金花葵和葵花叶提取物的亚硝酸盐清除能力的初步研究
朴明淑+李美兰+葛冰洁+李一婷+姜成哲
【摘 要】为了研究金花葵和葵花叶提取物对亚硝酸盐的清除作用，本实验首先利用苯酚-硫酸法对金花葵提取物和葵花叶提取物的多糖含量进行测定，在波长为490nm处测定吸光度，实验表明，标准葡萄糖溶液在4-32μg/mL之间与NaNO2 的清除率呈现良好的线性关系。此方法简便，可操作性强，准确性高。在弱酸性条件下，亚硝酸根能使对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸CL-奈胺反应生成红色偶联化合物。利用此原理，可通过测定反应溶液的吸光度，比较两种提取物及抗坏血酸对亚硝酸盐的清除作用，实验结果显示：金花葵提取物和葵花叶提取物对NaNO2 都有一定的清除作用，清除作用：抗坏血酸>金花葵提取物>葵花叶提取物。
【Abstract】In order to study the nitrite scavenging capacity of the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves， this test firstly uses phenol-sulfuric acid method measure the content of polysaccharide in the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves， and measure the absorbancy at a wavelength of 490 nm， the test shows that， the standard glucose solution showed a good linear relationship with the clearance rate of NaNO2 between the 4 uglml to 32 ug/mL. This method is simple， easy to operate and high accuracy. In the weak acid condition， the nitrite can make the amino benzene sulfonic acid re-nitriding， and then react with the hydrochloric acid alpha amine to form the red coupling compound. According to this principle， through measurement of absorbance in reaction solution， we can compare the scavenging effects of these two exacts and ascorbic acid on nitrite. The experimental results show that the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves had scavenging effect on NaNO2， the scavenging effect of ascorbic acid is bigger than extracts of abelmoschus manihot and bigger than extracts of sunflower leaves.
【关键词】金花葵；葵花叶；多糖含量；NaNO2清除率
【Keywords】abelmoschus manihot； sunflower leaves； polysaccharide content； NaNO2 clearance rate
【中图分类号】TQ460.1 【文献标志码】A 【文章编号】1673-1069（2017）09-0191-02
1 引言
金花葵（Aurea helianthu），又名菜芙蓉，也称野芙蓉。金花葵具有良好的清热解毒、镇痛消炎、降血脂、免疫调节、抑制肿瘤细胞、抗氧化、抗衰老等作用，具备很强的药用价值。
2 实验目的
本实验使用的葵花叶提取物是来自于向日葵的葵花叶提取物，向日葵是菊科向日葵属的一年生草本植物，向日葵的叶分为真叶和子叶。茎下部分叶片在开花前制造养分，主要供给根部生长，到开花时其功能基本结束。中上部叶片制造的养分主要供给花盘促使种子形成，葵花叶中含有多糖及多种微量元素，营养丰富，利用价值很高。[1]
维生素C，英文名Vitamin C，又称L-抗坏血酸，是多数生物的必需营养素。抗坏血酸在多数生物体内可以借助新陈代谢制造而来，人类例外。在生物体内，抗坏血酸是一种抗氧化剂，其作用是保护机体免于自由基的伤害。维生素C有两种异构体，分别为L-型和D-型，只有L-型的異构体才具备一定的生理功能，还原型和氧化型都有生理活性[2]。维生素C的主要功能有：① 还原作用，维持巯基酶的活性、促进铁的吸收、促进四氢叶酸形成、促进抗体形成；②参与羟化反应，促进有机物或毒物羟化解毒、促进类固醇羟化、促进神经递质（5-羟色胺及去甲肾上腺素）合成；③其他功能：解毒、预防癌症、清除自由基。[3]
