高效液相色谱—串联质谱法测定不同畜禽配合饲料中伏马毒素的含量
郭文博等
摘 要 为摸清复杂基质中FB1和FB2污染的准确水平，本研究建立了高效液相色谱串联质谱法（LCMS/MS）测定不同畜禽配合饲料中伏马毒素B1（FB1）和B2（FB2）的分析方法。样品用乙腈水（50∶50， V/V）提取，MAX强阴离子固相萃取柱富集净化后，以0.1%甲酸和甲醇为流动相，经Thermo C18色谱柱（100 mm×2.1 mm， 5 μm）分离，采用电喷雾正电离（ESI+）多反应模式（MRM）监测，外标法定量。结果表明：不同饲料样品中FB1和FB2在1～500 μg/kg之间线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.9990，定量限分别为0.098和0.197 μg/kg，检出限分别为0.328和0.656 μg/kg； 低、中、高浓度加标回收率为89.7%～95.1%，相对标准偏差（RSD）为3.2%～8.6%。用本方法对市场上采集的106份不同畜禽配合饲料中FB1和FB2含量进行测定，样品检出率为98.11%。本方法适用于基质复杂的畜禽配合饲料中伏马毒素FB1和FB2的准确、快速定性与定量分析。
关键词 伏马毒素； 阴离子固相萃取柱； 液相色谱串联质谱法； 畜禽配合饲料
1 引 言
伏马毒素是20世纪80年代末发现，由串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）在一定温度和湿度条件下产生的，以污染玉米及其制品为主的水溶性次级代谢产物[1]，由多氢醇与丙三羧酸组成的双酯类化合物，与人或动物机体内神经鞘氨醇结构极为相似，在神经鞘脂代谢过程中能竞争性地结合神经鞘氨醇N2酰基转移酶，从而抑制神经鞘氨醇的生物合成、阻碍鞘脂类代谢，引发各种疾病[2]。研究证实，伏马毒素能引起马大脑白质软化症（Equine leucoencephalomalacia，ELEM），猪肺水肿综合征（Porcine pulmonary edema，PPE）； 小鼠实验也表明， 伏马毒素对肝脏或肾脏容易造成损伤[3，4]。此外，伏马毒素还具有很强的细胞毒性及免疫毒性，与人类食道癌的发生密切相关[5]。因此，国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）将伏马毒素列为2B级致癌物作为人类潜在的致癌物质。
伏马毒素主要分布在玉米及玉米制品中，严重威胁畜禽及人类健康[6]。玉米作为畜禽配合饲料的最主要原料，是畜牧业赖以发展的重要基础。因此，伏马毒素含量水平的准确检测对于畜禽配合饲料中伏马毒素的防控和预警具有重要意义。目前，关于饲料中伏马毒素的检测方法主要有柱前衍生高效液相色谱法[7，8]、气相色谱法[9]、薄层色谱法[10]、酶联免疫法[11]等，这些方法前处理复杂且灵敏度较低，不能满足快速痕量检测的要求。我国国家标准中对于玉米及其制品中伏马毒素的检测主要采用高效液相色谱法和荧光光度法[12]，选用液相色谱串联质谱法（LCMS/MS）作为仲裁法[13]，也有采用LCMS/MS测定谷物中的伏马毒素的报道[14，15]，但这些方法都存在前处理复杂、灵敏度低等问题。此外，畜禽配合饲料由玉米、小麦、麸皮、棉粕、豆粕等多种原料混合而成，基质复杂多样，容易产生基质效应，且不同动物饲料随生理性影响组成各有差异，迫切需要一种能适应不同配合饲料基质、快速有效的检测方法，以适应饲料行业监督检查和畜牧业生产的需求。在前人研究的基础上，本研究采用MAX阴离子固相萃取柱富集净化，改进流动相洗脱程序，缩短分析时间，有效消除基质效应，并用LCMS/MS进行分析，提高检测灵敏度，可用于大批量畜禽配合饲料中FB1和FB2检测分析，为不同畜禽配合饲料中伏马毒素的准确定量分析提供技术支撑。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
液相色谱串联质谱：TSQ Quant配Surveyor 液相操作系统（美国Thermo Fisher scientific公司）； MAX柱（200 mg，6 mL，美国Waters 公司）。Heraeus Multifuge X3高速离心机（Thermo Fisher Scientific中国有限公司）。
甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merck公司）； 甲酸、乙酸（色谱纯，美国Aladdin公司）； FB1、FB2标准品（德国Sigma公司）； 实验用水由Millopore Synergy超纯水仪（美国Millipore公司）制备。
2.2 实验方法
2.2.1 液相色谱条件 Thermo C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）； 流动相A为0.1%甲酸； 流动相B为甲醇； 梯度洗脱： 0～1.0 mim，50% B； 1.0～7.0 min，50%～100% B； 7.0～8.0 min，100% B； 8.0～8.2 min，100%～50% B； 8.2～9.0 min，50% B。流速为300 μL/min； 进样量5 μL； 柱温30 ℃。
