气相色谱—质谱大体积进样法测定果汁中90种农药残留
张弛等
摘 要 采用程序升温大体积进样技术（PTVLVI）及QuEChERS方法建立了果汁中90种农药多残留的气相色谱质谱分析方法。样品用乙腈提取，经MgSO4和NaCl除水后， 以PSA和C18柱净化，用大体积进样技术的气相色谱质谱进行测定。PTVLVI优化参数为： 初始温度100℃、分流出口吹扫流量50 mL/min、分流排空时间1.5 min、进样速度2 μL/s。结果表明：90种农药在0.05～10 μg/L的范围内呈良好线性关系，相关系数（R2）为0.9879～0.9999， 相对标准偏差为3.4%～15.6%， 平均回收率在70.3%～119.2%之间。90种农药的检出限均低于10 μg/kg，定量限低于20 μg/kg。本方法快速、简便、灵敏度高、重现性好，适用于果汁中的多种类农药残留分析。
关键词 ；果汁； 农药多残留； 大体积进样； 气相色谱质谱； QuEChERS
1 引 言
果汁因其营养丰富而受到广大消费者的喜爱。目前，对于水果和蔬菜中农药多残留的检测方法研究较多，而对果汁这一具有潜在消费空间的饮品中的农药多残留检测方法研究较少。随着果汁消费量和出口量的不断增加，国家相关部门也加大了对果汁质量安全的监控力度，因此，亟需建立快速、可靠的果汁中农药多残留检测方法[1]。
目前， 农药残留的检测方法主要有气相色谱法（GC）[2～4]、高效液相色谱法（HPLC）[5～7]、气相色谱质谱法（GCMS）[8～13]、液相色谱质谱法（LCMS）[3，14～17]、免疫分析法[18]等。程序升温大体积进样技术（PTVLVI）是在GCMS基础上发展起来的，可以有效提高检测灵敏度[8]。其原理是在低温进样口中将样品中的绝大部分溶剂挥发除去，使低挥发性的痕量待测物质保留在衬管中，再将待测物质通过程序升温使之汽化，然后进入色谱柱进行分析[19，20]。
样品前处理是农药残留分析检测的关键步骤，占农药残留整个分析过程2/3的时间[21]。近年来， 农药残留分析的样品前处理方法正朝着简单化、节约化和微型化发展。QuEChERS方法是一种快速、简便、价格低廉的样品前处理方法，目前已经广泛应用于果蔬中的农药多残留检测[14，22～26]。Lehotay等以莴笋和柑橘为基质， 对229种农药应用QuEChERSGC/LCMS方法进行验证，回收率为70%～120%，相对标准偏差小于10%[25]。Lesueur等也采用QuEChERS方法建立4种水果和蔬菜基质中140种农药残留检测方法[26]。QuEChERS技术在其它基质中也得到了大量应用[27～31]。
本实验结合QuEChERS方法与PTVLVI技术的优势，在文献[8]的基础上通过引入QuEChERS前处理方法和改进PTVLVI条件， 将检测农药数量提高到90种，在保证检测精度的同时扩大了检测范围，缩短了前处理时间，简化了前处理步骤，大幅降低了有机溶剂用量。本方法是一种快速、简便、节约、有效的检测方法，能够满足果汁中90种农药多残留快速确证检测的需求。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Agilent 78905975C 气相色谱质谱仪（配有G6501CTC三位一体进样器、100 μL进样针和PTV进样口）； HP5MS毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm，美国Agilent公司。
乙腈、环己烷（色谱纯，CNW Technologies GmbH）； 丙酮（色谱纯，成都市科龙化工试剂厂）； PSA（CNW Technologies GmbH）； GCB、C18（天津博纳艾杰尔有限公司）； 农药标准品（Dr Ehrenstorfer GmbH、Chem. Service、Cerilliant）； 内环氧七氯A（Dr Ehrenstorfer GmbH）； 其它药品购于国药集团化学试剂。果汁样品购于当地超市。
2.2 标准溶液配制
标准溶液： 农药标准品10 mg用丙酮溶解并定容至10 mL得标准储备液。用丙酮环己烷（3∶7，V/V）配制成混合标准工作液。
内标溶液： 10 mg内环氧七氯A用丙酮溶解并定容至10 mL，得内标储备液。用丙酮配成20和60 mg/L的内标工作溶液
2.3 前处理步骤
样品3.00 g（±0.01 g）于15 mL具塞离心管中，加入6 mL乙腈、15 mg山梨醇，振荡1 min，加入0.9 g MgSO4、0.3 g NaCl，500 r/min振荡3 min，4000 r/min离心5 min，取4.00 mL上清液转入已有45.0 mg PSA、15.0 mg C18的10 mL离心管中（混合果蔬汁需再加入5 .0 mg GCB），振荡混合1 min，4000 r/min离心5 min，上清液2.00 mL吹干，用丙酮环己烷（3∶7， V/V）定容至1.00 mL，GCMS分析。
2.4 仪器条件
