二氧化硅氧化石墨烯复合物固相萃取高效液相色谱法检测植物油中黄曲霉毒素B1、B2
王恒玲 喻理 李培武 李敏 张奇 张文
摘要以二氧化硅氧化石墨烯复合物为固相萃取材料， 建立了植物油中黄曲霉毒素B1、B2的高效液相色谱（HPLC）检测方法。优化的条件为：复合材料的最佳用量为0.15 g， 最佳萃取时间20 min， 洗脱溶剂为乙腈， 洗脱次数为2次。结果表明， 在优化条件下， 建立的二氧化硅氧化石墨烯复合物固相萃取高效液相色谱法对黄曲霉毒素B1、B2的检出限分别为0.17 和0.05 μg/L。将本方法应用于植物油实际样品的检测中， 加标回收率在81.4%～105.3%之间， 相对标准偏差为1.3%～8.6%。
关键词二氧化硅氧化石墨烯复合物； 固相萃取； 黄曲霉毒素； 植物油； 高效液相色谱
1引言
黄曲霉毒素是（Aflatoxin， AFT）由真菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的一类结构相似的有毒次生代谢物， 具有极强的致癌性、致畸性和致突变性＼[1，2＼]。已经鉴定的黄曲霉毒素有 20 多种， 常见的有 AFB1， AFB2， AFG1 和 AFG2。黄曲霉毒素作为目前发现的致癌性最强的物质， 早在1993年就被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物， 对公众健康具有较大危害＼[3＼]。全世界每年约有 25% 的食物可能受到黄曲霉毒素的污染， 尤其用于食用植物油生产的主要原料花生、玉米、大豆等， 在生产、加工、运输、贮藏等各环节均易受到黄曲霉菌侵染＼[4.5＼]。欧盟规定花生及其制品中黄曲霉毒素（B1， B2， G1和G2）总量的最大允许水平为4 μg/kg， 黄曲霉毒素 B1 不得超过2 μg/kg。美国对花生及其制品中黄曲霉毒素的最高限量为20 μg/kg， 日本规定其最高限量为10 μg/kg＼[6，7＼]。
食用植物油是我国重要的消费品和出口产品， 由于世界发达国家和地区不断降低黄曲霉毒素残留限量， 我国植物油出口存在隐忧。 食用植物油引发的黄曲霉毒素中毒事件屡见报道， 而相关的植物油中黄曲霉毒素检测研究却非常有限。因此， 研究建立食用植物油中黄曲霉毒素残留的检测方法具有重要意义。
目前， 植物油中黄曲霉毒素的确证性检测方法主要有免疫亲和柱净化高效液相色谱法、荧光分光光度计法、免疫磁珠净化高效液相色谱法、凝胶渗透色谱高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法等， 这些方法虽然具有较高的灵敏度和稳定性， 但是其前处理操作复杂， 耗时， 需要大量的有机溶剂， 且某些方法还需要高灵敏度的抗体； 免疫磁珠萃取需要外加磁场辅助分离＼[8～13＼]。鉴于以上方法的不足， 近年来探索一种新型的固相萃取材料成为检测AFTS的趋势。石墨烯是以SP2杂化轨道组成六角型的呈蜂巢晶格形状二维新型纳米材料＼[14＼]。由于石墨烯具有高比表面积， 能够与芳香化合物形成ππ共轭， 因此石墨烯可以作为优越的吸附材料应用于样品的前处理研究＼[15～17＼]。石墨烯经过处理可获得表面有羧基、羟基等官能团的氧化石墨烯（Graphene oxide）， 氧化石墨烯表面上官能团与不同试剂反应得到功能石墨烯， 即可用于药物、环境污染物、生物分子的前处理研究＼[18～21＼]。
本研究利用缩合化学反应将含羧基的氧化石墨烯材料与含有氨基的二氧化硅微球偶联合成新型复合材料二氧化硅氧化石墨烯复合物（GOSiO2）作为固相萃取剂， 利用在线柱后衍生高效液相色谱法定量检测黄曲霉毒素B1、B2。本方法将此材料中氧化石墨烯的良好吸附能力与固相材料二氧化硅相结合， 只需低速离心即达到分离净化的目的， 且可以快速富集提取液中的黄曲霉毒素， 具有简单、萃取效率高、快速等优点， 具有很好的实际应用价值。
2实验部分
2.1仪器与试剂
