四制香附调经止痛物质基础研究
赵晓娟 胡律江 郭慧玲
摘要：目的 探究建昌帮特色饮片四制香附调经止痛的物质基础。方法 采用系统溶剂提取法对香附进行分部位提取，从在体、离体和血液流变学三个层面对其活性成分进行测定，并采用NMR对其有效成分进行分析。结果 石油醚部位为香附调经止痛的有效部位，其有效成分有豆甾醇、胡萝卜苷、大黄素甲醚和十六烷酸。结论 本研究首次采用在体模型、离体模型和血液流变学指标三种方法同时评价建昌帮四制香附调经止痛效应，切入江西地方炮制品种，有利于江西传统炮制流派的传承与发展。
关键词：建昌帮;四制香附;调经止痛
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）09-0073-03
作为双子叶植物莎草科植物莎草（Cyperus rotundus L.）的干燥根茎，香附又名雷公头、香附子、雀头香，主产于我国河南、浙江、山东、湖南等地。现代药理研究表明，香附内含绿叶萜烯酮、考布松、香附醇、香附子烯、柠檬烯、果糖及葡萄糖等成分，具有抗菌、镇痛和抑制子宫收缩的作用，有“气病之总司，女科之主帅”之美称[1]，为妇科调经止痛的要药。现代常用香附治疗痛经及月经不调、胃肠功能紊乱症、胃痉挛疼痛及胃炎等[2]。痛经是妇科常见病，病因复杂，易反复，其高发病率直接影响了女性的健康、工作和生活质量，因此，人们对治疗痛经药物的关注度越来越高。本研究采用小鼠在体痛经模型、缩宫素所致大鼠离体子宫收缩模型和大鼠血液流变学影响三种方法结合使用评价江西建昌帮四制香附调经止痛效应，为其开发研究提供参考。
1 仪器与试剂
香附饮片（购于江西汇仁药业有限公司），BT25S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），缩宫素注射液（安徽丰原药业股份有限公司），布洛芬混悬液（扬州市三药制药有限公司），己烯雌酚，生理盐水乙醇，石油醚，乙酸乙酯，水饱和正丁醇，双蒸水，所用试剂均为分析纯
2 方法与结果
2.1 有效部位提取 采用系统溶剂提取法进行提取。将95%乙醇加入香附粗粉中回流3次，2h/次，回收得乙醇浸膏，再加水混悬，萃取液依次为石油醚、乙酸乙酯、水饱及正丁醇，再回收溶剂，作为石油醚、乙酸乙酯及正丁醇部位;将水加至药渣中煎煮3次，过滤和浓缩得水煎液，混合水层，浓缩至浸膏作为水提部位。另在圆底烧瓶加入香附饮片和适量水，以水蒸气蒸馏法提取挥发油部位。再以收率比例取适量乙醇浸膏、水煎液、挥发油混合，作为香附药材对照液。
2.2 有效成分药理效应研究
2.2.1 在体模型 取240只KM小鼠，体重18～22 g，雄性小鼠24只，雌性小鼠216只。阴性对照组为雄性小鼠。将216只雌性小鼠随机分为空白组、模型组（布洛芬混悬液）、阳性对照组及各供试组，每天灌胃小鼠己烯雌酚10 mg/kg，空白组灌胃20 mL/kg生理盐水，连续一周，各组动物禁食不禁水1d，第8 d灌胃给药1次，提取物20 mL/kg（约合生药量为7.5 g/kg），给药30 min后腹腔注射10 u/kg缩宫素，观察小鼠在注入后30 min内的扭体次数（见表1）。同时计算平均抑制率。
平均抑制率（%）= （对照组平均扭体数-给药组平均扭体数）/ 对照组平均扭体数×100%
表1 香附不同提取部位对小鼠在体痛经模型的影响
实验结果表明，相比于空白组，模型组小鼠扭体次数增加，证实造模成功。在同样药量下，石油醚部位平均抑制率67.25%，明显高于其它提取部位，为其治疗痛经的主要有效部位。乙酸乙酯部位和挥发油部位有减少小鼠扭体次数的趋势。