3 实验过程
金花葵提取物和葵花叶提取物含有丰富的多糖成分，由目前研究证明，多糖对NaNO2具有一定的清除作用，亚硝酸钠是一种食品添加剂，主要用于腌制肉食类食品，其可以保持食品鲜艳的色泽，抑制肉毒芽孢杆菌。但是，当亚硝酸盐进入人体后，会与磷脂、氨基酸等有机物质发生胺类反应，该反应可生成具有强烈致癌作用的亚硝胺。因此，亚硝酸钠可以说是一种潜在的致癌物质，那么对它的清除作用的研究也显得尤为重要[4-5]。苯酚-硫酸法[6-7]是常用的测定多糖含量的方法，本实验也是利用此方法来测定两种提取物中的多糖含量。此外，本实验也测定了金花葵提取物、葵花叶提取物中的多糖对NaNO2的清除作用，其测定原理是：多糖可将NaNO2氧化消耗，而未参与反应的亚硝酸根在弱酸性环境下，可使对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸α-奈胺偶合生成红色偶联化合物，通过测定该溶液吸光度，即可计算出多糖对NaNO2的清除率。
①实验材料。金花葵花，来自延吉郊区；葵花叶，采自龙井郊区。
②实验仪器。紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），电子分析天平（上海精天电子仪器有限公司）。
③实验试剂。NaNO2；柠檬酸钠缓冲液；0.4%对氨基苯磺酸；0.2%盐酸α-奈胺。
④实验方法。
金花葵提取液：配制成浓度为1mg/ml溶液备用。
葵花叶提取液：配制成20mg/ml的溶液，摇匀，静置。使用时，吸取上清液1ml，加入9ml蒸馏水稀释为2mg/ml的溶液。
抗坏血酸溶液：配制成500μg/ml抗坏血酸溶液备用，用时稀释成100μg/ml。
葡萄糖标准液配制成浓度为0.04mg/ml的葡萄糖标准溶液。
0.1%NaNO2溶液（用时稀释100倍）。
0.5mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH=3）： 配制成0.5mol/L柠檬酸钠溶液；配制成0.5mol/L柠檬酸溶液；按1.4mL：18.6mL的比例混合，摇匀，得到0.5mol/L柠檬酸钠缓冲液（PH=3）。
⑤标准曲线的制备。分别吸0.0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml， 1.0ml，1.2ml，1.4ml，1.6ml的0.04mg/ml的葡萄糖标准液，置于5ml的试管中，加水补足到2ml，加入0.2ml 6%苯酚，震荡混匀后，快速滴加浓硫酸1ml，静置5min后，置于沸水浴中加热15～20min，取出，迅速冷却至室温，于波长490nm处测吸光度。
⑥样品中多糖含量的测定。按照上述标准曲线制作过程，分别对金花葵提取物及葵花叶提取物中的多糖含量进行测定，通过测定样品液的吸光度，根据标准曲线计算出样品中多糖含量。
⑦NaNO2清除率的测定。提取物及抗坏血酸对NaNO2的清除率的测定：取6支试管，按下表加入试剂。加入试剂后，摇匀，置于37°C恒温水浴中加热1h后取出。从6支试管中分别吸取0.75ml溶液，置于洁净试管中，并加入1.5ml 0.4%对氨基苯磺酸、0.75ml 0.2%盐酸α-奈胺，摇匀，暗处放置15min后，在波长540nm处测定吸光度值。 NaNO2的清除率的计算公式： 清除率（%）=（A对照-A样品）/A对照x100%
4 實验结果
4.1 样品多糖含量的测定
按上述多糖含量测定方法，分别对金花葵提取物和葵花叶提取物同时测定三次吸光度，金花葵提取物吸光值分别为0.126，0.123，0.125，葵花叶提取物的吸光值分别为0.117，0.118，0.114。根据计算得，金花葵提取物中多糖的平均含量为14.2%，葵花叶提取物中多糖的平均含量为13.3%。
4.2 标准曲线回归方程的建立
用紫外分光光度计在波长为490nm处测定1.2.3中各反应后溶液吸光度，试管1为对照组，得到线性回归方程为：Y=1.575X+0.0115，R2=0.9881，说明葡萄糖在0.004mg/ml-0.032mg/ml范围内很好地符合朗白-比尔定律。
4.3 金花葵提取物溶液对NaNO2的清除作用
第一，根据吸光度计算样品溶液对NaNO2的清除作用，在0.2～1.0mg/ml范围内，金花葵提取物对NaNO2有一定的清除作用，且清除率随着浓度的增加而增大。样品浓度与清除率存在良好的线性关系，计算出其50%抑制浓度IC50=0.71mg/ml。第二， 葵花叶提取物溶液对NaNO2的清除作用。根据吸光度计算样品溶液对对NaNO2的清除作用，在0.4～2.0mg/ml范围内，葵花叶提取物对NaNO2有一定的清除作用，且清除率随着浓度的增加而增大。样品浓度与清除率存在良好的线性关系，计算出其50%抑制浓度IC50=1.5mg/ml。第三， 抗坏血酸对NaNO2的清除作用。根据吸光度计算样品溶液对NaNO2的清除作用，在10～100μg/ml范围内，抗坏血酸对NaNO2有一定的清除作用，且清除率随着浓度的增加而增大。样品浓度与清除率存在良好的线性关系，计算出其50%抑制浓度IC50=0.053mg/ml。