高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）， 配荧光检测器；Kromasil 液相色谱柱（C18， 150 mm × 4.6 mm， 5 μm， 瑞典 Akzo Nobel公司）；BF2000 氮吹仪（八方世纪有限公司）；离心机（美国Thermo公司）；真空冷冻干燥系统（英国 Savant 公司）；超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；HQ60漩涡振荡器（北京同正生物技术发展公司）；CPA224S电子天平（德国 Sartorius 公司）。
黄曲霉毒素B1、B2标准溶液（美国Sigma 公司）；N羟基琥珀酰亚胺（NHS）、碳二亚胺（EDC）， 美国Aldrich 公司；二氧化硅微球（武汉华科微科科技有限责任公司）；乙腈、甲醇、丙酮（分析纯， 天津科密欧试剂公司）；氧化石墨烯为本实验室自制＼[22＼]；所用水均来自MilliQ纯水系统（美国 Millpore 公司）。所用试剂均为分析纯或以上。
实验所用植物油样品购自武汉某市场。
2.2实验方法
2.2.1液相色谱条件C18 Kromasil色谱柱（150 mm × 4.6 mm， 5 μm）；进样量10 μL；荧光检测器检测（λ激发=254.4 nm， λ发射 = 360.10 nm）；柱温30 ℃；流动相为45%（V/V）甲醇， 流速0.8 mL/min。
2.2.2GOSiO2材料的合成根据文献＼[18＼]， 采用Hummers方法，由石墨粉制备氧化石墨烯。制备的氧化石墨烯洗至中性，于100 r/min透析7天，用差量法测定其浓度。硅胶微球用0.05 mol/L HCl、水、甲醇、水交替连续冲洗， 洗去游离的NH2基。取160 mL氧化石墨烯转移至250 mL 干净烧杯， 并进行磁力温和搅拌；边搅拌边加入0.08 g EDC， 20 min 后加入0.04 g NHS， 继续搅拌1 h后加入2 g微球， 室温下继续搅拌24 h。合成的材料分别经纯水和无水乙醇冲洗， 真空冻干备用。
2.2.3植物油提取步骤按照GB/T189792003进行植物油中黄曲霉毒素的提取， 准确称取5 g植物油于50 mL离心管中， 加入25 mL 70%（V/V）甲醇， 超声提取10 min， 定量滤纸过滤， 准确移取15 mL滤液并加入30 mL纯水稀释， 根据加标量调整最终稀释至甲醇浓度为12.5%， 过玻璃纤维滤膜至澄清， 待用。
2.2.4固相萃取步骤将初提取的样品经GOSiO2材料萃取富集后， 洗脱重悬， 进行高效液相色谱分析。萃取步骤如下：取0.15 g GOSiO2复合物加入到2 mL离心管，准确移取1 mL上述提取液于离心管， 室温高速涡旋1 min， 放置20 min， 使提取液中的黄曲霉毒素完全被吸附。洗脱步骤如下：将混合溶液4500 r/min离心5 min， 弃上清液。加入1 mL 洗脱溶剂乙腈涡旋1 min，将吸附在GOSiO2材料上的黄曲霉毒素洗脱下来， 4500 r/min离心5 min， 将洗脱液收集于试管中， 重复上述步骤2次。将洗脱液氮吹至近干， 加1 mL甲醇重悬， 进行在线柱后光化学衍生高效液相色谱分析。
3结果与讨论
3.1GOSiO2复合材料固相萃取条件优化
3.1.1材料用量对回收率的影响用200 mL 5 μg/L的黄曲霉毒素B1和B2的12.5%甲醇溶液， 分别研究0.10， 0.15和0.20 g复合材料用量对黄曲霉毒素B1， B2的回收率的影响。从表1可知， 复合材料用量从0.10 g增加到0.15 g时， 黄曲霉毒素的回收率均明显增大， 当用量继续增加至0.20 g时， 回收率没有明显增加， 说明复合材料用量为0.15 g时， 黄曲霉毒素已经被吸附完全， 因此选择0.15 g作为复合材料的最佳用量， 可以获得最佳的萃取效果， 同时节省复合材料的使用量， 节约成本。
3.1.2萃取时间对回收率的影响萃取时间严重影响材料的萃取效率， 从而影响方法的回收率＼[23，24＼]。本方法的萃取时间是指提取液与吸附材料涡旋混合后室温静置的时间。一般在分析物达到吸附平衡之前， 随着吸附时间的延长， 萃取效率会提高， 当达到萃取动态平衡后萃取效率将不再变化。用200 mL 5 μg/L 的黄曲霉毒素B1、B2的12.5%甲醇溶液考察萃取时间（5， 10， 20和30 min）对萃取效率的影响。