2.2.2 离体模型[3] 取KM未孕雌性大鼠，实验前灌胃10 mg/kg·d己烯雌酚，连续4d，在第5d取出大鼠子宫置于LokeS液（NaCl 9.2 g，Glucose 1.0 g，CaCl2 0.24 g，KCl 0.42 g，NaHCO3 0.15 g溶于1000 mL重蒸馏水）中清洗，从子宫颈端剪开，浴槽内固定器底部小钩上固定子宫颈端，张力换能器上连接卵巢端。置于恒温浴槽中，内含15 mL LokeS液，通入5% CO2+95% O2混合气体，温度为（37 ± 0.1）℃，pH =7.3。加0.3 g的负荷以调节螺母，平衡40 min，每10 min换1次营养液，0.05 u缩宫素在子宫收缩频率平稳后加入，作用15 min后再依次加入对照组、各供试组15 mg，其中对照组给药3%吐温-80 15 μL，记录给药后子宫张力，观察药物对缩宫素导致子宫痉挛性收缩的对抗作用，记录时间20 min，以营养液冲洗3次后观察下一次实验结果。记录给药前后子宫肌肉张力，抑制的百分率采用Chart4.0.1软件进行计算，以SPSS软件进行统计学分析处理，给药组均有一定程度抑制，且石油醚部位抑制作用最强。
2.2.3 血液流变学[4] 取健康雌性大鼠170只，随机分为17组，即阴性对照（等容生理盐水）、月月舒、各供试组。灌胃给药，每天1次，连续14 d。末次给药后30 min，采用20%乌拉坦麻醉大鼠，经腹主动脉取血4-5 mL，并快速加入混有肝素的抗凝管内，混匀后对血液流变学指标（全血黏度高切、全血黏度低切、全血还原黏度、红细胞聚集指数）进行测定。结果表明，模型组全血高、低切黏度显著增加，给药后全血黏度均有一定程度的降低，其中，石油醚部位改善作用最强。
2.3 有效成分的分离与鉴定 取石油醚浸膏适量，以柱层析用硅胶拌样装柱，以石油醚-丙酮梯度洗脱分离。分离得到4个化合物。经NMR检测鉴定其分别为豆甾醇（stigmasterol）、胡萝卜苷（daucosterol）、大黄素甲醚（physcion）、十六烷酸（hexadecanoic acid）。
3 讨论
痛经属于一种常见的妇科症状，可分为原发性痛经和继发性痛经，其中原发性痛经是指生殖器官无器质性病变者，其发生与月经期子宫内膜前列腺素（PG）含量的升高明显相关，继发性痛经则是指由盆腔器质性疾病所引起的痛经。主要证型包括气血两虚、肾气亏损、湿（痰）热瘀阻、癖热互结、寒凝血瘀及气滞血瘀等，常见治疗药物以活血化瘀、补虚等中药、甲芬那酸、氟芬那酸、布洛芬等前列腺素合成酶抑制剂及避孕药等为主。
作为一种常用中药，香附主要含有挥发油类成分，并含有黄酮类糖类、三萜类等其它化学成分。其有着广泛的生物学活性，能够治疗多种疾病，尤其在妇科疾病中有着广泛的应用。因此，继续深入研究香附的药效学物质基础，开发临床疗效确切、毒副作用小的新药很有意义。
中医理论认为，香附微甘、微苦、辛、平，归肝、脾、三焦经，具有调经止痛、理气宽中、疏肝解郁等作用。a-香附酮是香附的主要成分之一，具有抑制未孕大鼠离体子宫肌自发性收缩，同时抑制由缩宫素引起的离体子宫肌的收缩，对缩宫素所致的小鼠子宫激烈收缩进行抑制，且作用强度呈剂量依赖性。本研究证实了香附镇痛作用显著，可在减轻小鼠痛经疼痛症状的同时缓解缩宫素所致的小鼠子宫收缩。结果得到在同样药量下，石油醚部位平均抑制率67.25%，明显高于其它提取部位，证实了治疗痛经的主要有效部位为石油醚部位。另外，模型组全血高、低切黏度显著增加，给药后全血黏度均有一定程度的降低，其中，石油醚部位改善作用最强。表明香附具有一定的改善血流动力学指标作用，可有效改善血流，发挥活血化淤作用。同时，本研究采用NMR对其有效成分进行了测定，分离出了4中化合物分别为豆甾醇、胡萝卜苷、大黄素甲
醚和十六烷酸。证实了以上成分是香附发挥调经止痛的主要组成。
本研究首次采用在体模型、离体模型和血液流变学指标三种方法同时评价建昌帮四制香附调经止痛效应;切入江西地方炮制品种，有利于江西传统炮制流派的传承与发展。
参考文献：
[1]慈倩倩，李英霞，张文，等.香附的本草考证[J].四川中医，2010，28（4）：50-51.
[2]徐燕，李大祥，凌铁军，等.香附化学成分研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（11）：214-218.
[3]华永庆，洪敏，李璇，等.当归、芍药、香附及其配伍對离体小鼠子宫痛经模型的影响[J].浙江中医杂志，2003，38（1）：28-29.
[4]薛建欣，严永清，蒋莹.黄芪、归尾、香附、川芎、赤芍等配伍对“血瘀”大鼠血液流变学的影响[J].中国中药杂志，1994，19（2）：108-128.
