油脂类食品中脂肪酸单氯丙醇单酯和双酯的分离测定
傅武胜等
摘要：建立了食品中脂肪酸单氯丙醇单酯与双酯含量的测定方法。称取0.1 g的油脂样品，加入内标后，转入氨基固相萃取柱，先以6.0 mL正己烷洗脱脂肪酸单氯丙醇双酯（MCPD双酯），再以6.0 mL正己烷-乙酸乙酯混合溶剂洗脱脂肪酸单氯丙醇单酯（MCPD单酯），分别收集洗脱液并浓缩至近干，残余物经甲醇钠水解和苯基硼酸（PBA）衍生后，供气相色谱/质谱（GCMS）分析。MCPD单酯、MCPD双酯的检出限在83～142 μg/kg（均以MCPD计）之间，线性范围为25～500 μg/L（R2>0.9990）。以花生油和婴幼儿奶粉脂肪提取物为基质，在250～1000 μg/kg范围内进行3种浓度水平的加标回收实验，MCPD单酯与双酯的回收率在86.5%～104.0%之间，相对标准偏差（RSD）为2.4%～13.2%（n=6）。此外，本方法成功应用于市售食用植物油和婴幼儿奶粉中MCPD单、双酯的污染调查。
关键词：脂肪酸； 3氯1，2丙二醇单酯； 3氯1，2丙二醇双酯； 2氯1，3丙二醇单酯； 2氯1，3丙二醇双酯； 食用植物油； 奶粉； 气相色谱质谱法； 固相萃取法
1引言
氯丙醇与脂肪酸酯化形成的脂肪酸氯丙醇酯（氯丙酯）是近年来国际上新出现的食品安全问题，尤其是脂肪酸3氯1，2丙二醇酯（简称3MCPD酯）的污染最为突出。氯丙醇是公认的食品加工中形成的污染物，3氯1，2丙二醇（3MCPD）具有肾脏毒性、生殖毒性、免疫抑制作用和潜在致癌性而被广泛关注[1，2]。早在1980年就发现植物蛋白在酸水解中会形成3MCPD酯[3，4]，随后在奶粉[5]、山羊奶[6]、食用油[7]以及油炸食品[8]中也检出该成分。氯丙酯尤其在食用油和奶粉等脂肪含量较高的食品中污染水平较高，食物中氯丙酯的含量是氯丙醇的5～396倍[9～13]，因此氯丙酯问题引起了欧盟等食品安全机构的极大关注。目前， 氯丙酯的毒性仍不清楚，对其健康风险的担心主要是因为氯丙酯的水解产物氯丙醇的毒性作用[14～17]。3MCPD酯在肠道水解后将增加人体3MCPD的暴露水平，3MCPD摄入量是其暂定每日最大耐受量（TDI）（2 μg/kg·bw）的5～100倍[18，19]。由于3MCPD具有1～2个羟基，因此3MCPD酯具有3MCPD单酯和双酯两种形式，结构上的差异可能导致毒理学作用的差异。实验表明，3MCPD双酯会致大鼠精子减少（生殖毒性），3MCPD单酯不仅具有生殖毒性，还可能造成大鼠肾小管坏死（肾脏毒性）[16]。在模拟肠道的脂肪酶水解试验中发现，3MCPD单酯水解生成3MCPD的速率远超过3MCPD双酯[20，21]。因此，有必要对3MCPD单/双酯进行分离和分别检测，获得食品中3MCPD单酯与双酯含量的数据，以更准确地评估3MCPD酯的健康风险。
国际上测定食品（油脂）中3MCPD酯总量的研究较多[22]，但对3MCPD单/双酯含量分别检测的研究极少。据报道采用氨丙基（Aminopropyl）[23]或硅胶[24]固相萃取法，以正己烷、乙醚、二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯混合溶剂洗脱，将3MCPD单酯与双酯分离，进一步水解、净化、衍生后，用GCMS分别检测。但该法所用溶剂种类多、比例复杂、体积多达850 mL、操作较为繁琐，且未证实方法是否适合各类油脂中不同脂肪酸组成的氯丙醇单酯、双酯。超临界流体色谱三重四级杆串联质谱法也可用于测定3MCPD单酯/双酯[25]， 该法测定步骤虽简单，但对仪器要求较高，且容易污染。本研究采用氨基固相萃取法，利用正己烷-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，并采用碱水解苯基硼酸（PBA）衍生GCMS法测定[26]；方法除了可测定3MCPD单酯/双酯外，还可能适用于2氯1，3丙二醇（2MCPD）单酯/双酯的测定。