3.1.3溶剂对回收率的影响在优化萃取的条件下， 用200 mL 5 μg/L的黄曲霉毒素B1、B2的12.5%甲醇溶液研究甲醇、乙腈和丙酮3种有机溶剂的洗脱能力。结果表明， 用乙腈洗脱时， 黄曲霉毒素B1、B2的回收率分别为89.1%和84.3%。丙酮洗脱时， 回收率分别为84.0%和85.4%。甲醇洗脱时， 回收率为75.86%和72.30%。即黄曲霉毒素的加标回收率是乙腈>丙酮>甲醇。本实验选择乙腈作为复合材料的洗脱溶剂。
3.1.4洗脱次数对回收率的影响洗脱次数的优化目的是在尽量减少有机溶剂使用的前提下， 提高黄曲霉毒素的回收率。
次洗脱黄曲霉毒素的回收率。从表2可知， 增加洗脱溶剂的洗脱次数可以提高黄曲霉毒素的回收率， 但是3次洗脱比2次洗脱回收率的提高的很少， 因此在保证黄曲霉毒素的回收率的同时， 减少有机溶剂使用， 减少对环境和操作人员安全危害的前提下， 黄曲霉毒素的洗脱次数选择2次。
3.2方法评价
在上述优化条件下， 配制系列浓度梯度的黄曲霉毒素B1和B2混合标准溶液， 经GOSiO2材料萃取富集后， 经高效液相色谱分析， 平行测定5次， 连续5天进行测定， 分别得到黄曲霉毒素B1、B2的工作曲线（表3）。结果表明， 本方法在0.5～50 μg/L浓度范围内黄曲霉毒素B1、B2均具有良好的线性， 其相关系数为0.9996和0.9993。
以信噪比S/N=3为本方法的检出限， 黄曲霉毒素B1和B2的检出限分别为0.17和0.05 μg/kg。3.3实际样品的检测
为了验证方法的准确性与实用性， 用优化方法， 进行实际样品的加标回收试验。在样品中分别添加黄曲霉毒素B1和B2标准品0.5， 1.0和2.0 μg/kg， 重复3次（表4）。结果表明， 黄曲霉毒素B1， B2的加标回收率在81.4%～105.3%之间， 相对标准偏差在1.3%～8.6%之间。因此， 本方法回收率较好， 精密度较高， 可达到黄曲霉毒素的检测要求。实际样品的黄曲霉毒素的液相色谱图见图2。
分析结果表明， 在优化实验条件下， 在0.5～50 μg/L浓度范围内， 黄曲霉毒素B1、B2的浓度与峰面积具有良好的线性关系， 相关系数分别为0.9996和0.9993， 检出限分别为0.17和0.05 μg/L。实际样品的加标回收率在81.4%～105.3%之间， 相对标准偏差为1.3%～8.6%， 表明本方法具有良好的可靠性和稳定性， 可以用于实际植物油中黄曲霉毒素B1、B2的检测。
References
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AbstractSilica dioxide bound graphene oxide（GOSiO2） was applied as an effective adsorbent for determination and quantiflcation of aflatoxin B1， B2 in edible oil by HPLC. The optimized conditions were GOSiO2 0.15 g， extraction time 20 min， elution reagent acetonitrile， elution cycles two times. Results showed under the optimum conditions， the detection limits of aflatoxin B1， B2 were 0.17 and 0.05 μg/L， respectively. The method was successfully applied to the detection of the actual edible oil， the spiked recoveries of aflatoxin B1 and B2 were 81.4%-105.3% and the relative standard deviations were 1.3%-8.6%.
