气相色谱—质谱法测定大菱鲆肌肉中羧甲基赖氨酸含量
王菁
摘要 建立了大菱鲆肌肉中羧甲基赖氨酸（CML）的气相色谱质谱（GCMS）检测方法。以大菱鲆为研究对象，选用三氯甲烷/丙酮对样品进行脱脂，经硼氢化钠还原、蛋白水解、净化、衍生化（酯化与酰化）后，进行GCMS选择离子监测（SIM）模式检测。选取m/z 392为定量离子，m/z 392， 365， 333， 305为定性离子。结果表明，CML三氟乙酰甲酯化衍生物峰面积与浓度在1～200 μg/L范围内呈良好线性关系，方法检出限为1 mg/kg， 定量限为5 mg/kg，3个加标水平（10， 150和350 mg/kg） 下的平均回收率在100%～104%之间，相对标准偏差RSD<5%（n=5）。
关键词[HTSS]羧甲基赖氨酸； 大菱鲆； 气相色谱质谱； 衍生化
1引言
晚期糖基化终末产物（Advanced glycation endproducts， AGEs）是食品中蛋白、脂质和核酸等组分在热加工过程中发生非酶糖基化反应的产物[1]，其中羧甲基赖氨酸（Nεcarboxymethyllysine， CML）为主要标志性产物[2]。研究表明，食品中AGEs与心脑血管疾病、肾脏疾病、糖尿病及其并发症等慢性疾病有密切关系[3，4]。为更好地监测其在食品中含量，建立灵敏可靠的检测方法非常必要。
目前，关于食品中CML检测方法有酶联免疫法（ELISA）[1，5]、高效液相色谱法（HPLC） [6～8]、液相色谱质谱联用法（LCMS）[9，10]等。ELISA法操作相对简便，但假阳性率高，仅能得到CML相对值（kU/g）；HPLC法通过衍生化使CML具有荧光性并定量分析，但该具有荧光特性的衍生物不稳定，导致结果偏差较大；LCMS具有良好的灵敏度，又避免了衍生化处理，但基质干扰带来的离子抑制效应难以避免，且检测成本昂贵 [11]。GCMS具有高灵敏度、高选择性的优势，有望开发成有效的CML检测方法。Amélie [12]等运用GCMS对食品中CML进行检测，由于前处理、基质差异等原因，虽成功检测到奶粉等产品中的CML，但未检测到鲑鱼中的CML。目前，尚未见水产品中CML确证检测方法的报道。本研究以海水鱼中重要养殖品种大菱鲆为研究对象，利用GCMS测定鱼肉中CML含量，定量限由150 μg/L[12]降到5 μg/L，为水产品中CML检测提供了技术参考。
2实验方法
2.1仪器、试剂与材料
羧甲基赖氨酸（CML，纯度98%，加拿大TRC公司）；二氯甲烷（色谱纯，美国ACS公司）；三氟乙酸酐（色谱纯，纯度99%，北京百灵威科技有限公司）；氯化亚砜（色谱纯，纯度≥99.5%，天津科密欧试剂公司）；甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）；其它试剂均为国产分析纯。
大菱鲆购自青岛南山水产市场，经“三去”处理后，取背部肌肉绞碎，分装后，置于Symbolm@@ 18℃保存备用。
2.2溶液配制
准确称取10.00 mg CML于10.00 mL超纯水，混匀，制成1 mg/mL标准贮备溶液，分装后，于Symbolm@@ 18℃保存备用。
配制6 mol/L HCl、0.2 mol/L硼酸盐缓冲液（pH 9.2）、2 mol/L NaBH4（溶于0.1 mol/L NaOH）；取1.46 mL氯化亚砜缓慢加入100 mL甲醇中，制成衍生剂备用。
2.3样品前处理
2.3.1脱脂准确称取200.0 mg样品于50 mL离心管，加入20 mL脱脂液，混匀，于4℃以4000 r/min离心15 min，弃上清液；再加入20 mL脱脂液，重复上述离心操作，弃上清液后以氮气吹干，得蛋白沉淀。本研究选取正己烷[13]、水甲醇三氯甲烷[12]、三氯甲烷丙酮[14]3种脱脂液进行比较。
2.3.2硼氢化钠还原为避免样品中羰基化合物等经后续高温蛋白水解进一步生成CML造成检测结果偏大，向蛋白沉淀中添加2 mL硼酸盐缓冲液和400 μL NaBH4溶液，混匀，于4℃反应8 h[15]。
2.3.3蛋白水解将还原后的蛋白沉淀转移至10 mL安瓿瓶中，加入8 mL 6 mol/L HCl，充入氮气后封瓶，于110℃烘箱水解，得到蛋白水解液。
3.3GCMS分析结果
为了将目标峰更好地辨别出来，采用程序升温方法进行气相色谱峰分离。在SCAN模式中（图2a），因鱼肉组织基质复杂，目标峰极易被复杂的干扰因素掩盖，因此选用SIM模式对目标化合物进行检测。根据标准品在SCAN模式下得到的质谱图（图3），选择特征定量离子与定性离子（表2），得到的选择离子流色谱图（图2b）无其它干扰峰，且峰型良好，信噪比显著提高，利于目标化合物CML准确定量分析。
3.4方法评价
3.4.1线性范围本方法采用外标法定量。准确称取10.00 mg CML标准品于反应瓶中，按2.3.5节充分衍生化后，最终溶于10.00 mL二氯甲烷，制成标准贮备液，分装后置于