2.2.2 质谱条件 范围m/z 300～800；碎裂电压为1.5 V； 喷雾电压为3.5 kV； 雾化气压采用电喷雾ESI（+）离子源，多反应监测模式（MRM）采集；扫描力3500 Pa； 毛细管温度为350 ℃； 鞘气压45 Pa； 辅助气压15 Pa。质谱检测FB1和FB2的参数见表1。
2.2.3 样品提取净化 将饲料样品充分粉碎，使其可通过1 mm孔径网筛。准确称取1.0 g±0.01 g饲料样品于10 mL离心管中，加入5.0 mL乙腈水（50∶50， V/V）提取剂[16，17]，涡旋混合1 min，超声1 h，4500 r/min离心10 min。MAX柱依次用5 mL甲醇和5 mL甲醇水（3∶1， V/V）活化，然后加入2 mL上清液，再依次加入5 mL甲醇水（3∶1， V/V）和5 mL甲醇淋洗MAX小柱，最后用10 mL甲醇乙酸（99∶1， V/V）洗脱，收集洗脱液，在45 ℃氮气吹干，残渣用乙腈水（50∶50， V/V）定容至1 mL，过0.22 μm滤膜后待测。
3 结果与讨论
3.1 色谱条件优化
3.1.1 流动相组分的选择
由于伏马毒素在ESI（+）条件下产生的是[M+H]+离子，而酸性溶液有助于其离子化[18]，所以本实验选择在弱洗脱溶液中添加易挥发的甲酸，提高伏马毒素离子化效率。本实验以0.1%甲酸和甲醇为流动相，与0.05%， 0.2%， 0.5%甲酸和甲醇相比，两种伏马毒素的分离度好，峰形对称且灵敏度高，如图1。因此，本实验最终选择0.1%甲酸和甲醇为流动相。
3.1.2 起始流动相比例的选择 分别以0.1%甲酸甲醇（80∶20， V/V） 和（50∶50， V/V）作为初始流动相，结果表明：初始流动相为0.1%甲酸甲醇（80∶20， V/V）时，峰形较宽，出峰时间晚，灵敏度较低； 初始流动相为0.1%甲酸甲醇（50∶50， V/V）时，FB1与的FB2分离度好，出峰时间适中，峰形对称，灵敏度高。因此，选择0.1%甲酸甲醇（50∶50， V/V）作为梯度洗脱的起始流动相。
3.2 不同净化柱的选择
3.4 方法的回收率和精密度
准确称取1.00 g粉碎后的饲料样品，加入适量的FB1和FB2混合标准溶液，使得饲料基质中FB1、FB2的含量分别为50， 100和200 μg/kg，每个水平做5个平行，按上述条件进行处理和测定，计算回收率。FB1、FB2在不同添加水平的回收率见表3，FB1、FB2在饲料基质中3个加标水平的回收率为89.7%～95.1%，符合国际上对玉米及饲料样品中伏马毒素污染残留检测的要求。
3.5 样品分析
采用方法对上海及周边城市随机采集的不同品牌7类106个畜禽配合饲料样品中的FB1、FB2含量进行测定，结果如图3。伏马毒素检出率为98.11%，在所有检测样品中，FB1总含量在0～1 mg/kg之间有66个，占62.26%； 含量在1 mg/kg 以上的有40个，占37.74%，最高含量达20.1 mg/kg； FB2含量基本在0～1 mg/kg。因此，本方法适合不同种类畜禽配合饲料中FB1、FB2样品的检测。
4 结 论
本实验用乙腈水（50∶50， V/V）作为提取剂，离心后，经MAX净化柱富集净化，以0.1%甲酸和甲醇为流动相分离，高效液相色谱串联质谱法对不同畜禽配合饲料样品中的FB1和FB2含量进行检测。结果表明，本方法前处理简单、重复性好、回收率和灵敏度高，适用于畜禽配合饲料中伏马毒素的准确定量，为动物饲料中伏马毒素的风险评估奠定基础。
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钱鸣蓉， 吴俐勤， 章 虎， 刘 飞， 李 锐， 陈志民， 方丽珍. 分析化学， 2012， 40（5）： 757-761
Abstract A method was developed for the determination of fumonisin B1 （FB1） and fumonisin B2 （FB2） in livestock and poultry formula feeds by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （LCMS/MS. After extracted by acetonitrilewater （50∶50， V/V） and purified with MAX solid phase extraction column， the fumonisins were separated by Thermo C18 （100 mm×2.1 mm， 5 μm） column with 0.1% formic acid in water and methanol as the mobile phase. Multiple reaction monitoring （MRM） was used to acquire mass spectrometric data under electrospray positive ionization mode （ESI+）. The