2实验部分
2.1仪器与试剂
3800型气相色谱仪和Saturn 2200离子阱型质谱仪（美国Varian公司）；NEVAPTM 111型氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；Microfuge型高速离心机（美国Beckman公司）；6 mL聚丙烯固相萃取柱柱筒（Angela公司）。玻璃器皿在220 ℃下烘烤3 h后使用。
2.4标准曲线的建立
准确移取适量标准及内标工作液，以正己烷稀释成浓度分别为25， 50， 100， 200和500 μg/L的MCPD单酯、MCPD双酯标准系列，内标浓度均为100 μg/L，再按文献[21]方法水解、净化、衍生处理，供GCMS分析。
2.5样品中氯丙酯含量的测定
上样： 称取0.1 g食用油或油脂食品的脂肪于1.5 mL塑料离心管中，准确加入混合内标工作液50 μL， 涡旋混匀后超声5 min，转入固相萃取柱（500 mg/6 mL，经4.0 mL正己烷活化），并以0.2 mL正己烷洗涤离心管两次，将洗涤液一并转入固相萃取柱中。
洗脱：先以6 mL正己烷洗脱MCPD双酯；再用正己烷/乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脱MCPD单酯，分别收集洗脱液，并将洗脱液置于氮气流下缓缓浓缩至近干。
分别于上述分离得到的样品中，超声混匀，再按文献 [26]方法水解、净化、衍生处理，得到1.0 mL待测溶液，供GCMS分析，以同位素内标法定量。
3结果与讨论
3.1MCPD衍生物的鉴定以及定量离子的确定
3.3洗脱分离溶剂的比例
分别以10 mL不同比例的正己烷乙酸乙酯（9∶1， 8∶2， 7∶3， V/V）和正己烷作为洗脱剂，每种条件重复3次。对于MCPD双酯，4种溶剂皆能将其洗脱下来，但以10 mL正己烷的洗脱效果最优，回收率为83.1%～103.0%； 对于MCPD单酯，除10 mL正己烷外，其余3种比例的溶剂均能将其洗脱下来，并以正己烷乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脱效果最好，回收率在87.2%～97.8%之间。这可能由于MCPD单酯与双酯结构上有差异，导致两者极性不同，含有一个羟基的MCPD单酯极性略强于MCPD双酯。因此，采用正己烷作为MCPD双酯的洗脱溶剂，正己烷乙酸乙酯（7∶3， V/V）作为MCPD单酯的洗脱溶剂。
3.4洗脱分离溶剂的体积
为进一步确定所需的洗脱剂体积，分别以10 mL正己烷、正己烷/乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脱MCPD双酯与MCPD单酯，每2 mL为一阶段收集洗脱液。结果表明，无论是MCPD单酯还是MCPD双酯，当洗脱溶剂体积为4.0 mL时，其回收率较为理想（94.6%～99.3%）；增至6.0 mL时，结果与4.0 mL相差不大，说明4.0 mL溶剂足以洗脱大部分的MCPD单酯/双酯。但考虑到实验条件可能存在的微小变化，如填料的松紧或者洗脱流速的差异等，甚至某些样品MCPD单/双酯含量异常高，因此洗脱溶剂体积均选择6.0 mL。
3.5不同类型脂肪酸MCPD单/双酯的分离验证
考虑到不同类型脂肪酸的碳数和单双键数量、空间结构等不同，由此可能导致其洗脱特性不同，需进一步验证。以不同种类脂肪酸构成的MCPD单酯、MCPD双酯标准液（十二碳的饱和月桂酸、十六碳的饱和棕榈酸、十八碳的不饱和亚麻酸、十八碳的饱和硬脂酸）进行实验。结果表明，6.0 mL正己烷可把上述各类脂肪酸的MCPD双酯洗脱下来，回收率为92.3%～97.4%，但无法洗脱MCPD单酯，见图2；但以6.0 mL正己烷酸乙酯（7∶3， V/V）混合液可将MCPD单酯洗脱下来，回收率为93.7%～99.4%，见图2a；由此可见，优化的方法适用于各类脂肪酸MCPD单酯与双酯的分离。
