HPLC同时测定痛经灵颗粒中3种有效成分含量
李中娥
摘要：目的 建立高效液相色谱法同时测定痛经灵颗粒中丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A含量的方法，为有效控制其质量提供可靠的方法。方法 采用Welchrom C18色谱柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长为230 nm。结果 丹酚酸B在0.197～1.316 μg范围内呈良好的线性关系（r=0.999 6），平均回收率为98.72%，RSD=1.49%；芍药苷在0.158～1.051 μg范围内呈良好的线性关系（r=0.999 8），平均回收率为99.01%，RSD=0.92%；羟基红花黄色素A在0.053～0.353 μg范围内呈良好的线性关系（r=0.999 4），平均回收率为98.34%，RSD=1.60%。结论 该方法简便、灵敏、准确、重复性好，可用于痛经灵颗粒的质量控制。
关键词：痛经灵颗粒；丹酚酸B；芍药苷；羟基红花黄色素A；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.025
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）01-0103-03
Simultaneous Determination of Three Active Ingredients in Tongjingling Granules by HPLC LI Zhong-e （Nanyang Institute for Food and Drug Control， Nanyang 473061， China）
Abstract： Objective To establish a simultaneous determination method for Salvianolic acid B， Paeoniflorin and Hydroxysafflor yellow A in Tongjingling Granules； To provide a reliable method for effective quality control. Methods The determination was performed on a Welchrom C18 column with acetonitrile （A） - 0.1% phosphoric acid （B） as the mobile phase in gradient elution mode at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm. Results Salvianolic acid B presented in a good linear relation in the range of 0.197–1.316 μg， and the average recovery rate was 98.72% with RSD 1.49%； Paeoniflorin presented in a good linear relation in the range of 0.158–1.051 μg， and the average recovery rate was 99.01% with RSD 0.92%； Hydroxysafflor yellow A presented in a good linear relation in the concentration range of 0.053–0.353 μg， and the average recovery rate was 98.34% with RSD of 1.60%. Conclusion This method is simple， sensitive， accurate and with good reproducibility， which can be used for quality control of Tongjingling Granules.
Key words： Tongjingling Granules； Salvianolic acid B； Paeoniflorin； Hydroxysafflor yellow A； HPLC
痛经灵颗粒收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第十五册，由丹参、赤芍、香附（醋制）、蒲黄、红花、延胡索、乌药等组成，具有活血化瘀、理气止痛功效，临床用于治疗气滞血瘀所致痛经。该产品现行标准中没有含量测定项[1]，无法有效控制其质量。以往报道多以原儿茶醛或芍药苷等单一成分作为质控指标[2-3]，本研究参考有关文献[4-8]，对样品处理方法和色谱分离系统进行优化，采用高效液相色谱法（HPLC）同时对方中3味主药的特征性活性成分丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A含量进行测定，从而在简化检测步骤、节约检测资源的情况下，更好地控制该药品的质量。
1 仪器与试药
Agilent 1260高效液相色谱仪，配四元梯度泵、G1314F紫外检测器；赛多利斯BP-211D电子天平；KQ-300DE型数控超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）。
对照品丹酚酸B（批号111562-201110，含量98.0%）、芍药苷（批号110736-201035，含量96.5%）、羟基红花黄色素A（批号111637-200905，含量91.8%）均购自中国食品药品检定研究院，乙腈（HPLC，Welch Materials Inc.），磷酸（分析纯，天津市福晨化学试剂厂），水为重蒸馏水。痛经灵颗粒（市售）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～12 min，12%A；12～20 min，12%A→34%A；20～30 min，34%A；30～35 min，34%A→12%A）；检测波长：230 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于4000，各峰之间分离度符合要求。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品9.62 mg，置50 mL量瓶中，加75%甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密称取丹酚酸B对照品16.78 mg、芍药苷对照品13.61 mg，置25 mL量瓶中，加上述羟基红花黄色素A对照品溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含丹酚酸B 0.657 8 mg/mL、芍药苷0.525 3 mg/mL、羟基红花黄色素A 0.176 6 mg/mL的溶液（对照品溶液①），精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液制备 取本品适量，研细，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加75%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声提取（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，用微孔滤膜过滤，即得。