5 结论
通过实验测出金花葵提取物中多糖含量占14.2%，葵花叶提取物中的占13.3%。此外，金花葵提取物、葵花叶提取物和抗坏血酸都对NaNO2具有一定的清除作用，三者IC50分别为0.71mg/ml、1.5mg/ml、0.053mg/ml，即对NaNO2的清除作用：抗坏血酸>金花葵提取物>葵花叶提取物。
【参考文献】
【1】索金玲.向日葵花盘中有效化学成分分析及抗氧化性测定[D]. 乌鲁木齐：新疆大学，2013.
【2】汪东风.食品化学[J].北京：化学工业出版社，2009（10）：123-125.
【3】葛可佑.公共营养师 基础知识[M].北京：中国劳动社会保障出版社，2013.
【4】丁晓雯，刘春红.食品安全学[M].北京：中国农业出版社，2011.
【5】刘宁，沈明浩.食品毒理学[M].北京：中国轻工业出版社，2007.
【6】余晓雷，张可，郑旭霞.芦荟中多糖含量测定方法的探讨[J].营养学报，2003（7）：149-152.
【7】聂国朝.中药木瓜多糖的提取分离及含量测定[J].微量元素与健康研究，2003（5）：30-38.
【摘 要】为了研究金花葵和葵花叶提取物对亚硝酸盐的清除作用，本实验首先利用苯酚-硫酸法对金花葵提取物和葵花叶提取物的多糖含量进行测定，在波长为490nm处测定吸光度，实验表明，标准葡萄糖溶液在4-32μg/mL之间与NaNO2 的清除率呈现良好的线性关系。此方法简便，可操作性强，准确性高。在弱酸性条件下，亚硝酸根能使对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸CL-奈胺反应生成红色偶联化合物。利用此原理，可通过测定反应溶液的吸光度，比较两种提取物及抗坏血酸对亚硝酸盐的清除作用，实验结果显示：金花葵提取物和葵花叶提取物对NaNO2 都有一定的清除作用，清除作用：抗坏血酸>金花葵提取物>葵花叶提取物。
【Abstract】In order to study the nitrite scavenging capacity of the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves， this test firstly uses phenol-sulfuric acid method measure the content of polysaccharide in the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves， and measure the absorbancy at a wavelength of 490 nm， the test shows that， the standard glucose solution showed a good linear relationship with the clearance rate of NaNO2 between the 4 uglml to 32 ug/mL. This method is simple， easy to operate and high accuracy. In the weak acid condition， the nitrite can make the amino benzene sulfonic acid re-nitriding， and then react with the hydrochloric acid alpha amine to form the red coupling compound. According to this principle， through measurement of absorbance in reaction solution， we can compare the scavenging effects of these two exacts and ascorbic acid on nitrite. The experimental results show that the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves had scavenging effect on NaNO2， the scavenging effect of ascorbic acid is bigger than extracts of abelmoschus manihot and bigger than extracts of sunflower leaves.