results showed that the linear correlation coefficients （R2） of fumonisin FB1 and FB2 were all greater than 0.999 in the range of 1-500 μg/L. The limits of quantitation （LOQ） were 0.098 and 0.197 μg/L， and the limits of detection （LOD） were 0.328 and 0.656 μg/L， respectively. At different spiked levels， the recoveries of FB1 and FB2 were ranged from 89.7% to 95.1%， and the relative standard deviation （RSD） was ranged from 3.2% to 8.6%. Additionally， the detection rate reached 98.11% screening through the established method in the 106 livestock and poultry formula feeds collected from markets. This result indicates that the method is suitable for accurate quantitative analysis of FB1 and FB2 in different complicated livestock and poultry formula feeds.
Keywords Fumonisins； Anion exchange solid phase extraction column； High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Livestock and poultry formula feeds
（Received 9 September 2014； accepted 5 January 2015）
This work was supported by the Key Project of Developing Agriculture through Science and Technology of Shanghai Municipal Agricultural Commission （No. 38 （2013）， 32 （2014））
摘 要 为摸清复杂基质中FB1和FB2污染的准确水平，本研究建立了高效液相色谱串联质谱法（LCMS/MS）测定不同畜禽配合饲料中伏马毒素B1（FB1）和B2（FB2）的分析方法。样品用乙腈水（50∶50， V/V）提取，MAX强阴离子固相萃取柱富集净化后，以0.1%甲酸和甲醇为流动相，经Thermo C18色谱柱（100 mm×2.1 mm， 5 μm）分离，采用电喷雾正电离（ESI+）多反应模式（MRM）监测，外标法定量。结果表明：不同饲料样品中FB1和FB2在1～500 μg/kg之间线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.9990，定量限分别为0.098和0.197 μg/kg，检出限分别为0.328和0.656 μg/kg； 低、中、高浓度加标回收率为89.7%～95.1%，相对标准偏差（RSD）为3.2%～8.6%。用本方法对市场上采集的106份不同畜禽配合饲料中FB1和FB2含量进行测定，样品检出率为98.11%。本方法适用于基质复杂的畜禽配合饲料中伏马毒素FB1和FB2的准确、快速定性与定量分析。
关键词 伏马毒素； 阴离子固相萃取柱； 液相色谱串联质谱法； 畜禽配合饲料
1 引 言
伏马毒素是20世纪80年代末发现，由串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）在一定温度和湿度条件下产生的，以污染玉米及其制品为主的水溶性次级代谢产物[1]，由多氢醇与丙三羧酸组成的双酯类化合物，与人或动物机体内神经鞘氨醇结构极为相似，在神经鞘脂代谢过程中能竞争性地结合神经鞘氨醇N2酰基转移酶，从而抑制神经鞘氨醇的生物合成、阻碍鞘脂类代谢，引发各种疾病[2]。研究证实，伏马毒素能引起马大脑白质软化症（Equine leucoencephalomalacia，ELEM），猪肺水肿综合征（Porcine pulmonary edema，PPE）； 小鼠实验也表明， 伏马毒素对肝脏或肾脏容易造成损伤[3，4]。此外，伏马毒素还具有很强的细胞毒性及免疫毒性，与人类食道癌的发生密切相关[5]。因此，国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）将伏马毒素列为2B级致癌物作为人类潜在的致癌物质。