Symbolm@@ 18℃贮存备用。使用前用二氯甲烷稀释，配制成1， 5， 60， 80， 100， 150和200 μg/L的标准工作液，现用现配。GCMS测定，以CML三氟乙酰甲酯化衍生物的定量离子峰面积为纵坐标、浓度为横坐标作图，得到标准工作曲线（图4）。结果表明，CML在浓度为1～200 μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数>0.999。
3.4.2检出限与定量限因大菱鲆肌肉中含有CML，所以通过稀释样品检测液，测定信噪比（S/N），确定检出限与定量限。
使用Agilent公司离线分析工作站软件计算信噪比，选取RMS S/N作为谱图信噪比参数[13]。当样品检测液RMS S/N=3时，根据检测液浓度得出CML检出限为1 mg/kg；当样品检测液RMS S/N=10时，根据检测液浓度得出CML定量限为5 mg/kg。
3.4.3准确度与精密度在样品中加入适量CML标准贮备溶液，制成10， 150和350 mg/kg的加标样品，按照2.3和2.4节，以测得添加量和添加量之比计算回收率。每个添加水平做5组平行，根据得到的回收率计算相对标准偏差（RSD），评价精密度。
不加标大菱鲆肌肉样品中约含有9.60 mg/kg的CML，选取10， 150和350 mg/kg作为加标水平，进行添加回收实验，每个添加水平做5组平行，数据见表3。结果表明，CML在3个添加水平下的平均回收率在100%～104%之间，相对标准偏差RSD<5%。结果说明，本方法检测大菱鲆肌肉中CML的准确度和精密度良好，符合生物样品的检测分析要求。
3.5样品分析
为考察方法的适用性，使用本方法对市售即食水产品进行抽检。检测结果表明，所有即食水产品中均含有CML。其中CML在罐装金枪鱼中含量为（34.81±0.46） mg/kg，罐装鲫鱼中含量为（200.60±6.58） mg/kg，烤制鱿鱼丝中含量为（335.21±9.42） mg/kg。即食水产品中的CML含量远高于生鲜大菱鲆，因即食水产品中含有糖、油等调味品，且经热加工、高温杀菌等处理过程，有利于非酶糖基化反应的进行，进而生成更多CML。
4结 论
本研究选用三氯甲烷丙酮为脱脂液，经NaBH4还原、蛋白水解后，对样品进行衍生化，选用二氯甲烷为溶剂，采用SIM模式扫描，建立了大菱鲆肌肉中CML的GCMS检测方法。与酶联免疫方法相比，GCMS法避免了酶联免疫法的假阳性，能够更加准确地对鱼类肌肉中的CML进行定性和定量分析，灵敏度更高，检测结果易与其它方法进行比较，是检测大菱鲆肌肉中CML含量的较好方法。
References
1Teresia G， Cai W J， Melpomeni P， Veronique D， Bantwal S B， Jaime U， Helen V. J. Am. Diet. Assoc.， 2004， 104（8）： 1287-1291
2Jennifer M A. New York Academy of Sciences， 2008， 1126： 20-24
3Jaime U， Sandra W， Susan G，Cai W J， Chen X， Renata P， Angie Y， Gary E S， Helen V. J. Am. Diet. Assoc.， 2010， 110（6）： 911-916
4Madhav M J， Shrimant N P， Akalpita U A. J. Funct. Foods， 2014， 6： 107-115
5Sun Z， Peng X F， Liu J， Fan K W， Wang M F， Chen F. Food Chem.， 2010， 120（1）： 261-267
6Drusch S， Faist V， Erbersdobler H F. Food Chem.， 1999， 65（4）： 547-553
7Chao P C， Hsu C C， Yin M C. Food Chem.， 2009， 113（1）： 262-266
8DelgadoAndrade C，Seiquer I， Navarro M P， Morales F J. Mol. Nutrit. Food Res.， 2007， 51（3）： 341-351
9George L H， Jayne V W， Jennifer M A， Geraldine J C. Food Chem.， 2012， 131（1）： 170-174
10Céline N L， Frédéric J T. Food Chem.， 2011， 126（2）： 655-663
11GAO Chang， HE ZhiYong， ZENG MaoMao， CHEN Jie. Chinese Journal of Food and Fermentation Industries， 2013， 39（4）： 151-156
高 畅， 何志勇， 曾茂茂， 陈 洁. 食品与发酵工业， 2013， 39（4）： 151-156
12Amélie C， Lamia A A， Inès B A. J. Chromatogr. A， 2007， 1140（12）： 189-194