3.6检出限和定量限
在花生油基质中加标，获得3MCPD单、双酯和2MCPD双酯的检出限（LOD，S/N=3）分别为83， 125和100 μg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）分别为278， 417和333 μg/kg。在婴幼儿奶粉脂肪提取物基质中，3MCPD单、双酯以及2MCPD双酯的检出限略高，分别为95.1， 142和122 μg/kg， 脂肪定量限分别为316， 473和406 μg/kg，这说明即使在基质较为复杂的婴幼儿奶粉脂肪提取物中，方法的检出限和定量限也满足分析要求。
3.7线性范围
3MCPD棕榈酸单酯与双酯以及2MCPD二硬脂酸酯含量分别以3MCPD和2MCPD计算。以3MCPD， 2MCPD与各自内标峰面积比值y和各自的质量x（ng）计算线性回归方程。结果表明，在25～500 ng范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.9990。
3.8准确度和精密度
3.9实际样品分析
利用本方法调查了12个品种的72份市售食用植物油样品和7个品牌31份婴幼儿配方奶粉中MCPD单/双酯的含量，同时按文献 [26] 方法测定脂肪酸MCPD酯总量。结果表明，脂肪中以MCPD双酯含量为主体，MCPD单酯含量占MCPD酯总量的5.0%～45.0%。此外，利用本方法测定的MCPD单酯、双酯含量之和占用文献[21]方法测定MCPD酯总量的71.9%～98.2%，验证了本方法的可靠性。
本方法操作较为简便、灵敏度较高、结合内标标准曲线法定量，结果准确可靠， 适用于检测食用植物油和婴幼儿奶粉中MCPD单酯、双酯含量的检测方法。
References
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摘要：建立了食品中脂肪酸单氯丙醇单酯与双酯含量的测定方法。称取0.1 g的油脂样品，加入内标后，转入氨基固相萃取柱，先以6.0 mL正己烷洗脱脂肪酸单氯丙醇双酯（MCPD双酯），再以6.0 mL正己烷-乙酸乙酯混合溶剂洗脱脂肪酸单氯丙醇单酯（MCPD单酯），分别收集洗脱液并浓缩至近干，残余物经甲醇钠水解和苯基硼酸（PBA）衍生后，供气相色谱/质谱（GCMS）分析。MCPD单酯、MCPD双酯的检出限在83～142 μg/kg（均以MCPD计）之间，线性范围为25～500 μg/L（R2>0.9990）。以花生油和婴幼儿奶粉脂肪提取物为基质，在250～1000 μg/kg范围内进行3种浓度水平的加标回收实验，MCPD单酯与双酯的回收率在86.5%～104.0%之间，相对标准偏差（RSD）为2.4%～13.2%（n=6）。此外，本方法成功应用于市售食用植物油和婴幼儿奶粉中MCPD单、双酯的污染调查。
关键词：脂肪酸； 3氯1，2丙二醇单酯； 3氯1，2丙二醇双酯； 2氯1，3丙二醇单酯； 2氯1，3丙二醇双酯； 食用植物油； 奶粉； 气相色谱质谱法； 固相萃取法
1引言
氯丙醇与脂肪酸酯化形成的脂肪酸氯丙醇酯（氯丙酯）是近年来国际上新出现的食品安全问题，尤其是脂肪酸3氯1，2丙二醇酯（简称3MCPD酯）的污染最为突出。氯丙醇是公认的食品加工中形成的污染物，3氯1，2丙二醇（3MCPD）具有肾脏毒性、生殖毒性、免疫抑制作用和潜在致癌性而被广泛关注[1，2]。早在1980年就发现植物蛋白在酸水解中会形成3MCPD酯[3，4]，随后在奶粉[5]、山羊奶[6]、食用油[7]以及油炸食品[8]中也检出该成分。氯丙酯尤其在食用油和奶粉等脂肪含量较高的食品中污染水平较高，食物中氯丙酯的含量是氯丙醇的5～396倍[9～13]，因此氯丙酯问题引起了欧盟等食品安全机构的极大关注。