed Sci Res， 2007，15（4）：281-307.
[8] 孟繁蕴，汪丽娅，张文生，等.滇重楼种胚休眠和发育过程中内源激素变化的研究[J].中医药学报，2006，34（4）：36-38.
[9] 古今，吴梅，李文春，等.滇重楼种子中萌发抑制物质活性的研究[J].现代中药研究与实践，2013，27（1）：10-12.
[10] 赵东兴，李春，赵国祥，等.云南地道药材滇重楼的研究进展[J].热带农业科学，2014，34（1）：42-47.
[11] 王跃华，田孟良，蒋婷婷，等.华重楼种子外皮的化感作用研究[J].西南农业学报，2012，25（1）：340-342.
[12] 陈伟，马绍宾，陈宏伟.生境对滇重楼种子发育与萌发的影响[J].湖北农业科学，2011，50（5）：972-974.
[13] 周浓，张玉莲，郭冬琴，等.滇重楼总黄酮提取工艺的正交试验法优选[J].时珍国医国药，2014，25（3）：581-583.
[14] 刘涛，谢世清，赵银河，等.滇重楼林下规范化种植生产标准操作规程（SOP）[J].现代中药研究与实践，2014，28（2）：3-6.
[15] 周浓，李自勤，姜北，等.超声波对滇重楼种子萌发能力的影响[J].湖北农业科学，2012，51（1）：114-116.
[16] 李荣英，段立胜，唐德英.重楼种苗繁育试验[J].时珍国医国药， 2006，17（12）：2639.
[17] 李绍平，杨丽英，杨斌，等.滇重楼高效繁育和高产栽培研究[J].西南农业学报，2008，21（4）：956-959.
[18] 张琳，李海峰，张德全，等.层积和赤霉素协同作用对解除滇重楼种子休眠的影响[J].中国药学杂志，2013，48（20）：1719-1724.
[19] 陈疏影，尹品训，王荔，等.变温层积对解除滇重楼种子休眠及其内源激素变化的研究[J].中草药，2011，42（4）：793-795.
[20] 李海峰，赵昱，袁朗白，等.滇重楼种子休眠破除及植株形态发生的研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（5）：161-164.
[21] 赵俊凌，罗承彬，李戈.不同层积处理滇重楼种子内源激素变化的研究[J].云南中医学院学报，2014，37（3）：28-30.
[22] 熊海浪，易继财，张宗申.滇重楼种子萌发及组织培养研究[J].广东农业科学，2011，38（21）：47-49.
[23] 张旺凡，沈素贞，梁文斌，等.七叶一枝花种子萌发特性研究[J].中国野生植物资源，2013，32（5）：16-20.
[24] 杨淋，胡侃，赵昱，等.滇重楼种子无菌萌发及植株形态发生的研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（3）：151-154.
[25] 崔宝禄，唐德华，王兴贵.重楼无性繁殖研究进展[J].河北林果研究， 2009，24（4）：399-401.
[26] 袁理春，陈翠，杨丽云，等.滇重楼根状茎繁殖诱导初报[J].中药材， 2004，27（7）：477.
[27] 李军，李卓新.滇重楼高产栽培方法[J].特种经济动植物，2012（1）：38-39.
[28] 陈翠，杨丽云，吕丽芬，等.云南重楼根状茎切段苗繁育技术研究[J].西南农业学报，2007，20（4）：706-710.
[29] 王跃华，江明殊，何诗虹，等.川贝母组培苗快速繁殖研究[J].四川师范大学学报：自然科学版，2013，36（6）：941-944.
[30] 李景滨，刘同祥，王培忠，等.金铁锁毛状根诱导及培养体系的建立[J].中国中药杂志，2011，36（5）：547.
[31] 李群，陈丽萍，葛方兰.重楼属植物愈伤组织的诱导和培养[J].四川师范大学学报：自然科学版，2006，29（1）：120-122.