气相条件： 进样口230℃； 升温程序： 起始70℃ 保持2 min， 25℃/min升温至150℃，以3℃/min升至200℃，再以8℃/min升温至280℃，保持10 min； 采用恒压模式，压力为17 psi。
PTV条件升温程序： 起始温度为100℃，保持2.0 min，再以700℃/min升温至270℃； 分流出口吹扫流量： 50 mL/min； 分流排空时间： 1.5 min； 分流吹扫流量： 2.0 mL/min； 进样口压力： 117.22 kPa； 进样体积： 50 μL； 进样速度： 2 μL/s。
质谱条件： MS电离方式为EI，电子能量70 eV； 接口温度280℃； 离子源温度230℃； 四级杆温度150℃； 溶剂延迟时间4 min。其它条件见表1。
3 结果与分析
3.1 PTV条件优化
从90种目标物中选取有代表性的农药20种，其中包括高沸点组分、低沸点组分、不同类型和不同出峰时间的农药，在不同的条件下比较各个化合物的响应值，优化PTV参数[12]。
分流排空时间既要保证溶剂被完全排除，又要保证目标分析物的定量分析准确。改变分流排空时间（1， 1.5， 2， 2.5和3 min）发现， 当分流时间为1.5 min时，目标化合物峰高最大（图1），且溶剂峰较小。
分流排空量： 低排空量可以使挥发性较大的农药回收率较高，峰型较好； 高排空量可以更快的将溶剂清除衬管，减少溶剂排空时间。分流排空量，分别设定为30， 40， 50， 60和70 mL/min进行实验，结果表明，分流放空量在50 mL/min时，目标化合物峰面积较大（图2），峰型较好，溶剂峰较小。
分流吹扫时间： 当吹扫时间过长时，目标分析物峰型变宽； 当吹扫时间过短时，目标分析物可能未完全转移到色谱柱而影响定量结果。实验设置梯度分流吹扫时间1 ， 1.5， 2， 2.5和3 min进行优化。图3表明，吹扫时间为2 min时，目标化合物峰高最大。
3.2 样品前处理条件的选择和优化
除水剂用量： 选择溶解性不同的10种农药，比较不同除水剂用量下目标分析物回收率。结果显示，当MgSO4用量为1.2 g时，部分农药回收率明显偏低，克菌丹、杀虫脒、甲拌磷、回收率低于70%（图4），当除水剂用量为0.9 g时，10种农药的回收率有所提高，均大于70%。分析原因，可能是由于果汁中的水与MgSO4产生大量热量，使热不稳定农药受热分解。
净化剂的选择及用量： 如图5所示，本实验同时加入PSA和C18进行净化。选择9种受基质影响较大的农药优化净化剂的用量，结果表明，当C18的用量为15 mg，PSA的用量为45 mg时，净化效果较理想，基质干扰小，目标化合物回收率接近100%。另外，根据样品中的色素含量高低可以选择加入适量的GCB来提取出色素，使样品澄清，降低对仪器的损害成程度。
3.3 方法评价
90种农药均表现出良好的线性关系。有84种相关系数大于0.99，其余6种相关系数在0.98～0.99之间。90种目标分析物的检出限在0.007～5.982 μg/kg之间，定量限在0.023～19.94 μg/kg之间，低于现有的检测方法或与之持平。90种目标分析物的相对标准偏差在3.4%～15.6%之间，除丁硫克百威外，其它89种农药回收率在70.3 %～119.2%之间，满足国家有关标准对农药多残留检测方法的要求。实验过程中发现丁硫克百威受基质干扰非常明显，回收率明显偏高，具体原因有待进一步研究（表2）。
3.4 实际样品测定
从当地超市中购买柑橘汁、柠檬汁、葡萄汁、猕猴桃汁、混合果蔬汁、苹果汁2种、橙汁3种、桃汁2种，共计12种果汁，利用本方法对其中的农药残留进行检测。部分结果如表3所示。其中检出双甲脒、毒死蜱、抑霉唑、异菌脲、马拉硫磷、亚胺硫磷、克螨特、三唑酮、甲氰菊酯共9种农药。参照GB27632014《食品中农药最大残留限量标准》[32]，均未超出最大残留限量（MRL）。
4 结 论
在文献[8]基础上， 通过对QuEChERS方法进行优化，并结合大体积进样技术的优势，建立了果汁中90种农药多残留检测方法。本方法与现有国标相比，操作简单、快速准确、灵敏度高、重现性良好，而且避免大量有机溶剂的使用，减轻了对环境的污染，适合日常检测。
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食品中农药最大残留限量标准. 中华人民共和国国家标准. GB/T 27632014