目前， 氯丙酯的毒性仍不清楚，对其健康风险的担心主要是因为氯丙酯的水解产物氯丙醇的毒性作用[14～17]。3MCPD酯在肠道水解后将增加人体3MCPD的暴露水平，3MCPD摄入量是其暂定每日最大耐受量（TDI）（2 μg/kg·bw）的5～100倍[18，19]。由于3MCPD具有1～2个羟基，因此3MCPD酯具有3MCPD单酯和双酯两种形式，结构上的差异可能导致毒理学作用的差异。实验表明，3MCPD双酯会致大鼠精子减少（生殖毒性），3MCPD单酯不仅具有生殖毒性，还可能造成大鼠肾小管坏死（肾脏毒性）[16]。在模拟肠道的脂肪酶水解试验中发现，3MCPD单酯水解生成3MCPD的速率远超过3MCPD双酯[20，21]。因此，有必要对3MCPD单/双酯进行分离和分别检测，获得食品中3MCPD单酯与双酯含量的数据，以更准确地评估3MCPD酯的健康风险。
国际上测定食品（油脂）中3MCPD酯总量的研究较多[22]，但对3MCPD单/双酯含量分别检测的研究极少。据报道采用氨丙基（Aminopropyl）[23]或硅胶[24]固相萃取法，以正己烷、乙醚、二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯混合溶剂洗脱，将3MCPD单酯与双酯分离，进一步水解、净化、衍生后，用GCMS分别检测。但该法所用溶剂种类多、比例复杂、体积多达850 mL、操作较为繁琐，且未证实方法是否适合各类油脂中不同脂肪酸组成的氯丙醇单酯、双酯。超临界流体色谱三重四级杆串联质谱法也可用于测定3MCPD单酯/双酯[25]， 该法测定步骤虽简单，但对仪器要求较高，且容易污染。本研究采用氨基固相萃取法，利用正己烷-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，并采用碱水解苯基硼酸（PBA）衍生GCMS法测定[26]；方法除了可测定3MCPD单酯/双酯外，还可能适用于2氯1，3丙二醇（2MCPD）单酯/双酯的测定。
2实验部分
2.1仪器与试剂
3800型气相色谱仪和Saturn 2200离子阱型质谱仪（美国Varian公司）；NEVAPTM 111型氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；Microfuge型高速离心机（美国Beckman公司）；6 mL聚丙烯固相萃取柱柱筒（Angela公司）。玻璃器皿在220 ℃下烘烤3 h后使用。
2.4标准曲线的建立
准确移取适量标准及内标工作液，以正己烷稀释成浓度分别为25， 50， 100， 200和500 μg/L的MCPD单酯、MCPD双酯标准系列，内标浓度均为100 μg/L，再按文献[21]方法水解、净化、衍生处理，供GCMS分析。
2.5样品中氯丙酯含量的测定
上样： 称取0.1 g食用油或油脂食品的脂肪于1.5 mL塑料离心管中，准确加入混合内标工作液50 μL， 涡旋混匀后超声5 min，转入固相萃取柱（500 mg/6 mL，经4.0 mL正己烷活化），并以0.2 mL正己烷洗涤离心管两次，将洗涤液一并转入固相萃取柱中。
洗脱：先以6 mL正己烷洗脱MCPD双酯；再用正己烷/乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脱MCPD单酯，分别收集洗脱液，并将洗脱液置于氮气流下缓缓浓缩至近干。
分别于上述分离得到的样品中，超声混匀，再按文献 [26]方法水解、净化、衍生处理，得到1.0 mL待测溶液，供GCMS分析，以同位素内标法定量。
3结果与讨论
3.1MCPD衍生物的鉴定以及定量离子的确定
3.3洗脱分离溶剂的比例