KeywordsSilica dioxide bound graphene oxide； Solid phase extraction； Aflatoxins； Edible oil； High performance liquid chromatography
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KeywordsSilica dioxide bound graphene oxide； Solid phase extraction； Aflatoxins； Edible oil； High performance liquid chromatography
摘要以二氧化硅氧化石墨烯复合物为固相萃取材料， 建立了植物油中黄曲霉毒素B1、B2的高效液相色谱（HPLC）检测方法。优化的条件为：复合材料的最佳用量为0.15 g， 最佳萃取时间20 min， 洗脱溶剂为乙腈， 洗脱次数为2次。结果表明， 在优化条件下， 建立的二氧化硅氧化石墨烯复合物固相萃取高效液相色谱法对黄曲霉毒素B1、B2的检出限分别为0.17 和0.05 μg/L。将本方法应用于植物油实际样品的检测中， 加标回收率在81.4%～105.3%之间， 相对标准偏差为1.3%～8.6%。
关键词二氧化硅氧化石墨烯复合物； 固相萃取； 黄曲霉毒素； 植物油； 高效液相色谱
1引言
黄曲霉毒素是（Aflatoxin， AFT）由真菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的一类结构相似的有毒次生代谢物， 具有极强的致癌性、致畸性和致突变性＼[1，2＼]。已经鉴定的黄曲霉毒素有 20 多种， 常见的有 AFB1， AFB2， AFG1 和 AFG2。黄曲霉毒素作为目前发现的致癌性最强的物质， 早在1993年就被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物， 对公众健康具有较大危害＼[3＼]。全世界每年约有 25% 的食物可能受到黄曲霉毒素的污染， 尤其用于食用植物油生产的主要原料花生、玉米、大豆等， 在生产、加工、运输、贮藏等各环节均易受到黄曲霉菌侵染＼[4.5＼]。欧盟规定花生及其制品中黄曲霉毒素（B1， B2， G1和G2）总量的最大允许水平为4 μg/kg， 黄曲霉毒素 B1 不得超过2 μg/kg。美国对花生及其制品中黄曲霉毒素的最高限量为20 μg/kg， 日本规定其最高限量为10 μg/kg＼[6，7＼]。
食用植物油是我国重要的消费品和出口产品， 由于世界发达国家和地区不断降低黄曲霉毒素残留限量， 我国植物油出口存在隐忧。 食用植物油引发的黄曲霉毒素中毒事件屡见报道， 而相关的植物油中黄曲霉毒素检测研究却非常有限。因此， 研究建立食用植物油中黄曲霉毒素残留的检测方法具有重要意义。
目前， 植物油中黄曲霉毒素的确证性检测方法主要有免疫亲和柱净化高效液相色谱法、荧光分光光度计法、免疫磁珠净化高效液相色谱法、凝胶渗透色谱高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法等， 这些方法虽然具有较高的灵敏度和稳定性， 但是其前处理操作复杂， 耗时， 需要大量的有机溶剂， 且某些方法还需要高灵敏度的抗体； 免疫磁珠萃取需要外加磁场辅助分离＼[8～13＼]。鉴于以上方法的不足， 近年来探索一种新型的固相萃取材料成为检测AFTS的趋势。石墨烯是以SP2杂化轨道组成六角型的呈蜂巢晶格形状二维新型纳米材料＼[14＼]。由于石墨烯具有高比表面积， 能够与芳香化合物形成ππ共轭， 因此石墨烯可以作为优越的吸附材料应用于样品的前处理研究＼[15～17＼]。石墨烯经过处理可获得表面有羧基、羟基等官能团的氧化石墨烯（Graphene oxide）， 氧化石墨烯表面上官能团与不同试剂反应得到功能石墨烯， 即可用于药物、环境污染物、生物分子的前处理研究＼[18～21＼]。
本研究利用缩合化学反应将含羧基的氧化石墨烯材料与含有氨基的二氧化硅微球偶联合成新型复合材料二氧化硅氧化石墨烯复合物（GOSiO2）作为固相萃取剂， 利用在线柱后衍生高效液相色谱法定量检测黄曲霉毒素B1、B2。本方法将此材料中氧化石墨烯的良好吸附能力与固相材料二氧化硅相结合， 只需低速离心即达到分离净化的目的， 且可以快速富集提取液中的黄曲霉毒素， 具有简单、萃取效率高、快速等优点， 具有很好的实际应用价值。