伏马毒素主要分布在玉米及玉米制品中，严重威胁畜禽及人类健康[6]。玉米作为畜禽配合饲料的最主要原料，是畜牧业赖以发展的重要基础。因此，伏马毒素含量水平的准确检测对于畜禽配合饲料中伏马毒素的防控和预警具有重要意义。目前，关于饲料中伏马毒素的检测方法主要有柱前衍生高效液相色谱法[7，8]、气相色谱法[9]、薄层色谱法[10]、酶联免疫法[11]等，这些方法前处理复杂且灵敏度较低，不能满足快速痕量检测的要求。我国国家标准中对于玉米及其制品中伏马毒素的检测主要采用高效液相色谱法和荧光光度法[12]，选用液相色谱串联质谱法（LCMS/MS）作为仲裁法[13]，也有采用LCMS/MS测定谷物中的伏马毒素的报道[14，15]，但这些方法都存在前处理复杂、灵敏度低等问题。此外，畜禽配合饲料由玉米、小麦、麸皮、棉粕、豆粕等多种原料混合而成，基质复杂多样，容易产生基质效应，且不同动物饲料随生理性影响组成各有差异，迫切需要一种能适应不同配合饲料基质、快速有效的检测方法，以适应饲料行业监督检查和畜牧业生产的需求。在前人研究的基础上，本研究采用MAX阴离子固相萃取柱富集净化，改进流动相洗脱程序，缩短分析时间，有效消除基质效应，并用LCMS/MS进行分析，提高检测灵敏度，可用于大批量畜禽配合饲料中FB1和FB2检测分析，为不同畜禽配合饲料中伏马毒素的准确定量分析提供技术支撑。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
液相色谱串联质谱：TSQ Quant配Surveyor 液相操作系统（美国Thermo Fisher scientific公司）； MAX柱（200 mg，6 mL，美国Waters 公司）。Heraeus Multifuge X3高速离心机（Thermo Fisher Scientific中国有限公司）。
甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merck公司）； 甲酸、乙酸（色谱纯，美国Aladdin公司）； FB1、FB2标准品（德国Sigma公司）； 实验用水由Millopore Synergy超纯水仪（美国Millipore公司）制备。
2.2 实验方法
2.2.1 液相色谱条件 Thermo C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）； 流动相A为0.1%甲酸； 流动相B为甲醇； 梯度洗脱： 0～1.0 mim，50% B； 1.0～7.0 min，50%～100% B； 7.0～8.0 min，100% B； 8.0～8.2 min，100%～50% B； 8.2～9.0 min，50% B。流速为300 μL/min； 进样量5 μL； 柱温30 ℃。
2.2.2 质谱条件 范围m/z 300～800；碎裂电压为1.5 V； 喷雾电压为3.5 kV； 雾化气压采用电喷雾ESI（+）离子源，多反应监测模式（MRM）采集；扫描力3500 Pa； 毛细管温度为350 ℃； 鞘气压45 Pa； 辅助气压15 Pa。质谱检测FB1和FB2的参数见表1。
2.2.3 样品提取净化 将饲料样品充分粉碎，使其可通过1 mm孔径网筛。准确称取1.0 g±0.01 g饲料样品于10 mL离心管中，加入5.0 mL乙腈水（50∶50， V/V）提取剂[16，17]，涡旋混合1 min，超声1 h，4500 r/min离心10 min。MAX柱依次用5 mL甲醇和5 mL甲醇水（3∶1， V/V）活化，然后加入2 mL上清液，再依次加入5 mL甲醇水（3∶1， V/V）和5 mL甲醇淋洗MAX小柱，最后用10 mL甲醇乙酸（99∶1， V/V）洗脱，收集洗脱液，在45 ℃氮气吹干，残渣用乙腈水（50∶50， V/V）定容至1 mL，过0.22 μm滤膜后待测。
3 结果与讨论
3.1 色谱条件优化
3.1.1 流动相组分的选择
由于伏马毒素在ESI（+）条件下产生的是[M+H]+离子，而酸性溶液有助于其离子化[18]，所以本实验选择在弱洗脱溶液中添加易挥发的甲酸，提高伏马毒素离子化效率。本实验以0.1%甲酸和甲醇为流动相，与0.05%， 0.2%， 0.5%甲酸和甲醇相比，两种伏马毒素的分离度好，峰形对称且灵敏度高，如图1。因此，本实验最终选择0.1%甲酸和甲醇为流动相。
3.1.2 起始流动相比例的选择 分别以0.1%甲酸甲醇（80∶20， V/V） 和（50∶50， V/V）作为初始流动相，结果表明：初始流动相为0.1%甲酸甲醇（80∶20， V/V）时，峰形较宽，出峰时间晚，灵敏度较低； 初始流动相为0.1%甲酸甲醇（50∶50， V/V）时，FB1与的FB2分离度好，出峰时间适中，峰形对称，灵敏度高。因此，选择0.1%甲酸甲醇（50∶50， V/V）作为梯度洗脱的起始流动相。
3.2 不同净化柱的选择
3.4 方法的回收率和精密度
准确称取1.00 g粉碎后的饲料样品，加入适量的FB1和FB2混合标准溶液，使得饲料基质中FB1、FB2的含量分别为50， 100和200 μg/kg，每个水平做5个平行，按上述条件进行处理和测定，计算回收率。FB1、FB2在不同添加水平的回收率见表3，FB1、FB2在饲料基质中3个加标水平的回收率为89.7%～95.1%，符合国际上对玉米及饲料样品中伏马毒素污染残留检测的要求。