【关键词】金花葵；葵花叶；多糖含量；NaNO2清除率
【Keywords】abelmoschus manihot； sunflower leaves； polysaccharide content； NaNO2 clearance rate
【中图分类号】TQ460.1 【文献标志码】A 【文章编号】1673-1069（2017）09-0191-02
1 引言
金花葵（Aurea helianthu），又名菜芙蓉，也称野芙蓉。金花葵具有良好的清热解毒、镇痛消炎、降血脂、免疫调节、抑制肿瘤细胞、抗氧化、抗衰老等作用，具备很强的药用价值。
2 实验目的
本实验使用的葵花叶提取物是来自于向日葵的葵花叶提取物，向日葵是菊科向日葵属的一年生草本植物，向日葵的叶分为真叶和子叶。茎下部分叶片在开花前制造养分，主要供给根部生长，到开花时其功能基本结束。中上部叶片制造的养分主要供给花盘促使种子形成，葵花叶中含有多糖及多种微量元素，营养丰富，利用价值很高。[1]
维生素C，英文名Vitamin C，又称L-抗坏血酸，是多数生物的必需营养素。抗坏血酸在多数生物体内可以借助新陈代谢制造而来，人类例外。在生物体内，抗坏血酸是一种抗氧化剂，其作用是保护机体免于自由基的伤害。维生素C有两种异构体，分别为L-型和D-型，只有L-型的異构体才具备一定的生理功能，还原型和氧化型都有生理活性[2]。维生素C的主要功能有：① 还原作用，维持巯基酶的活性、促进铁的吸收、促进四氢叶酸形成、促进抗体形成；②参与羟化反应，促进有机物或毒物羟化解毒、促进类固醇羟化、促进神经递质（5-羟色胺及去甲肾上腺素）合成；③其他功能：解毒、预防癌症、清除自由基。[3]
3 实验过程
金花葵提取物和葵花叶提取物含有丰富的多糖成分，由目前研究证明，多糖对NaNO2具有一定的清除作用，亚硝酸钠是一种食品添加剂，主要用于腌制肉食类食品，其可以保持食品鲜艳的色泽，抑制肉毒芽孢杆菌。但是，当亚硝酸盐进入人体后，会与磷脂、氨基酸等有机物质发生胺类反应，该反应可生成具有强烈致癌作用的亚硝胺。因此，亚硝酸钠可以说是一种潜在的致癌物质，那么对它的清除作用的研究也显得尤为重要[4-5]。苯酚-硫酸法[6-7]是常用的测定多糖含量的方法，本实验也是利用此方法来测定两种提取物中的多糖含量。此外，本实验也测定了金花葵提取物、葵花叶提取物中的多糖对NaNO2的清除作用，其测定原理是：多糖可将NaNO2氧化消耗，而未参与反应的亚硝酸根在弱酸性环境下，可使对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸α-奈胺偶合生成红色偶联化合物，通过测定该溶液吸光度，即可计算出多糖对NaNO2的清除率。
①实验材料。金花葵花，来自延吉郊区；葵花叶，采自龙井郊区。
②实验仪器。紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），电子分析天平（上海精天电子仪器有限公司）。
③实验试剂。NaNO2；柠檬酸钠缓冲液；0.4%对氨基苯磺酸；0.2%盐酸α-奈胺。
④实验方法。
金花葵提取液：配制成浓度为1mg/ml溶液备用。
葵花叶提取液：配制成20mg/ml的溶液，摇匀，静置。使用时，吸取上清液1ml，加入9ml蒸馏水稀释为2mg/ml的溶液。
抗坏血酸溶液：配制成500μg/ml抗坏血酸溶液备用，用时稀释成100μg/ml。
葡萄糖标准液配制成浓度为0.04mg/ml的葡萄糖标准溶液。
0.1%NaNO2溶液（用时稀释100倍）。
0.5mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH=3）： 配制成0.5mol/L柠檬酸钠溶液；配制成0.5mol/L柠檬酸溶液；按1.4mL：18.6mL的比例混合，摇匀，得到0.5mol/L柠檬酸钠缓冲液（PH=3）。