2实验部分
2.1仪器与试剂
高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）， 配荧光检测器；Kromasil 液相色谱柱（C18， 150 mm × 4.6 mm， 5 μm， 瑞典 Akzo Nobel公司）；BF2000 氮吹仪（八方世纪有限公司）；离心机（美国Thermo公司）；真空冷冻干燥系统（英国 Savant 公司）；超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；HQ60漩涡振荡器（北京同正生物技术发展公司）；CPA224S电子天平（德国 Sartorius 公司）。
黄曲霉毒素B1、B2标准溶液（美国Sigma 公司）；N羟基琥珀酰亚胺（NHS）、碳二亚胺（EDC）， 美国Aldrich 公司；二氧化硅微球（武汉华科微科科技有限责任公司）；乙腈、甲醇、丙酮（分析纯， 天津科密欧试剂公司）；氧化石墨烯为本实验室自制＼[22＼]；所用水均来自MilliQ纯水系统（美国 Millpore 公司）。所用试剂均为分析纯或以上。
实验所用植物油样品购自武汉某市场。
2.2实验方法
2.2.1液相色谱条件C18 Kromasil色谱柱（150 mm × 4.6 mm， 5 μm）；进样量10 μL；荧光检测器检测（λ激发=254.4 nm， λ发射 = 360.10 nm）；柱温30 ℃；流动相为45%（V/V）甲醇， 流速0.8 mL/min。
2.2.2GOSiO2材料的合成根据文献＼[18＼]， 采用Hummers方法，由石墨粉制备氧化石墨烯。制备的氧化石墨烯洗至中性，于100 r/min透析7天，用差量法测定其浓度。硅胶微球用0.05 mol/L HCl、水、甲醇、水交替连续冲洗， 洗去游离的NH2基。取160 mL氧化石墨烯转移至250 mL 干净烧杯， 并进行磁力温和搅拌；边搅拌边加入0.08 g EDC， 20 min 后加入0.04 g NHS， 继续搅拌1 h后加入2 g微球， 室温下继续搅拌24 h。合成的材料分别经纯水和无水乙醇冲洗， 真空冻干备用。
2.2.3植物油提取步骤按照GB/T189792003进行植物油中黄曲霉毒素的提取， 准确称取5 g植物油于50 mL离心管中， 加入25 mL 70%（V/V）甲醇， 超声提取10 min， 定量滤纸过滤， 准确移取15 mL滤液并加入30 mL纯水稀释， 根据加标量调整最终稀释至甲醇浓度为12.5%， 过玻璃纤维滤膜至澄清， 待用。
2.2.4固相萃取步骤将初提取的样品经GOSiO2材料萃取富集后， 洗脱重悬， 进行高效液相色谱分析。萃取步骤如下：取0.15 g GOSiO2复合物加入到2 mL离心管，准确移取1 mL上述提取液于离心管， 室温高速涡旋1 min， 放置20 min， 使提取液中的黄曲霉毒素完全被吸附。洗脱步骤如下：将混合溶液4500 r/min离心5 min， 弃上清液。加入1 mL 洗脱溶剂乙腈涡旋1 min，将吸附在GOSiO2材料上的黄曲霉毒素洗脱下来， 4500 r/min离心5 min， 将洗脱液收集于试管中， 重复上述步骤2次。将洗脱液氮吹至近干， 加1 mL甲醇重悬， 进行在线柱后光化学衍生高效液相色谱分析。
3结果与讨论
3.1GOSiO2复合材料固相萃取条件优化
3.1.1材料用量对回收率的影响用200 mL 5 μg/L的黄曲霉毒素B1和B2的12.5%甲醇溶液， 分别研究0.10， 0.15和0.20 g复合材料用量对黄曲霉毒素B1， B2的回收率的影响。从表1可知， 复合材料用量从0.10 g增加到0.15 g时， 黄曲霉毒素的回收率均明显增大， 当用量继续增加至0.20 g时， 回收率没有明显增加， 说明复合材料用量为0.15 g时， 黄曲霉毒素已经被吸附完全， 因此选择0.15 g作为复合材料的最佳用量， 可以获得最佳的萃取效果， 同时节省复合材料的使用量， 节约成本。
3.1.2萃取时间对回收率的影响萃取时间严重影响材料的萃取效率， 从而影响方法的回收率＼[23，24＼]。本方法的萃取时间是指提取液与吸附材料涡旋混合后室温静置的时间。一般在分析物达到吸附平衡之前， 随着吸附时间的延长， 萃取效率会提高， 当达到萃取动态平衡后萃取效率将不再变化。用200 mL 5 μg/L 的黄曲霉毒素B1、B2的12.5%甲醇溶液考察萃取时间（5， 10， 20和30 min）对萃取效率的影响。