13ZOU Long， LIN Hong， JIANG Jie. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（7）： 983-987
邹 龙， 林 洪， 江 浩. 分析化学， 2007， 35（7）： 983-987
14Makoto M， Hitoshi I， Akiko S，Taeko N， Mari K， Masatafe T， Yukio S. J. Health Sci.， 2000， 46（4）： 304-309
15Sun X H， Tang J M， Wang J， Barbara A R， Lai K Q， Huang Y Q. Food Chem.， 2015， 172： 802-807
16Magnea G K， Sigurjon A， Hordur G K， Kolbrun S. Food Chem.， 2014， 159： 420-427
17Shima H A， Catherine M， Maria L， Ronald M， Jennifer M A. Amino Acids， 2009， 36： 317-326
18EscrigDoménech A， SimóAlfonso E F， HerreroMartínez J M， RamisRamos G. J. Chromatogr. A， 2013， 1296： 140-156
AbstractA method was developed to determine the content of Nεcarboxymethyllysine （CML） in the muscle tissues of turbot by gas chromatographymass spectrometric method. Turbot was selected as the research object， homogenized muscle tissue samples of turbot defatted by chloroform/acetone were pretreated followed by reduction， acid hydrolysis， purifying and derivatization （esterification and acylation）. The ion of m/z 392 was selected as quantitative ion and the ions of m/z 392， 365， 333， 305 were selected as qualitative ions in selected ion monitoring mode. The range of the linear calibration curve of CML derivative peak area and concentration extended from 1 μg/L to 200 μg/L. The limit of detection was 1 mg/kg and the limit of quantification was 5 mg/kg. The average recoveries ranged from 100% to 104% at 10， 150 and 350 mg/kg spiked levels and the relative standard deviation （RSD） was within 5% （n=5）.
《有机物络合萃取化学》（第二版）
戴猷元、秦炜、张瑾、单欣昌 编著
本书分原理和应用两部分，重点介绍了络合萃取的化学原理、过程特征、萃取体系、分离工艺及模型预测、应用实例及前景。在有机物络合萃取机理分析和研究日趋深入的基础上，本次对全书进行了系统地修订，并重点对应用实例部分进行了必要的补充。
本书可作为高等院校化工、生物化工、环境、制药等专业师生的教学参考书，也可供上述专业从事分离过程研究开发、设计和运行的工程技术人员参考。
书号： 9787122233899定价： 98.0元
出版时间： 2015年6月开本： 16化学工业出版社出版
摘要 建立了大菱鲆肌肉中羧甲基赖氨酸（CML）的气相色谱质谱（GCMS）检测方法。以大菱鲆为研究对象，选用三氯甲烷/丙酮对样品进行脱脂，经硼氢化钠还原、蛋白水解、净化、衍生化（酯化与酰化）后，进行GCMS选择离子监测（SIM）模式检测。选取m/z 392为定量离子，m/z 392， 365， 333， 305为定性离子。结果表明，CML三氟乙酰甲酯化衍生物峰面积与浓度在1～200 μg/L范围内呈良好线性关系，方法检出限为1 mg/kg， 定量限为5 mg/kg，3个加标水平（10， 150和350 mg/kg） 下的平均回收率在100%～104%之间，相对标准偏差RSD<5%（n=5）。
关键词[HTSS]羧甲基赖氨酸； 大菱鲆； 气相色谱质谱； 衍生化