Abstract A gas chromatographymass spectrometric （GCMS） method was established for the simultaneous determination of 90 pesticide residues in fruit juices using programmable temperature vaporizerbased large volume injection （PTVLVI） and QuEChERS Cleanup. The pesticides of fruits sample was extracted with acetonitrile， and after the water in the extractant was removed with anhydrous magnesium sulfate and sodium chloride， the pesticides were further cleaned up with dispersive method on PSA and C18， and detected by gas chromatographytandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring mode. Under the optimum PTVLVI parameters including inlet temperature of 100℃， split vent flow rate at 50 mL/min， 1.5 min of evaporation time and 2 μL/s of injection speed， GCMS analysis for the pesticides was carried out. The results showed that， in the pesticides concentration range of 0.05-10 μg/L， the method kept good linear relationships with the correlative coefficients between 0.9879 and 0.9999. The recoveries of the pesticide were from 70.3% to 119.2%， the relative standard deviations （RSDs） were between 3.4% and 15.6%. The limits of detection （LOD） were below 10 μg/kg and the limit of Quantitation （LOQ） was less than 20 μg/kg. The method is simple， quick， safe， reproducible and applicable to confirm pesticide residue in the fruit juices samples.
摘 要 采用程序升温大体积进样技术（PTVLVI）及QuEChERS方法建立了果汁中90种农药多残留的气相色谱质谱分析方法。样品用乙腈提取，经MgSO4和NaCl除水后， 以PSA和C18柱净化，用大体积进样技术的气相色谱质谱进行测定。PTVLVI优化参数为： 初始温度100℃、分流出口吹扫流量50 mL/min、分流排空时间1.5 min、进样速度2 μL/s。结果表明：90种农药在0.05～10 μg/L的范围内呈良好线性关系，相关系数（R2）为0.9879～0.9999， 相对标准偏差为3.4%～15.6%， 平均回收率在70.3%～119.2%之间。90种农药的检出限均低于10 μg/kg，定量限低于20 μg/kg。本方法快速、简便、灵敏度高、重现性好，适用于果汁中的多种类农药残留分析。
关键词 ；果汁； 农药多残留； 大体积进样； 气相色谱质谱； QuEChERS
1 引 言
果汁因其营养丰富而受到广大消费者的喜爱。目前，对于水果和蔬菜中农药多残留的检测方法研究较多，而对果汁这一具有潜在消费空间的饮品中的农药多残留检测方法研究较少。随着果汁消费量和出口量的不断增加，国家相关部门也加大了对果汁质量安全的监控力度，因此，亟需建立快速、可靠的果汁中农药多残留检测方法[1]。
目前， 农药残留的检测方法主要有气相色谱法（GC）[2～4]、高效液相色谱法（HPLC）[5～7]、气相色谱质谱法（GCMS）[8～13]、液相色谱质谱法（LCMS）[3，14～17]、免疫分析法[18]等。程序升温大体积进样技术（PTVLVI）是在GCMS基础上发展起来的，可以有效提高检测灵敏度[8]。其原理是在低温进样口中将样品中的绝大部分溶剂挥发除去，使低挥发性的痕量待测物质保留在衬管中，再将待测物质通过程序升温使之汽化，然后进入色谱柱进行分析[19，20]。
样品前处理是农药残留分析检测的关键步骤，占农药残留整个分析过程2/3的时间[21]。近年来， 农药残留分析的样品前处理方法正朝着简单化、节约化和微型化发展。QuEChERS方法是一种快速、简便、价格低廉的样品前处理方法，目前已经广泛应用于果蔬中的农药多残留检测[14，22～26]。Lehotay等以莴笋和柑橘为基质， 对229种农药应用QuEChERSGC/LCMS方法进行验证，回收率为70%～120%，相对标准偏差小于10%[25]。Lesueur等也采用QuEChERS方法建立4种水果和蔬菜基质中140种农药残留检测方法[26]。QuEChERS技术在其它基质中也得到了大量应用[27～31]。