2.2.3 阴性对照溶液制备 按处方制法分别制备不含丹参、赤芍和红花的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法分别制成阴性对照溶液。
2.3 专属性试验
吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件分别进样，结果供试品色谱中，在与丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A对照品色谱相同的保留时间处有色谱峰，与其他组分能达到良好分离，分离度均>1.5，理论塔板数分别为8326、10 967、13 980。阴性对照色谱中，在与丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A对照品色谱峰相应的位置上无干扰峰，说明供试品溶液中的其他成分对测定结果无影响，见图1。
2.4 线性关系的考察
精密量取“2.2.1”项下对照品溶液① 0.3、0.6、0.9、1.2、1.6、2.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件测定，以浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线，得回归方程。丹酚酸B：Y=10.866X-1.100 9，r=0.999 6（n=6）。芍药苷：Y=7.621X+0.292 1，r=0.999 8（n=6）。羟基红花黄色素A：Y=11.834X-0.352 8，r=0.999 4（n=6）。结果表明，丹酚酸B在0.197～1.316 μg、芍药苷在0.158～1.051 μg、羟基红花黄色素A在0.053～0.353 μg范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
取“2.2.1”项下对照品溶液，进样量10 μL，连续进样6次，测定峰面积，结果丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A的峰面积RSD分别为0.97%、1.56%、1.22%，表明精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批号样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定每份样品中3种成分含量，结果丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A的含量RSD分别为1.33%、0.91%、1.52%，说明重复性良好。
2.7 稳定性试验
取同一份供品溶液，分别在0、3、6、9、12 h进样测定峰面积，结果丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A的峰面积RSD分别为1.59%、1.13%、1.27%。表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.8 加样回收率试验
精密称取已测得含量（丹酚酸B 2.628 mg/g，芍药苷2.083 mg/g，羟基红花黄色素A 0.706 mg/g）的痛经灵颗粒6份，每份0.25 g，分别精密加入“2.2.1”项下对照品溶液①各1.0 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果见表1。
2.9 样品测定
按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，测定来自云南、河北、陕西、吉林不同厂家共12批样品中3种成分的含量，结果见表2。
根据12批样品所测得的结果，可看出不同厂家不同批次所含3种成分的含量有所差异，质量参差不齐，其中尤以羟基红花黄色素A的含量差别为大，可能与红花药材较贵且在成药质量标准中较少被检测有关，因此很有必要对这3种成分合理定量，从而更好地监管该药品的质量。
3 讨论
本试验比较了30%乙醇、甲醇、50%甲醇及75%甲醇几种溶剂的提取效果，结果以75%甲醇提取所得可更好兼顾3种成分的含量，故以75%甲醇为提取溶剂。因丹酚酸B对热不太稳定，故未采用回流而采用超声方式提取，试验发现超声提取25 min后，3种成分的含量无明显增加，所以将提取时间定在30 min。
在多成分同时检测中，很多需要采用转换波长的方式以取得好的效果[5-6]。本试验发现，以芍药苷的最大吸收波长230 nm作为单一检测波长，其他2种成分亦吸收稳定，响应信号良好，线性范围满足需要，故采用单波长检测，便于该方法更广泛地应用。
参考文献：
[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂 第十五册[M].1997：209.
[2] 任红兵.痛经灵颗粒质量标准研究[J].现代中药研究与产践，2011， 25（2）：76-79.
[3] 章常华，曾宗浪，施宏斌，等.痛经灵颗粒质量标准研究[J].亚太传统医药，2008，4（4）：34-37.
[4] 严红.HPLC法同时测定中药多种有效成分含量的应用[J].天津药学， 2010，22（1）：67-70.
[5] 厉瑶，郭正泰，龚行楚，等.丹参红花混煎液中丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的HPLC测定方法[J].中国中药杂志，2013，38（11）：1653-1656.
[6] 刘敏彦，赵韶华，王玉峰.超高效液相色谱法同时测定参松养心胶囊中8种活性成分的含量[J].中国医院药学杂志，2014，34（6）：435-438.
[7] 贾歆.HPLC同时测定尿塞通片中的芍药苷、丹酚酸B及隐丹参酮[J].华西药学杂志，2014，29（1）：77-79.
[8] 王亚洲.HPLC法同时测定蝎龙酒中芍药苷、羟基红花黄色素A和阿魏酸[J].中成药，2012，34（10）：1925-1928.