[32] 李群，葛方兰，王丽.重楼属植物初代培养过程中无菌培养物的建立[J].四川师范大学学报：自然科学版，2003，26（6）：624-626.
[33] 熊海浪，于振艳，张宗申，等.影响濒危药用植物滇重楼愈伤组织发生的因素[J].时珍国医国药，2012，23（6）：1372-1374.
[34] 宋发军，黄宗华.七叶一枝花组织培养和种子萌发条件的研究[J].中南民族大学学报：自然科学版，2013，32（2）：51-54.
[35] 王跃华，蒋婷婷，付伟，等.重楼植物的组织培养研究[J].时珍国医国药，2012，23（8）：2014-2016.
[36] 杨丽云，陈翠，吕丽芬，等.云南重楼的组织培养与植株再生[J].植物生理学通讯，2008，44（5）：947-948.
（收稿日期：2014-12-25）
（修回日期：2015-01-25；编辑：梅智胜）
摘要：重楼为我国名贵中药材，极具药用价值。近年来重楼药材需求量逐渐增加，人工栽培存在瓶颈，野生资源开采陷入恶性循环，且已严重透支。因此，在加强重楼资源保护的同时，积极深入开展基础研究，破解种苗繁育问题，推动人工栽培，以满足市场需求，对实现重楼资源的可持续发展和采用具有重要意义。本文综述了重楼种苗繁育现状，包括种子繁殖、茎段繁殖及组织培养等，为重楼规范化种植、资源保护与利用提供参考。
关键词：重楼；种苗繁育；组织培养；综述
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.032
中图分类号：R282.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）01-0120-05
Research Progress in Seeding Breeding of Paridis Rhizoma LUO Min， LI Juan， ZHANG Wen-wei， DENG Cai-fu， TAN Qiu-sheng （Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation， Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Chongqing 408435， China）
Abstract： Paridis Rhizoma is a rare Chinese herbal medicine with variety of medicinal values. In recent years， the demand for Paridis Rhizoma has increased gradually. Artificial cultivation has met difficulties， while exploitation of wild resources was caught in a vicious circle and has overdrawn seriously. So it is of great significance to enhance the protection of Paridis Rhizoma， carry out basic research， in order to solve problems in seeding breeding， promote artificial cultivation to meet the market need and achieve sustainable development and supply. This article reviewed the status qua of seedling breeding of Paridis Rhizoma， including seed breeding， tuber breeding and tissue culture， with a purpose to standardize planting of resource conservation and utilization of Paridis Rhizoma.