（收稿日期：2018-05-31）
摘要：目的 探究建昌帮特色饮片四制香附调经止痛的物质基础。方法 采用系统溶剂提取法对香附进行分部位提取，从在体、离体和血液流变学三个层面对其活性成分进行测定，并采用NMR对其有效成分进行分析。结果 石油醚部位为香附调经止痛的有效部位，其有效成分有豆甾醇、胡萝卜苷、大黄素甲醚和十六烷酸。结论 本研究首次采用在体模型、离体模型和血液流变学指标三种方法同时评价建昌帮四制香附调经止痛效应，切入江西地方炮制品种，有利于江西传统炮制流派的传承与发展。
关键词：建昌帮;四制香附;调经止痛
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）09-0073-03
作为双子叶植物莎草科植物莎草（Cyperus rotundus L.）的干燥根茎，香附又名雷公头、香附子、雀头香，主产于我国河南、浙江、山东、湖南等地。现代药理研究表明，香附内含绿叶萜烯酮、考布松、香附醇、香附子烯、柠檬烯、果糖及葡萄糖等成分，具有抗菌、镇痛和抑制子宫收缩的作用，有“气病之总司，女科之主帅”之美称[1]，为妇科调经止痛的要药。现代常用香附治疗痛经及月经不调、胃肠功能紊乱症、胃痉挛疼痛及胃炎等[2]。痛经是妇科常见病，病因复杂，易反复，其高发病率直接影响了女性的健康、工作和生活质量，因此，人们对治疗痛经药物的关注度越来越高。本研究采用小鼠在体痛经模型、缩宫素所致大鼠离体子宫收缩模型和大鼠血液流变学影响三种方法结合使用评价江西建昌帮四制香附调经止痛效应，为其开发研究提供参考。
1 仪器与试剂
香附饮片（购于江西汇仁药业有限公司），BT25S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），缩宫素注射液（安徽丰原药业股份有限公司），布洛芬混悬液（扬州市三药制药有限公司），己烯雌酚，生理盐水乙醇，石油醚，乙酸乙酯，水饱和正丁醇，双蒸水，所用试剂均为分析纯
2 方法与结果
2.1 有效部位提取 采用系统溶剂提取法进行提取。将95%乙醇加入香附粗粉中回流3次，2h/次，回收得乙醇浸膏，再加水混悬，萃取液依次为石油醚、乙酸乙酯、水饱及正丁醇，再回收溶剂，作为石油醚、乙酸乙酯及正丁醇部位;将水加至药渣中煎煮3次，过滤和浓缩得水煎液，混合水层，浓缩至浸膏作为水提部位。另在圆底烧瓶加入香附饮片和适量水，以水蒸气蒸馏法提取挥发油部位。再以收率比例取适量乙醇浸膏、水煎液、挥发油混合，作为香附药材对照液。
2.2 有效成分药理效应研究
2.2.1 在体模型 取240只KM小鼠，体重18～22 g，雄性小鼠24只，雌性小鼠216只。阴性对照组为雄性小鼠。将216只雌性小鼠随机分为空白组、模型组（布洛芬混悬液）、阳性对照组及各供试组，每天灌胃小鼠己烯雌酚10 mg/kg，空白组灌胃20 mL/kg生理盐水，连续一周，各组动物禁食不禁水1d，第8 d灌胃给药1次，提取物20 mL/kg（约合生药量为7.5 g/kg），给药30 min后腹腔注射10 u/kg缩宫素，观察小鼠在注入后30 min内的扭体次数（见表1）。同时计算平均抑制率。
平均抑制率（%）= （对照组平均扭体数-给药组平均扭体数）/ 对照组平均扭体数×100%
表1 香附不同提取部位对小鼠在体痛经模型的影响
实验结果表明，相比于空白组，模型组小鼠扭体次数增加，证实造模成功。在同样药量下，石油醚部位平均抑制率67.25%，明显高于其它提取部位，为其治疗痛经的主要有效部位。乙酸乙酯部位和挥发油部位有减少小鼠扭体次数的趋势。