（收稿日期：2014-12-02；编辑：陈静）
摘要：目的 建立高效液相色谱法同时测定痛经灵颗粒中丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A含量的方法，为有效控制其质量提供可靠的方法。方法 采用Welchrom C18色谱柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长为230 nm。结果 丹酚酸B在0.197～1.316 μg范围内呈良好的线性关系（r=0.999 6），平均回收率为98.72%，RSD=1.49%；芍药苷在0.158～1.051 μg范围内呈良好的线性关系（r=0.999 8），平均回收率为99.01%，RSD=0.92%；羟基红花黄色素A在0.053～0.353 μg范围内呈良好的线性关系（r=0.999 4），平均回收率为98.34%，RSD=1.60%。结论 该方法简便、灵敏、准确、重复性好，可用于痛经灵颗粒的质量控制。
关键词：痛经灵颗粒；丹酚酸B；芍药苷；羟基红花黄色素A；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.025
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）01-0103-03
Simultaneous Determination of Three Active Ingredients in Tongjingling Granules by HPLC LI Zhong-e （Nanyang Institute for Food and Drug Control， Nanyang 473061， China）
Abstract： Objective To establish a simultaneous determination method for Salvianolic acid B， Paeoniflorin and Hydroxysafflor yellow A in Tongjingling Granules； To provide a reliable method for effective quality control. Methods The determination was performed on a Welchrom C18 column with acetonitrile （A） - 0.1% phosphoric acid （B） as the mobile phase in gradient elution mode at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm. Results Salvianolic acid B presented in a good linear relation in the range of 0.197–1.316 μg， and the average recovery rate was 98.72% with RSD 1.49%； Paeoniflorin presented in a good linear relation in the range of 0.158–1.051 μg， and the average recovery rate was 99.01% with RSD 0.92%； Hydroxysafflor yellow A presented in a good linear relation in the concentration range of 0.053–0.353 μg， and the average recovery rate was 98.34% with RSD of 1.60%. Conclusion This method is simple， sensitive， accurate and with good reproducibility， which can be used for quality control of Tongjingling Granules.
Key words： Tongjingling Granules； Salvianolic acid B； Paeoniflorin； Hydroxysafflor yellow A； HPLC
痛经灵颗粒收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第十五册，由丹参、赤芍、香附（醋制）、蒲黄、红花、延胡索、乌药等组成，具有活血化瘀、理气止痛功效，临床用于治疗气滞血瘀所致痛经。该产品现行标准中没有含量测定项[1]，无法有效控制其质量。以往报道多以原儿茶醛或芍药苷等单一成分作为质控指标[2-3]，本研究参考有关文献[4-8]，对样品处理方法和色谱分离系统进行优化，采用高效液相色谱法（HPLC）同时对方中3味主药的特征性活性成分丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A含量进行测定，从而在简化检测步骤、节约检测资源的情况下，更好地控制该药品的质量。
1 仪器与试药
Agilent 1260高效液相色谱仪，配四元梯度泵、G1314F紫外检测器；赛多利斯BP-211D电子天平；KQ-300DE型数控超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）。
对照品丹酚酸B（批号111562-201110，含量98.0%）、芍药苷（批号110736-201035，含量96.5%）、羟基红花黄色素A（批号111637-200905，含量91.8%）均购自中国食品药品检定研究院，乙腈（HPLC，Welch Materials Inc.），磷酸（分析纯，天津市福晨化学试剂厂），水为重蒸馏水。痛经灵颗粒（市售）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～12 min，12%A；12～20 min，12%A→34%A；20～30 min，34%A；30～35 min，34%A→12%A）；检测波长：230 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于4000，各峰之间分离度符合要求。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品9.62 mg，置50 mL量瓶中，加75%甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密称取丹酚酸B对照品16.78 mg、芍药苷对照品13.61 mg，置25 mL量瓶中，加上述羟基红花黄色素A对照品溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含丹酚酸B 0.657 8 mg/mL、芍药苷0.525 3 mg/mL、羟基红花黄色素A 0.176 6 mg/mL的溶液（对照品溶液①），精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液制备 取本品适量，研细，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加75%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声提取（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，用微孔滤膜过滤，即得。