分别以10 mL不同比例的正己烷乙酸乙酯（9∶1， 8∶2， 7∶3， V/V）和正己烷作为洗脱剂，每种条件重复3次。对于MCPD双酯，4种溶剂皆能将其洗脱下来，但以10 mL正己烷的洗脱效果最优，回收率为83.1%～103.0%； 对于MCPD单酯，除10 mL正己烷外，其余3种比例的溶剂均能将其洗脱下来，并以正己烷乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脱效果最好，回收率在87.2%～97.8%之间。这可能由于MCPD单酯与双酯结构上有差异，导致两者极性不同，含有一个羟基的MCPD单酯极性略强于MCPD双酯。因此，采用正己烷作为MCPD双酯的洗脱溶剂，正己烷乙酸乙酯（7∶3， V/V）作为MCPD单酯的洗脱溶剂。
3.4洗脱分离溶剂的体积
为进一步确定所需的洗脱剂体积，分别以10 mL正己烷、正己烷/乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脱MCPD双酯与MCPD单酯，每2 mL为一阶段收集洗脱液。结果表明，无论是MCPD单酯还是MCPD双酯，当洗脱溶剂体积为4.0 mL时，其回收率较为理想（94.6%～99.3%）；增至6.0 mL时，结果与4.0 mL相差不大，说明4.0 mL溶剂足以洗脱大部分的MCPD单酯/双酯。但考虑到实验条件可能存在的微小变化，如填料的松紧或者洗脱流速的差异等，甚至某些样品MCPD单/双酯含量异常高，因此洗脱溶剂体积均选择6.0 mL。
3.5不同类型脂肪酸MCPD单/双酯的分离验证
考虑到不同类型脂肪酸的碳数和单双键数量、空间结构等不同，由此可能导致其洗脱特性不同，需进一步验证。以不同种类脂肪酸构成的MCPD单酯、MCPD双酯标准液（十二碳的饱和月桂酸、十六碳的饱和棕榈酸、十八碳的不饱和亚麻酸、十八碳的饱和硬脂酸）进行实验。结果表明，6.0 mL正己烷可把上述各类脂肪酸的MCPD双酯洗脱下来，回收率为92.3%～97.4%，但无法洗脱MCPD单酯，见图2；但以6.0 mL正己烷酸乙酯（7∶3， V/V）混合液可将MCPD单酯洗脱下来，回收率为93.7%～99.4%，见图2a；由此可见，优化的方法适用于各类脂肪酸MCPD单酯与双酯的分离。
3.6检出限和定量限
在花生油基质中加标，获得3MCPD单、双酯和2MCPD双酯的检出限（LOD，S/N=3）分别为83， 125和100 μg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）分别为278， 417和333 μg/kg。在婴幼儿奶粉脂肪提取物基质中，3MCPD单、双酯以及2MCPD双酯的检出限略高，分别为95.1， 142和122 μg/kg， 脂肪定量限分别为316， 473和406 μg/kg，这说明即使在基质较为复杂的婴幼儿奶粉脂肪提取物中，方法的检出限和定量限也满足分析要求。
3.7线性范围
3MCPD棕榈酸单酯与双酯以及2MCPD二硬脂酸酯含量分别以3MCPD和2MCPD计算。以3MCPD， 2MCPD与各自内标峰面积比值y和各自的质量x（ng）计算线性回归方程。结果表明，在25～500 ng范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.9990。
3.8准确度和精密度
3.9实际样品分析
利用本方法调查了12个品种的72份市售食用植物油样品和7个品牌31份婴幼儿配方奶粉中MCPD单/双酯的含量，同时按文献 [26] 方法测定脂肪酸MCPD酯总量。结果表明，脂肪中以MCPD双酯含量为主体，MCPD单酯含量占MCPD酯总量的5.0%～45.0%。此外，利用本方法测定的MCPD单酯、双酯含量之和占用文献[21]方法测定MCPD酯总量的71.9%～98.2%，验证了本方法的可靠性。
本方法操作较为简便、灵敏度较高、结合内标标准曲线法定量，结果准确可靠， 适用于检测食用植物油和婴幼儿奶粉中MCPD单酯、双酯含量的检测方法。
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