Key words： Paridis Rhizoma； seeding breeding； tissue culture； review
中药材重楼为百合科重楼属植物云南重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand. -Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var. chinensis （Franch.）Hara的干燥根[1]。《神农本草经》与《本草纲目》对其药用情况具有较详细的记载，是云南白药系列、宫血宁胶囊等产品的主要原料。近年来对重楼资源需求逐年增加，但忽视了对重楼资源的保护和繁育，乱采滥挖现象凸显，重楼野生资源已陷入开采的恶性循环，导致野生资源严重透支。因此，人工种养亟待升级，其中，种苗繁育是野生资源人工栽培研究、中药材规范化种植及整个中药产业发展的源头。但目前重楼种苗繁育研究出现瓶颈，如何有效、快捷解决“源头之困”已成为当务之急。兹就近年来重楼
种苗繁育技术方面的研究进行系统综述，以期为中药材重楼种苗繁育及人工栽培提供参考。
1 种子繁殖
1.1 种子休眠机理研究
重楼的种子产量较大，通过种子的有性繁殖是获得大量种苗的有效方法。但重楼种子具有“二次休眠”的生理特性，出苗率极低，不足50.0%，大量种子在漫长的休眠期内丧失了生命力[2]，并且出苗不一致，生长不整齐。因此，研究重楼种子休眠的物质表现、引起休眠的原因及休眠过程中具有的变化等问题，对掌握重楼种子的休眠机理具有重要意义。
种子休眠是物种适应自然的一种生态策略，不同物种具有不同休眠机制。目前公认的种子休眠三大原因，包括种皮吸水障碍、胚休眠和萌发抑制物的存在。黄氏等[3]通过对滇重楼种子吸水特性的研究排除了种皮吸水障碍因素的存在；且该团队将滇重楼种子的二次发育划分为形态-生理后熟休眠类型，且存在胚休眠现象。重楼果实成熟时，种胚生长还停留在球形期[4-5]。
在植物的自然休眠过程中，内源激素是一个重要的影响因子。其中，脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）是控制种子休眠与萌发的主要内源激素[6-7]。研究表明，最终重楼种胚的休眠解除是ABA减少与促萌物质GA3增加和积累的结果[3，8]。另外，滇重楼的外种皮对维持种子休眠也起着重要作用，种皮内存在一定活性的抑制物质[9]，对胚根生长具有明显抑制作用[10-11]。自然条件下，生境中较长的低温时期或许是导致重楼种子休眠时间较长的外界原因。
目前对重楼种子休眠原因的研究中排除了种皮吸水障碍这一因素，主要集中于胚休眠及存在萌发抑制物两方面。其中滇重楼种子的发育程度其实与植株生长环境，如海拔、气候、野生与否及果实采收时间等无关[12]，那么，是否可以推论其胚发育不完全或许是滇重楼的一种稳定遗传性状，主要受基因控制。另外，从内源激素说方面主要考虑的是某种激素（如ABA、GA）含量的变化。然而，种子含有多种激素，可否推测并非某一种或两种物质的变化，而是多种物质间存在着一种平衡，正是这种平衡关系抑制了种子的萌发，导致休眠时间较长。以上推测均有待进一步研究验证。
1.2 休眠破解方法研究
重楼种子休眠程度高、萌发速率慢及萌发率低等客观因素极大地限制了重楼人工栽培，造成种子繁殖一直未能在实际生产中得以广泛应用，成为制约重楼依靠种子繁育种苗的一个重要瓶颈。因此，如何打破其种子休眠期，缩短后熟时间，提高种子的发芽率及出苗整齐率等是目前研究的一大难题。