2.2.3 阴性对照溶液制备 按处方制法分别制备不含丹参、赤芍和红花的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法分别制成阴性对照溶液。
2.3 专属性试验
吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件分别进样，结果供试品色谱中，在与丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A对照品色谱相同的保留时间处有色谱峰，与其他组分能达到良好分离，分离度均>1.5，理论塔板数分别为8326、10 967、13 980。阴性对照色谱中，在与丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A对照品色谱峰相应的位置上无干扰峰，说明供试品溶液中的其他成分对测定结果无影响，见图1。
2.4 线性关系的考察
精密量取“2.2.1”项下对照品溶液① 0.3、0.6、0.9、1.2、1.6、2.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件测定，以浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线，得回归方程。丹酚酸B：Y=10.866X-1.100 9，r=0.999 6（n=6）。芍药苷：Y=7.621X+0.292 1，r=0.999 8（n=6）。羟基红花黄色素A：Y=11.834X-0.352 8，r=0.999 4（n=6）。结果表明，丹酚酸B在0.197～1.316 μg、芍药苷在0.158～1.051 μg、羟基红花黄色素A在0.053～0.353 μg范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
取“2.2.1”项下对照品溶液，进样量10 μL，连续进样6次，测定峰面积，结果丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A的峰面积RSD分别为0.97%、1.56%、1.22%，表明精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批号样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定每份样品中3种成分含量，结果丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A的含量RSD分别为1.33%、0.91%、1.52%，说明重复性良好。
2.7 稳定性试验
取同一份供品溶液，分别在0、3、6、9、12 h进样测定峰面积，结果丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A的峰面积RSD分别为1.59%、1.13%、1.27%。表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.8 加样回收率试验
精密称取已测得含量（丹酚酸B 2.628 mg/g，芍药苷2.083 mg/g，羟基红花黄色素A 0.706 mg/g）的痛经灵颗粒6份，每份0.25 g，分别精密加入“2.2.1”项下对照品溶液①各1.0 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果见表1。
2.9 样品测定
按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，测定来自云南、河北、陕西、吉林不同厂家共12批样品中3种成分的含量，结果见表2。
根据12批样品所测得的结果，可看出不同厂家不同批次所含3种成分的含量有所差异，质量参差不齐，其中尤以羟基红花黄色素A的含量差别为大，可能与红花药材较贵且在成药质量标准中较少被检测有关，因此很有必要对这3种成分合理定量，从而更好地监管该药品的质量。
3 讨论
本试验比较了30%乙醇、甲醇、50%甲醇及75%甲醇几种溶剂的提取效果，结果以75%甲醇提取所得可更好兼顾3种成分的含量，故以75%甲醇为提取溶剂。因丹酚酸B对热不太稳定，故未采用回流而采用超声方式提取，试验发现超声提取25 min后，3种成分的含量无明显增加，所以将提取时间定在30 min。
在多成分同时检测中，很多需要采用转换波长的方式以取得好的效果[5-6]。本试验发现，以芍药苷的最大吸收波长230 nm作为单一检测波长，其他2种成分亦吸收稳定，响应信号良好，线性范围满足需要，故采用单波长检测，便于该方法更广泛地应用。
参考文献：
[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂 第十五册[M].1997：209.
[2] 任红兵.痛经灵颗粒质量标准研究[J].现代中药研究与产践，2011， 25（2）：76-79.
[3] 章常华，曾宗浪，施宏斌，等.痛经灵颗粒质量标准研究[J].亚太传统医药，2008，4（4）：34-37.
[4] 严红.HPLC法同时测定中药多种有效成分含量的应用[J].天津药学， 2010，22（1）：67-70.
[5] 厉瑶，郭正泰，龚行楚，等.丹参红花混煎液中丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的HPLC测定方法[J].中国中药杂志，2013，38（11）：1653-1656.
[6] 刘敏彦，赵韶华，王玉峰.超高效液相色谱法同时测定参松养心胶囊中8种活性成分的含量[J].中国医院药学杂志，2014，34（6）：435-438.
[7] 贾歆.HPLC同时测定尿塞通片中的芍药苷、丹酚酸B及隐丹参酮[J].华西药学杂志，2014，29（1）：77-79.
[8] 王亚洲.HPLC法同时测定蝎龙酒中芍药苷、羟基红花黄色素A和阿魏酸[J].中成药，2012，34（10）：1925-1928.
（收稿日期：2014-12-02；编辑：陈静）