3.1.3溶剂对回收率的影响在优化萃取的条件下， 用200 mL 5 μg/L的黄曲霉毒素B1、B2的12.5%甲醇溶液研究甲醇、乙腈和丙酮3种有机溶剂的洗脱能力。结果表明， 用乙腈洗脱时， 黄曲霉毒素B1、B2的回收率分别为89.1%和84.3%。丙酮洗脱时， 回收率分别为84.0%和85.4%。甲醇洗脱时， 回收率为75.86%和72.30%。即黄曲霉毒素的加标回收率是乙腈>丙酮>甲醇。本实验选择乙腈作为复合材料的洗脱溶剂。
3.1.4洗脱次数对回收率的影响洗脱次数的优化目的是在尽量减少有机溶剂使用的前提下， 提高黄曲霉毒素的回收率。
次洗脱黄曲霉毒素的回收率。从表2可知， 增加洗脱溶剂的洗脱次数可以提高黄曲霉毒素的回收率， 但是3次洗脱比2次洗脱回收率的提高的很少， 因此在保证黄曲霉毒素的回收率的同时， 减少有机溶剂使用， 减少对环境和操作人员安全危害的前提下， 黄曲霉毒素的洗脱次数选择2次。
3.2方法评价
在上述优化条件下， 配制系列浓度梯度的黄曲霉毒素B1和B2混合标准溶液， 经GOSiO2材料萃取富集后， 经高效液相色谱分析， 平行测定5次， 连续5天进行测定， 分别得到黄曲霉毒素B1、B2的工作曲线（表3）。结果表明， 本方法在0.5～50 μg/L浓度范围内黄曲霉毒素B1、B2均具有良好的线性， 其相关系数为0.9996和0.9993。
以信噪比S/N=3为本方法的检出限， 黄曲霉毒素B1和B2的检出限分别为0.17和0.05 μg/kg。3.3实际样品的检测
为了验证方法的准确性与实用性， 用优化方法， 进行实际样品的加标回收试验。在样品中分别添加黄曲霉毒素B1和B2标准品0.5， 1.0和2.0 μg/kg， 重复3次（表4）。结果表明， 黄曲霉毒素B1， B2的加标回收率在81.4%～105.3%之间， 相对标准偏差在1.3%～8.6%之间。因此， 本方法回收率较好， 精密度较高， 可达到黄曲霉毒素的检测要求。实际样品的黄曲霉毒素的液相色谱图见图2。
分析结果表明， 在优化实验条件下， 在0.5～50 μg/L浓度范围内， 黄曲霉毒素B1、B2的浓度与峰面积具有良好的线性关系， 相关系数分别为0.9996和0.9993， 检出限分别为0.17和0.05 μg/L。实际样品的加标回收率在81.4%～105.3%之间， 相对标准偏差为1.3%～8.6%， 表明本方法具有良好的可靠性和稳定性， 可以用于实际植物油中黄曲霉毒素B1、B2的检测。
References
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AbstractSilica dioxide bound graphene oxide（GOSiO2） was applied as an effective adsorbent for determination and quantiflcation of aflatoxin B1， B2 in edible oil by HPLC. The optimized conditions were GOSiO2 0.15 g， extraction time 20 min， elution reagent acetonitrile， elution cycles two times. Results showed under the optimum conditions， the detection limits of aflatoxin B1， B2 were 0.17 and 0.05 μg/L， respectively. The method was successfully applied to the detection of the actual edible oil， the spiked recoveries of aflatoxin B1 and B2 were 81.4%-105.3% and the relative standard deviations were 1.3%-8.6%.
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