目前，多数研究采集重楼果实之后均通过清水浸泡或与细沙混合的方式搓去外种皮[13-15]，并刺激内种皮以增加通透性，为子叶的脱壳创造有利条件[16]。研究表明，低温沙藏有益于重楼种子催芽[17]，在4 ℃条件下采用干沙和湿沙层积后种子的萌动率可达65%，但仍不能萌发，而只是解除了形态学休眠[18]。变温层积则可在3个月内打破重楼种子休眠[19]。在培养基中添加GA等植物激素对滇重楼种子休眠破除和种子的萌动萌发具有重要影响[20]，增加环境中GA/ABA值可缩短重楼种子萌发时间，增加出苗率[21]。基于以上研究，有学者综合考虑温度、层积与激素的协同作用，通过设置不同梯度组合，以期筛选出打破重楼种子休眠的最佳处理。如熊氏等[22]将重楼种子经4、40 ℃变温处理，红外光照射后再用硝酸钾、GA3混合液保湿，休眠解除且萌发率达40.0%。去外种皮后利用4 ℃湿沙层积与GA的协同作用使种子萌发率达68.6%[19]。张氏等[23]将重楼种子细沙层积后经5、20 ℃二次交替变温处理，用GA3浸泡后在20 ℃下催芽60 d可使发芽率达到90%以上。另外，杨氏等[24]初步建立了滇重楼种子无菌萌发胚根和胚芽培养体系，但对于用离体培养缩短其形态学和生理学后熟，用处于萌动状态的种子育苗能否缩短种子育苗时间并提高出苗率，仍需进一步深入研究。
综上所述，目前解除重楼种子休眠多采用变温层积与激素处理相结合的方法。利用变温层积打破种子形态学休眠，再利用激素处理解除生理休眠。变温层积低温多为4 ℃或5 ℃，催芽温度为重楼种子萌发最适温度20 ℃，而高温处理具有较大差异，且变温层积的处理时间亦不同，发芽率也存在显著差异。总体而言，目前虽在萌发机制、休眠解除等方面取得了一些效果，但在如何更有效、快捷地解除重楼种子休眠、缩短种子萌发时间、提高萌发率与出苗整齐率等方面仍无突破性进展。笔者建议，今后可开展种子休眠基因的识别与定位、种子休眠相关基因的表达方式和遗传方式等相关研究，通过分子生物学技术来破解休眠。总之，寻求有效而稳定的重楼种子休眠解除方法仍任重而道远。
2 根茎切段繁殖
根茎切段繁殖是迄今重楼生产最为常用的繁殖方式之一。该方法简单易用，常年可种植，且可快速繁殖重楼种苗，又能缩短种植周期，新植株3年后即可采收根茎入药[25]。目前，在实际生产中，根茎的切割研究已相对较为成熟。在切取根茎段时，研究者多以节为基础进行切割，切口位于相邻两节的中部，切段伤口采用草木灰、生石灰或高锰酸钾溶液处理[5，16]。
重楼根茎切段繁殖包括带顶芽部位与不带顶芽部位两种。虽然两者均可出苗，但带顶芽好于不带顶芽，其茎尖出苗率为79.3%，而中下部的出苗率仅10.7%[16]；带顶芽切段根茎的生长量是不带顶芽切段的1.5～2.5倍[26]；且带顶芽切段亦比种子繁殖好，其成苗率达98%以上[5]。李氏等[17]研究发现，带顶芽切段于种植的翌年成苗，出苗率可达100%，并开花结实；而不带顶芽切段第3年才萌发出土，出苗率为92%左右。经3年种植后，顶芽切段的根茎鲜重达42.3 g，而无顶芽的仅8.2 g。
以上研究表明，重楼根茎切块繁殖技术已趋于成熟。但在实际大田种植时，由于土壤温度与湿度无法控制，切段伤口愈合不理想，易感染菌类而致根茎溃烂，种质材料损失大；加之潜伏芽萌发时间长，萌发率较低，多芽同时萌发更少，导致总的繁殖系数降低，生产出的种苗质量亦不高。或许外缘植物生长调节剂的使用对切段进行处理将取得更好的效果[27]。陈氏等[28]用不同浓度的GA3、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、生根粉（ABT1）溶液处理重楼根茎切段，结果表明，用2 mg/L 6-BA和适宜浓度ABT1能提高根茎切段繁殖率，且2 mg/L 6-BA处理可显著提高切段多芽率，ABT1能促进根状茎切段不定根的产生，同时对潜伏芽的萌动亦具有显著作用。
重楼根茎切块繁殖是目前最为成功的繁殖方式，但根茎本是其药用部位，利用根茎切块生产种苗耗种量大，增加了生产成本。加之存在种苗退化、切面大而易感染病害、出苗不整齐等问题。因此，根茎切块繁殖方法仍需进一步改进与完善。
3 组织培养繁殖
利用组织培养技术可在短时间内大量繁殖性状优良的幼苗，且不受地区、季节等因素限制，全年均可生产，是解决珍稀濒危药用植物资源的重要途径之一，且已在多种药用植物上取得成功[29-30]。鉴于组织培养途径的优越性，目前该技术已成为业界最为关注的用于突破重楼无性快繁瓶颈的方法之一。早在20世纪已有研究者试图建立重楼的离体快繁体系，但至今尚未取得令人满意的结果。
3.1 愈伤组织诱导