⑤标准曲线的制备。分别吸0.0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml， 1.0ml，1.2ml，1.4ml，1.6ml的0.04mg/ml的葡萄糖标准液，置于5ml的试管中，加水补足到2ml，加入0.2ml 6%苯酚，震荡混匀后，快速滴加浓硫酸1ml，静置5min后，置于沸水浴中加热15～20min，取出，迅速冷却至室温，于波长490nm处测吸光度。
⑥样品中多糖含量的测定。按照上述标准曲线制作过程，分别对金花葵提取物及葵花叶提取物中的多糖含量进行测定，通过测定样品液的吸光度，根据标准曲线计算出样品中多糖含量。
⑦NaNO2清除率的测定。提取物及抗坏血酸对NaNO2的清除率的测定：取6支试管，按下表加入试剂。加入试剂后，摇匀，置于37°C恒温水浴中加热1h后取出。从6支试管中分别吸取0.75ml溶液，置于洁净试管中，并加入1.5ml 0.4%对氨基苯磺酸、0.75ml 0.2%盐酸α-奈胺，摇匀，暗处放置15min后，在波长540nm处测定吸光度值。 NaNO2的清除率的计算公式： 清除率（%）=（A对照-A样品）/A对照x100%
4 實验结果
4.1 样品多糖含量的测定
按上述多糖含量测定方法，分别对金花葵提取物和葵花叶提取物同时测定三次吸光度，金花葵提取物吸光值分别为0.126，0.123，0.125，葵花叶提取物的吸光值分别为0.117，0.118，0.114。根据计算得，金花葵提取物中多糖的平均含量为14.2%，葵花叶提取物中多糖的平均含量为13.3%。
4.2 标准曲线回归方程的建立
用紫外分光光度计在波长为490nm处测定1.2.3中各反应后溶液吸光度，试管1为对照组，得到线性回归方程为：Y=1.575X+0.0115，R2=0.9881，说明葡萄糖在0.004mg/ml-0.032mg/ml范围内很好地符合朗白-比尔定律。
4.3 金花葵提取物溶液对NaNO2的清除作用
第一，根据吸光度计算样品溶液对NaNO2的清除作用，在0.2～1.0mg/ml范围内，金花葵提取物对NaNO2有一定的清除作用，且清除率随着浓度的增加而增大。样品浓度与清除率存在良好的线性关系，计算出其50%抑制浓度IC50=0.71mg/ml。第二， 葵花叶提取物溶液对NaNO2的清除作用。根据吸光度计算样品溶液对对NaNO2的清除作用，在0.4～2.0mg/ml范围内，葵花叶提取物对NaNO2有一定的清除作用，且清除率随着浓度的增加而增大。样品浓度与清除率存在良好的线性关系，计算出其50%抑制浓度IC50=1.5mg/ml。第三， 抗坏血酸对NaNO2的清除作用。根据吸光度计算样品溶液对NaNO2的清除作用，在10～100μg/ml范围内，抗坏血酸对NaNO2有一定的清除作用，且清除率随着浓度的增加而增大。样品浓度与清除率存在良好的线性关系，计算出其50%抑制浓度IC50=0.053mg/ml。
5 结论
通过实验测出金花葵提取物中多糖含量占14.2%，葵花叶提取物中的占13.3%。此外，金花葵提取物、葵花叶提取物和抗坏血酸都对NaNO2具有一定的清除作用，三者IC50分别为0.71mg/ml、1.5mg/ml、0.053mg/ml，即对NaNO2的清除作用：抗坏血酸>金花葵提取物>葵花叶提取物。
【参考文献】
【1】索金玲.向日葵花盘中有效化学成分分析及抗氧化性测定[D]. 乌鲁木齐：新疆大学，2013.
【2】汪东风.食品化学[J].北京：化学工业出版社，2009（10）：123-125.
【3】葛可佑.公共营养师 基础知识[M].北京：中国劳动社会保障出版社，2013.
【4】丁晓雯，刘春红.食品安全学[M].北京：中国农业出版社，2011.
【5】刘宁，沈明浩.食品毒理学[M].北京：中国轻工业出版社，2007.
【6】余晓雷，张可，郑旭霞.芦荟中多糖含量测定方法的探讨[J].营养学报，2003（7）：149-152.
【7】聂国朝.中药木瓜多糖的提取分离及含量测定[J].微量元素与健康研究，2003（5）：30-38.