本实验结合QuEChERS方法与PTVLVI技术的优势，在文献[8]的基础上通过引入QuEChERS前处理方法和改进PTVLVI条件， 将检测农药数量提高到90种，在保证检测精度的同时扩大了检测范围，缩短了前处理时间，简化了前处理步骤，大幅降低了有机溶剂用量。本方法是一种快速、简便、节约、有效的检测方法，能够满足果汁中90种农药多残留快速确证检测的需求。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Agilent 78905975C 气相色谱质谱仪（配有G6501CTC三位一体进样器、100 μL进样针和PTV进样口）； HP5MS毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm，美国Agilent公司。
乙腈、环己烷（色谱纯，CNW Technologies GmbH）； 丙酮（色谱纯，成都市科龙化工试剂厂）； PSA（CNW Technologies GmbH）； GCB、C18（天津博纳艾杰尔有限公司）； 农药标准品（Dr Ehrenstorfer GmbH、Chem. Service、Cerilliant）； 内环氧七氯A（Dr Ehrenstorfer GmbH）； 其它药品购于国药集团化学试剂。果汁样品购于当地超市。
2.2 标准溶液配制
标准溶液： 农药标准品10 mg用丙酮溶解并定容至10 mL得标准储备液。用丙酮环己烷（3∶7，V/V）配制成混合标准工作液。
内标溶液： 10 mg内环氧七氯A用丙酮溶解并定容至10 mL，得内标储备液。用丙酮配成20和60 mg/L的内标工作溶液
2.3 前处理步骤
样品3.00 g（±0.01 g）于15 mL具塞离心管中，加入6 mL乙腈、15 mg山梨醇，振荡1 min，加入0.9 g MgSO4、0.3 g NaCl，500 r/min振荡3 min，4000 r/min离心5 min，取4.00 mL上清液转入已有45.0 mg PSA、15.0 mg C18的10 mL离心管中（混合果蔬汁需再加入5 .0 mg GCB），振荡混合1 min，4000 r/min离心5 min，上清液2.00 mL吹干，用丙酮环己烷（3∶7， V/V）定容至1.00 mL，GCMS分析。
2.4 仪器条件
气相条件： 进样口230℃； 升温程序： 起始70℃ 保持2 min， 25℃/min升温至150℃，以3℃/min升至200℃，再以8℃/min升温至280℃，保持10 min； 采用恒压模式，压力为17 psi。
PTV条件升温程序： 起始温度为100℃，保持2.0 min，再以700℃/min升温至270℃； 分流出口吹扫流量： 50 mL/min； 分流排空时间： 1.5 min； 分流吹扫流量： 2.0 mL/min； 进样口压力： 117.22 kPa； 进样体积： 50 μL； 进样速度： 2 μL/s。
质谱条件： MS电离方式为EI，电子能量70 eV； 接口温度280℃； 离子源温度230℃； 四级杆温度150℃； 溶剂延迟时间4 min。其它条件见表1。
3 结果与分析
3.1 PTV条件优化
从90种目标物中选取有代表性的农药20种，其中包括高沸点组分、低沸点组分、不同类型和不同出峰时间的农药，在不同的条件下比较各个化合物的响应值，优化PTV参数[12]。
分流排空时间既要保证溶剂被完全排除，又要保证目标分析物的定量分析准确。改变分流排空时间（1， 1.5， 2， 2.5和3 min）发现， 当分流时间为1.5 min时，目标化合物峰高最大（图1），且溶剂峰较小。
分流排空量： 低排空量可以使挥发性较大的农药回收率较高，峰型较好； 高排空量可以更快的将溶剂清除衬管，减少溶剂排空时间。分流排空量，分别设定为30， 40， 50， 60和70 mL/min进行实验，结果表明，分流放空量在50 mL/min时，目标化合物峰面积较大（图2），峰型较好，溶剂峰较小。
分流吹扫时间： 当吹扫时间过长时，目标分析物峰型变宽； 当吹扫时间过短时，目标分析物可能未完全转移到色谱柱而影响定量结果。实验设置梯度分流吹扫时间1 ， 1.5， 2， 2.5和3 min进行优化。图3表明，吹扫时间为2 min时，目标化合物峰高最大。
3.2 样品前处理条件的选择和优化
除水剂用量： 选择溶解性不同的10种农药，比较不同除水剂用量下目标分析物回收率。结果显示，当MgSO4用量为1.2 g时，部分农药回收率明显偏低，克菌丹、杀虫脒、甲拌磷、回收率低于70%（图4），当除水剂用量为0.9 g时，10种农药的回收率有所提高，均大于70%。分析原因，可能是由于果汁中的水与MgSO4产生大量热量，使热不稳定农药受热分解。