目前已对重楼不同器官进行愈伤组织诱导培养开展了研究，但结果不甚理想。李氏等[31-32]在筛选外植体时发现，重楼根、茎、叶片和花蕾不能诱导出愈伤组织，接种后极少启动，约2个月后则干枯死亡；根茎、子房及幼芽能不同程度地诱导出愈伤组织，且幼芽诱导出的愈伤组织数最多，诱导频率最高（26.7%），甚至诱导出小球茎。但由根茎诱导的愈伤组织质地较疏松，易纤维化，从而失去增殖能力；子房形成的愈伤组织也较疏松，易褐变。熊氏等[33]发现，种胚在胚乳看护培养的条件下能成功诱导出愈伤组织，比李氏等[31]以芽为材料的诱导率更高，且不受外植体取材时间的限制；但诱导出的愈伤组织偏紧密，不利于其快速繁殖；茎尖作为外植体时能诱导出愈伤组织，但生长缓慢，并且不含原植物中的皂苷。另外，外植体的不同取材时期对愈伤组织的诱导亦具有一定影响。研究显示，以展叶期旺盛生长的根茎诱导频率最高（16.6%），萌芽期次之；而在花冠露白期和倒苗期，根茎则很难诱导出愈伤组织[32]。
由此可见，利用组织培养来繁殖重楼种苗的难度很大，只有幼芽能成功诱导出植株，而茎尖的诱导虽能成功启动，但效率较低，且不含皂苷成分。种胚、根茎和子房虽也可产生愈伤组织，但其增殖受到极大限制。目前关于采用重楼其他外植体成功组织培养的研究也鲜有报道。另外，愈伤组织增殖分化时间长、速率缓慢等问题也需进一步研究与解决。
3.2 无菌培养物建立
目前的重楼组织培养过程中污染问题严重，对实验造成极大影响。其外因主要是在接种或培养过程中由于环境因素及操作不当而引起，该污染可通过对接种室、培养室环境消毒及加强人员无菌操作意识等加以避免；内因则是由外植体表面或内部带菌所引起。由于内生真菌培养在初期未立刻显现出来，在继代过程中才不断出现，污染材料，导致诱导率下降。鉴于此，今后研究需对外植体采取相应的消毒措施。
尽管早期研究以200 mg/L羧苄西林钠和头孢唑林钠的抑菌效果最好，但目前常用0.5%消毒灵液、70%或75%酒精和0.1%氯化汞（HgCl2）进行消毒[34]。王氏等[35]将带芽根茎用0.5%消毒灵液浸泡10 min，流水冲洗干净并晾干后，在超净工作台上用70%酒精消毒30 s，再用0.1% HgCl2处理数分钟后无菌水冲洗干净，结果用HgCl2消毒8 min时，其污染率较低，为（11.97±0.91）%，启动率高达（84.82±2.59）%。
3.3 培养基配方
组织培养技术中培养基筛选同样至关重要。李氏等[31-32]发现，对茎尖启动较好的培养基为植物基本培养基（MS）+2.0 mg/L激动素（KT）+2.0 mg/L吲哚乙酸（IAA）和MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L IAA，启动率超过30%，且IAA比其他生长素（如吲哚丁酸等）更有利于外植体的启动。幼芽在培养基MS+1.0 mg/L BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）+1.0 mg/L IAA上诱导愈伤组织的频率较高，在MS+1.0 mg/L BA+2.0 mg/L IAA和MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L IAA上还可诱导球茎的形成。研究表明，去芽鞘的芽外植体的最佳培养基配方为MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L IAA，诱导率高达57.0%[34]；其愈伤组织增殖最佳培养基配方为MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L萘乙酸（NAA）[36]。在胚乳看护下的种胚则以MS+2 mg/L IAA+0.02 mg/L 6-BA为诱导愈伤组织的最佳培养基，诱导率达53.3%[33]。
目前对重楼组织培养技术研究成功的报道甚少，较为成功的是杨氏等[36]首次在离体条件下实现了滇重楼的植株再生。该研究以芽为外植体，分别经愈伤组织诱导培养基、增殖分化培养基和生根培养基的培养，将根长为2～3 cm的芽移栽至腐殖土180 d左右形成完整植株，出土展叶成活率可达65%。但该研究尚存在愈伤组织增殖分化时间长的问题，其一个增殖周期需210～240 d。