1引言
晚期糖基化终末产物（Advanced glycation endproducts， AGEs）是食品中蛋白、脂质和核酸等组分在热加工过程中发生非酶糖基化反应的产物[1]，其中羧甲基赖氨酸（Nεcarboxymethyllysine， CML）为主要标志性产物[2]。研究表明，食品中AGEs与心脑血管疾病、肾脏疾病、糖尿病及其并发症等慢性疾病有密切关系[3，4]。为更好地监测其在食品中含量，建立灵敏可靠的检测方法非常必要。
目前，关于食品中CML检测方法有酶联免疫法（ELISA）[1，5]、高效液相色谱法（HPLC） [6～8]、液相色谱质谱联用法（LCMS）[9，10]等。ELISA法操作相对简便，但假阳性率高，仅能得到CML相对值（kU/g）；HPLC法通过衍生化使CML具有荧光性并定量分析，但该具有荧光特性的衍生物不稳定，导致结果偏差较大；LCMS具有良好的灵敏度，又避免了衍生化处理，但基质干扰带来的离子抑制效应难以避免，且检测成本昂贵 [11]。GCMS具有高灵敏度、高选择性的优势，有望开发成有效的CML检测方法。Amélie [12]等运用GCMS对食品中CML进行检测，由于前处理、基质差异等原因，虽成功检测到奶粉等产品中的CML，但未检测到鲑鱼中的CML。目前，尚未见水产品中CML确证检测方法的报道。本研究以海水鱼中重要养殖品种大菱鲆为研究对象，利用GCMS测定鱼肉中CML含量，定量限由150 μg/L[12]降到5 μg/L，为水产品中CML检测提供了技术参考。
2实验方法
2.1仪器、试剂与材料
羧甲基赖氨酸（CML，纯度98%，加拿大TRC公司）；二氯甲烷（色谱纯，美国ACS公司）；三氟乙酸酐（色谱纯，纯度99%，北京百灵威科技有限公司）；氯化亚砜（色谱纯，纯度≥99.5%，天津科密欧试剂公司）；甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）；其它试剂均为国产分析纯。
大菱鲆购自青岛南山水产市场，经“三去”处理后，取背部肌肉绞碎，分装后，置于Symbolm@@ 18℃保存备用。
2.2溶液配制
准确称取10.00 mg CML于10.00 mL超纯水，混匀，制成1 mg/mL标准贮备溶液，分装后，于Symbolm@@ 18℃保存备用。
配制6 mol/L HCl、0.2 mol/L硼酸盐缓冲液（pH 9.2）、2 mol/L NaBH4（溶于0.1 mol/L NaOH）；取1.46 mL氯化亚砜缓慢加入100 mL甲醇中，制成衍生剂备用。
2.3样品前处理
2.3.1脱脂准确称取200.0 mg样品于50 mL离心管，加入20 mL脱脂液，混匀，于4℃以4000 r/min离心15 min，弃上清液；再加入20 mL脱脂液，重复上述离心操作，弃上清液后以氮气吹干，得蛋白沉淀。本研究选取正己烷[13]、水甲醇三氯甲烷[12]、三氯甲烷丙酮[14]3种脱脂液进行比较。
2.3.2硼氢化钠还原为避免样品中羰基化合物等经后续高温蛋白水解进一步生成CML造成检测结果偏大，向蛋白沉淀中添加2 mL硼酸盐缓冲液和400 μL NaBH4溶液，混匀，于4℃反应8 h[15]。
2.3.3蛋白水解将还原后的蛋白沉淀转移至10 mL安瓿瓶中，加入8 mL 6 mol/L HCl，充入氮气后封瓶，于110℃烘箱水解，得到蛋白水解液。
3.3GCMS分析结果
为了将目标峰更好地辨别出来，采用程序升温方法进行气相色谱峰分离。在SCAN模式中（图2a），因鱼肉组织基质复杂，目标峰极易被复杂的干扰因素掩盖，因此选用SIM模式对目标化合物进行检测。根据标准品在SCAN模式下得到的质谱图（图3），选择特征定量离子与定性离子（表2），得到的选择离子流色谱图（图2b）无其它干扰峰，且峰型良好，信噪比显著提高，利于目标化合物CML准确定量分析。
3.4方法评价
3.4.1线性范围本方法采用外标法定量。准确称取10.00 mg CML标准品于反应瓶中，按2.3.5节充分衍生化后，最终溶于10.00 mL二氯甲烷，制成标准贮备液，分装后置于
Symbolm@@ 18℃贮存备用。使用前用二氯甲烷稀释，配制成1， 5， 60， 80， 100， 150和200 μg/L的标准工作液，现用现配。GCMS测定，以CML三氟乙酰甲酯化衍生物的定量离子峰面积为纵坐标、浓度为横坐标作图，得到标准工作曲线（图4）。结果表明，CML在浓度为1～200 μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数>0.999。
3.4.2检出限与定量限因大菱鲆肌肉中含有CML，所以通过稀释样品检测液，测定信噪比（S/N），确定检出限与定量限。
使用Agilent公司离线分析工作站软件计算信噪比，选取RMS S/N作为谱图信噪比参数[13]。当样品检测液RMS S/N=3时，根据检测液浓度得出CML检出限为1 mg/kg；当样品检测液RMS S/N=10时，根据检测液浓度得出CML定量限为5 mg/kg。