净化剂的选择及用量： 如图5所示，本实验同时加入PSA和C18进行净化。选择9种受基质影响较大的农药优化净化剂的用量，结果表明，当C18的用量为15 mg，PSA的用量为45 mg时，净化效果较理想，基质干扰小，目标化合物回收率接近100%。另外，根据样品中的色素含量高低可以选择加入适量的GCB来提取出色素，使样品澄清，降低对仪器的损害成程度。
3.3 方法评价
90种农药均表现出良好的线性关系。有84种相关系数大于0.99，其余6种相关系数在0.98～0.99之间。90种目标分析物的检出限在0.007～5.982 μg/kg之间，定量限在0.023～19.94 μg/kg之间，低于现有的检测方法或与之持平。90种目标分析物的相对标准偏差在3.4%～15.6%之间，除丁硫克百威外，其它89种农药回收率在70.3 %～119.2%之间，满足国家有关标准对农药多残留检测方法的要求。实验过程中发现丁硫克百威受基质干扰非常明显，回收率明显偏高，具体原因有待进一步研究（表2）。
3.4 实际样品测定
从当地超市中购买柑橘汁、柠檬汁、葡萄汁、猕猴桃汁、混合果蔬汁、苹果汁2种、橙汁3种、桃汁2种，共计12种果汁，利用本方法对其中的农药残留进行检测。部分结果如表3所示。其中检出双甲脒、毒死蜱、抑霉唑、异菌脲、马拉硫磷、亚胺硫磷、克螨特、三唑酮、甲氰菊酯共9种农药。参照GB27632014《食品中农药最大残留限量标准》[32]，均未超出最大残留限量（MRL）。
4 结 论
在文献[8]基础上， 通过对QuEChERS方法进行优化，并结合大体积进样技术的优势，建立了果汁中90种农药多残留检测方法。本方法与现有国标相比，操作简单、快速准确、灵敏度高、重现性良好，而且避免大量有机溶剂的使用，减轻了对环境的污染，适合日常检测。
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食品中农药最大残留限量标准. 中华人民共和国国家标准. GB/T 27632014
Abstract A gas chromatographymass spectrometric （GCMS） method was established for the simultaneous determination of 90 pesticide residues in fruit juices using programmable temperature vaporizerbased large volume injection （PTVLVI） and QuEChERS Cleanup. The pesticides of fruits sample was extracted with acetonitrile， and after the water in the extractant was removed with anhydrous magnesium sulfate and sodium chloride， the pesticides were further cleaned up with dispersive method on PSA and C18， and detected by gas chromatographytandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring mode. Under the optimum PTVLVI parameters including inlet temperature of 100℃， split vent flow rate at 50 mL/min， 1.5 min of evaporation time and 2 μL/s of injection speed， GCMS analysis for the pesticides was carried out. The results showed that， in the pesticides concentration range of 0.05-10 μg/L， the method kept good linear relationships with the correlative coefficients between 0.9879 and 0.9999. The recoveries of the pesticide were from 70.3% to 119.2%， the relative standard deviations （RSDs） were between 3.4% and 15.6%. The limits of detection （LOD） were below 10 μg/kg and the limit of Quantitation （LOQ） was less than 20 μg/kg. The method is simple， quick， safe， reproducible and applicable to confirm pesticide residue in the fruit juices samples.