生长素和细胞分裂素种类和配比对愈伤组织诱导效果的影响很大。以上研究生长调节剂的使用主要集中于6-BA、NAA、KT、IAA及2，4-D，但在培养基配方中的添加量存在差异，如6-BA差异最为显著，同为愈伤组织诱导培养基，添加量在0.02～2.00 mg/L均有出现，这或许是因外植体的不同而相异。另外，总体而言愈伤组织诱导率并不高，增殖分化时间过长，均未达理想状态。
总之，培养基的配方至今未有较为统一的模式，愈伤组织诱导、增殖分化及生根培养3种培养基的最佳配方仍需不断摸索。
4 展望
鉴于重楼的药用价值，其生产原料来源一直较为紧张，野外掠夺性采挖致生态环境被人为破坏，因此，急需大规模人工引种栽培。虽然重楼根茎切块繁殖是目前最为常用和成熟的种苗繁殖方式，但耗种量大，生产成本高，且存在种苗退化等问题，因此，该方法仍需改进与完善。
重楼种子产量较大，种子繁殖系数大，是获得大量种苗的有效方法，在对其萌发机制、休眠解除方面研究已取得一定进展，利用变温层积与激素处理相结合的方法得到一定成效，但在如何更高效、快捷地解除种子繁育中的休眠、后熟时间、发芽率、出苗整齐率等方面仍需进一步研究。
重楼组织培养育苗研究进展缓慢，重楼自身的组织细胞脱分化能力较低、细胞分裂速度慢，同时在组培过程中还存在外植体选择、消毒和培养基筛选等限制，使该技术还未能在实际生产中得到广泛应用，今后需加大重楼组织培养育苗的研究力度。
总之，目前对重楼种苗繁育的研究虽已取得了初步成果，但总体而言，基础研究尤其是应用基础方面的研究尚不足，多手段、多渠道有效解决重楼繁殖问题仍需开展大量、更深入的研究，为重楼野生资源的保护、可持续开发利用，以及生产应用中原材料的供应提供有力保障。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：243.
[2] 李运昌.重楼属植物引种栽培的研究——滇重楼的有性繁殖试验初报[J].云南植物研究，1982，4（4）：429-431.
[3] 黄玮，孟繁蕴，张文生，等.滇重楼种子休眠机理研究[J].中国农学通报，2008，24（12）：242-246.
[4] 袁理春，陈翠，杨丽云，等.温度和赤霉素对重楼种子二次发育的影响[J].种子，2003（5）：33-34.
[5] 陈翠，康平德，杨丽云，等.云南重楼种苗繁育技术[J].中国现代中药， 2010，12（2）：23-25.
[6] ABDALLAH A D， BARHOUMI Z， SMAOUI A， et al. ABA， GA， and nitrate may control seed germination of Crithmum maritimum （Apiaceae） under salone conditions[J]. Comptes Rendus Biol，2009，332（8）：704-710.
[7] KUCERA B， COHN MA， LEUBNER-METZGER G. Plant hormone interactions during seed dormancy release and germination[J]. Seed Sci Res， 2007，15（4）：281-307.
[8] 孟繁蕴，汪丽娅，张文生，等.滇重楼种胚休眠和发育过程中内源激素变化的研究[J].中医药学报，2006，34（4）：36-38.
[9] 古今，吴梅，李文春，等.滇重楼种子中萌发抑制物质活性的研究[J].现代中药研究与实践，2013，27（1）：10-12.
[10] 赵东兴，李春，赵国祥，等.云南地道药材滇重楼的研究进展[J].热带农业科学，2014，34（1）：42-47.
[11] 王跃华，田孟良，蒋婷婷，等.华重楼种子外皮的化感作用研究[J].西南农业学报，2012，25（1）：340-342.
[12] 陈伟，马绍宾，陈宏伟.生境对滇重楼种子发育与萌发的影响[J].湖北农业科学，2011，50（5）：972-974.