3.4.3准确度与精密度在样品中加入适量CML标准贮备溶液，制成10， 150和350 mg/kg的加标样品，按照2.3和2.4节，以测得添加量和添加量之比计算回收率。每个添加水平做5组平行，根据得到的回收率计算相对标准偏差（RSD），评价精密度。
不加标大菱鲆肌肉样品中约含有9.60 mg/kg的CML，选取10， 150和350 mg/kg作为加标水平，进行添加回收实验，每个添加水平做5组平行，数据见表3。结果表明，CML在3个添加水平下的平均回收率在100%～104%之间，相对标准偏差RSD<5%。结果说明，本方法检测大菱鲆肌肉中CML的准确度和精密度良好，符合生物样品的检测分析要求。
3.5样品分析
为考察方法的适用性，使用本方法对市售即食水产品进行抽检。检测结果表明，所有即食水产品中均含有CML。其中CML在罐装金枪鱼中含量为（34.81±0.46） mg/kg，罐装鲫鱼中含量为（200.60±6.58） mg/kg，烤制鱿鱼丝中含量为（335.21±9.42） mg/kg。即食水产品中的CML含量远高于生鲜大菱鲆，因即食水产品中含有糖、油等调味品，且经热加工、高温杀菌等处理过程，有利于非酶糖基化反应的进行，进而生成更多CML。
4结 论
本研究选用三氯甲烷丙酮为脱脂液，经NaBH4还原、蛋白水解后，对样品进行衍生化，选用二氯甲烷为溶剂，采用SIM模式扫描，建立了大菱鲆肌肉中CML的GCMS检测方法。与酶联免疫方法相比，GCMS法避免了酶联免疫法的假阳性，能够更加准确地对鱼类肌肉中的CML进行定性和定量分析，灵敏度更高，检测结果易与其它方法进行比较，是检测大菱鲆肌肉中CML含量的较好方法。
References
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17Shima H A， Catherine M， Maria L， Ronald M， Jennifer M A. Amino Acids， 2009， 36： 317-326
18EscrigDoménech A， SimóAlfonso E F， HerreroMartínez J M， RamisRamos G. J. Chromatogr. A， 2013， 1296： 140-156
AbstractA method was developed to determine the content of Nεcarboxymethyllysine （CML） in the muscle tissues of turbot by gas chromatographymass spectrometric method. Turbot was selected as the research object， homogenized muscle tissue samples of turbot defatted by chloroform/acetone were pretreated followed by reduction， acid hydrolysis， purifying and derivatization （esterification and acylation）. The ion of m/z 392 was selected as quantitative ion and the ions of m/z 392， 365， 333， 305 were selected as qualitative ions in selected ion monitoring mode. The range of the linear calibration curve of CML derivative peak area and concentration extended from 1 μg/L to 200 μg/L. The limit of detection was 1 mg/kg and the limit of quantification was 5 mg/kg. The average recoveries ranged from 100% to 104% at 10， 150 and 350 mg/kg spiked levels and the relative standard deviation （RSD） was within 5% （n=5）.
《有机物络合萃取化学》（第二版）
戴猷元、秦炜、张瑾、单欣昌 编著
本书分原理和应用两部分，重点介绍了络合萃取的化学原理、过程特征、萃取体系、分离工艺及模型预测、应用实例及前景。在有机物络合萃取机理分析和研究日趋深入的基础上，本次对全书进行了系统地修订，并重点对应用实例部分进行了必要的补充。
本书可作为高等院校化工、生物化工、环境、制药等专业师生的教学参考书，也可供上述专业从事分离过程研究开发、设计和运行的工程技术人员参考。
书号： 9787122233899定价： 98.0元
出版时间： 2015年6月开本： 16化学工业出版社出版