3.5 样品分析
采用方法对上海及周边城市随机采集的不同品牌7类106个畜禽配合饲料样品中的FB1、FB2含量进行测定，结果如图3。伏马毒素检出率为98.11%，在所有检测样品中，FB1总含量在0～1 mg/kg之间有66个，占62.26%； 含量在1 mg/kg 以上的有40个，占37.74%，最高含量达20.1 mg/kg； FB2含量基本在0～1 mg/kg。因此，本方法适合不同种类畜禽配合饲料中FB1、FB2样品的检测。
4 结 论
本实验用乙腈水（50∶50， V/V）作为提取剂，离心后，经MAX净化柱富集净化，以0.1%甲酸和甲醇为流动相分离，高效液相色谱串联质谱法对不同畜禽配合饲料样品中的FB1和FB2含量进行检测。结果表明，本方法前处理简单、重复性好、回收率和灵敏度高，适用于畜禽配合饲料中伏马毒素的准确定量，为动物饲料中伏马毒素的风险评估奠定基础。
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Abstract A method was developed for the determination of fumonisin B1 （FB1） and fumonisin B2 （FB2） in livestock and poultry formula feeds by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （LCMS/MS. After extracted by acetonitrilewater （50∶50， V/V） and purified with MAX solid phase extraction column， the fumonisins were separated by Thermo C18 （100 mm×2.1 mm， 5 μm） column with 0.1% formic acid in water and methanol as the mobile phase. Multiple reaction monitoring （MRM） was used to acquire mass spectrometric data under electrospray positive ionization mode （ESI+）. The results showed that the linear correlation coefficients （R2） of fumonisin FB1 and FB2 were all greater than 0.999 in the range of 1-500 μg/L. The limits of quantitation （LOQ） were 0.098 and 0.197 μg/L， and the limits of detection （LOD） were 0.328 and 0.656 μg/L， respectively. At different spiked levels， the recoveries of FB1 and FB2 were ranged from 89.7% to 95.1%， and the relative standard deviation （RSD） was ranged from 3.2% to 8.6%. Additionally， the detection rate reached 98.11% screening through the established method in the 106 livestock and poultry formula feeds collected from markets. This result indicates that the method is suitable for accurate quantitative analysis of FB1 and FB2 in different complicated livestock and poultry formula feeds.
Keywords Fumonisins； Anion exchange solid phase extraction column； High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Livestock and poultry formula feeds
（Received 9 September 2014； accepted 5 January 2015）
This work was supported by the Key Project of Developing Agriculture through Science and Technology of Shanghai Municipal Agricultural Commission （No. 38 （2013）， 32 （2014））