[13] 周浓，张玉莲，郭冬琴，等.滇重楼总黄酮提取工艺的正交试验法优选[J].时珍国医国药，2014，25（3）：581-583.
[14] 刘涛，谢世清，赵银河，等.滇重楼林下规范化种植生产标准操作规程（SOP）[J].现代中药研究与实践，2014，28（2）：3-6.
[15] 周浓，李自勤，姜北，等.超声波对滇重楼种子萌发能力的影响[J].湖北农业科学，2012，51（1）：114-116.
[16] 李荣英，段立胜，唐德英.重楼种苗繁育试验[J].时珍国医国药， 2006，17（12）：2639.
[17] 李绍平，杨丽英，杨斌，等.滇重楼高效繁育和高产栽培研究[J].西南农业学报，2008，21（4）：956-959.
[18] 张琳，李海峰，张德全，等.层积和赤霉素协同作用对解除滇重楼种子休眠的影响[J].中国药学杂志，2013，48（20）：1719-1724.
[19] 陈疏影，尹品训，王荔，等.变温层积对解除滇重楼种子休眠及其内源激素变化的研究[J].中草药，2011，42（4）：793-795.
[20] 李海峰，赵昱，袁朗白，等.滇重楼种子休眠破除及植株形态发生的研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（5）：161-164.
[21] 赵俊凌，罗承彬，李戈.不同层积处理滇重楼种子内源激素变化的研究[J].云南中医学院学报，2014，37（3）：28-30.
[22] 熊海浪，易继财，张宗申.滇重楼种子萌发及组织培养研究[J].广东农业科学，2011，38（21）：47-49.
[23] 张旺凡，沈素贞，梁文斌，等.七叶一枝花种子萌发特性研究[J].中国野生植物资源，2013，32（5）：16-20.
[24] 杨淋，胡侃，赵昱，等.滇重楼种子无菌萌发及植株形态发生的研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（3）：151-154.
[25] 崔宝禄，唐德华，王兴贵.重楼无性繁殖研究进展[J].河北林果研究， 2009，24（4）：399-401.
[26] 袁理春，陈翠，杨丽云，等.滇重楼根状茎繁殖诱导初报[J].中药材， 2004，27（7）：477.
[27] 李军，李卓新.滇重楼高产栽培方法[J].特种经济动植物，2012（1）：38-39.
[28] 陈翠，杨丽云，吕丽芬，等.云南重楼根状茎切段苗繁育技术研究[J].西南农业学报，2007，20（4）：706-710.
[29] 王跃华，江明殊，何诗虹，等.川贝母组培苗快速繁殖研究[J].四川师范大学学报：自然科学版，2013，36（6）：941-944.
[30] 李景滨，刘同祥，王培忠，等.金铁锁毛状根诱导及培养体系的建立[J].中国中药杂志，2011，36（5）：547.
[31] 李群，陈丽萍，葛方兰.重楼属植物愈伤组织的诱导和培养[J].四川师范大学学报：自然科学版，2006，29（1）：120-122.
[32] 李群，葛方兰，王丽.重楼属植物初代培养过程中无菌培养物的建立[J].四川师范大学学报：自然科学版，2003，26（6）：624-626.
[33] 熊海浪，于振艳，张宗申，等.影响濒危药用植物滇重楼愈伤组织发生的因素[J].时珍国医国药，2012，23（6）：1372-1374.
[34] 宋发军，黄宗华.七叶一枝花组织培养和种子萌发条件的研究[J].中南民族大学学报：自然科学版，2013，32（2）：51-54.
[35] 王跃华，蒋婷婷，付伟，等.重楼植物的组织培养研究[J].时珍国医国药，2012，23（8）：2014-2016.
[36] 杨丽云，陈翠，吕丽芬，等.云南重楼的组织培养与植株再生[J].植物生理学通讯，2008，44（5）：947-948.
（收稿日期：2014-12-25）
（修回日期：2015-01-25；编辑：梅智胜）