2.2.2 离体模型[3] 取KM未孕雌性大鼠，实验前灌胃10 mg/kg·d己烯雌酚，连续4d，在第5d取出大鼠子宫置于LokeS液（NaCl 9.2 g，Glucose 1.0 g，CaCl2 0.24 g，KCl 0.42 g，NaHCO3 0.15 g溶于1000 mL重蒸馏水）中清洗，从子宫颈端剪开，浴槽内固定器底部小钩上固定子宫颈端，张力换能器上连接卵巢端。置于恒温浴槽中，内含15 mL LokeS液，通入5% CO2+95% O2混合气体，温度为（37 ± 0.1）℃，pH =7.3。加0.3 g的负荷以调节螺母，平衡40 min，每10 min换1次营养液，0.05 u缩宫素在子宫收缩频率平稳后加入，作用15 min后再依次加入对照组、各供试组15 mg，其中对照组给药3%吐温-80 15 μL，记录给药后子宫张力，观察药物对缩宫素导致子宫痉挛性收缩的对抗作用，记录时间20 min，以营养液冲洗3次后观察下一次实验结果。记录给药前后子宫肌肉张力，抑制的百分率采用Chart4.0.1软件进行计算，以SPSS软件进行统计学分析处理，给药组均有一定程度抑制，且石油醚部位抑制作用最强。
2.2.3 血液流变学[4] 取健康雌性大鼠170只，随机分为17组，即阴性对照（等容生理盐水）、月月舒、各供试组。灌胃给药，每天1次，连续14 d。末次给药后30 min，采用20%乌拉坦麻醉大鼠，经腹主动脉取血4-5 mL，并快速加入混有肝素的抗凝管内，混匀后对血液流变学指标（全血黏度高切、全血黏度低切、全血还原黏度、红细胞聚集指数）进行测定。结果表明，模型组全血高、低切黏度显著增加，给药后全血黏度均有一定程度的降低，其中，石油醚部位改善作用最强。
2.3 有效成分的分离与鉴定 取石油醚浸膏适量，以柱层析用硅胶拌样装柱，以石油醚-丙酮梯度洗脱分离。分离得到4个化合物。经NMR检测鉴定其分别为豆甾醇（stigmasterol）、胡萝卜苷（daucosterol）、大黄素甲醚（physcion）、十六烷酸（hexadecanoic acid）。
3 讨论
痛经属于一种常见的妇科症状，可分为原发性痛经和继发性痛经，其中原发性痛经是指生殖器官无器质性病变者，其发生与月经期子宫内膜前列腺素（PG）含量的升高明显相关，继发性痛经则是指由盆腔器质性疾病所引起的痛经。主要证型包括气血两虚、肾气亏损、湿（痰）热瘀阻、癖热互结、寒凝血瘀及气滞血瘀等，常见治疗药物以活血化瘀、补虚等中药、甲芬那酸、氟芬那酸、布洛芬等前列腺素合成酶抑制剂及避孕药等为主。
作为一种常用中药，香附主要含有挥发油类成分，并含有黄酮类糖类、三萜类等其它化学成分。其有着广泛的生物学活性，能够治疗多种疾病，尤其在妇科疾病中有着广泛的应用。因此，继续深入研究香附的药效学物质基础，开发临床疗效确切、毒副作用小的新药很有意义。
中医理论认为，香附微甘、微苦、辛、平，归肝、脾、三焦经，具有调经止痛、理气宽中、疏肝解郁等作用。a-香附酮是香附的主要成分之一，具有抑制未孕大鼠离体子宫肌自发性收缩，同时抑制由缩宫素引起的离体子宫肌的收缩，对缩宫素所致的小鼠子宫激烈收缩进行抑制，且作用强度呈剂量依赖性。本研究证实了香附镇痛作用显著，可在减轻小鼠痛经疼痛症状的同时缓解缩宫素所致的小鼠子宫收缩。结果得到在同样药量下，石油醚部位平均抑制率67.25%，明显高于其它提取部位，证实了治疗痛经的主要有效部位为石油醚部位。另外，模型组全血高、低切黏度显著增加，给药后全血黏度均有一定程度的降低，其中，石油醚部位改善作用最强。表明香附具有一定的改善血流动力学指标作用，可有效改善血流，发挥活血化淤作用。同时，本研究采用NMR对其有效成分进行了测定，分离出了4中化合物分别为豆甾醇、胡萝卜苷、大黄素甲
醚和十六烷酸。证实了以上成分是香附发挥调经止痛的主要组成。
本研究首次采用在体模型、离体模型和血液流变学指标三种方法同时评价建昌帮四制香附调经止痛效应;切入江西地方炮制品种，有利于江西传统炮制流派的传承与发展。
参考文献：
[1]慈倩倩，李英霞，张文，等.香附的本草考证[J].四川中医，2010，28（4）：50-51.
[2]徐燕，李大祥，凌铁军，等.香附化学成分研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（11）：214-218.
[3]华永庆，洪敏，李璇，等.当归、芍药、香附及其配伍對离体小鼠子宫痛经模型的影响[J].浙江中医杂志，2003，38（1）：28-29.
[4]薛建欣，严永清，蒋莹.黄芪、归尾、香附、川芎、赤芍等配伍对“血瘀”大鼠血液流变学的影响[J].中国中药杂志，1994，19（2）：108-128.
（收稿日期：2018-05-31）
