超高效液相色谱 串联质谱法测定鸡皮及脂肪组织中抗球虫类药物残留
王盈予+夏曦+李晓薇+丁双阳+沈建忠??
摘 要 建立了检测鸡的皮和脂肪中抗球虫类药物的超高效液相色谱 串联质谱分析方法。样品采用甲醇、乙腈、乙酸（4∶1∶0.05；V/V） 混合溶液提取，提取液经Sep Pak tC18固相萃取柱富集净化，在电喷雾正离子模式下，以多反应监测模式采集数据，进行定性与定量分析。结果表明，常山酮和氯苯胍的检出限均为 7.0 μg/kg，定量限为20 μg/kg；盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马杜霉素和拉沙洛菌素的检出限均为 5.0 μg/kg，定量限为15.0 μg/kg。本方法在15～200 μg/kg添加浓度范围内的回收率为75%～110%，日内相对标准偏差≤12.8%， 日间相对标准偏差≤13.4%。
关键词 超高效液相色谱； 串联质谱； 抗球虫药； 残留
1 引 言
球虫病是由寄生于宿主肠道或胆管上皮细胞内的艾美耳科原虫引起的一种寄生虫病，是集约化养鸡业中最重要的疾病之一。聚醚类抗生素（Polyether antibiotics，PEs）、常山酮（Halofuginone，HAL）、氯苯胍（Robenidine，ROB）等是目前常用的抗球虫药物。目前， 球虫病主要以预防为主，将抗球虫药物拌入饲料定期饲喂，效果较好，因此也易产生鸡组织中抗球虫药物的残留。
动物源性组织中抗球虫药物的检测方法已有不少报道[1～5]。Mortier等建立了鸡蛋中同时检测5种抗球虫药的液相色谱 串联质谱法[6]，该方法采用乙腈作为提取液，定量限（LOQ）为0.75～6.0 μg/kg，检出限为（LOD）0.9～8.3 μg/kg。Galarini等建立了鸡蛋中11种抗球虫药的液相色谱 串联质谱的检测方法[7]，样品用乙腈提取，正己烷脱脂，硅胶柱净化。Moloney等报道了同时测定鸡蛋及肌肉组织中20种抗球虫药残留的高效液相色谱 串联质谱法[8]。Olejnik等建立了鸡肝中12种抗球虫药残留的液相色谱 串联质谱检测方法[9]，样本用乙腈进行提取，氧化铝柱脱脂，HLB固相萃取柱净化。在已有的文献中，多为检测鸡蛋、鸡肉、鸡肝等基质的方法，而鸡皮和脂肪的确证方法几乎没有。我国农业部235号公告明确规定了多种抗球虫药在皮脂中的最大残留限量（MRL）[10]，因此建立鸡皮及脂肪组织中抗球虫药物的多残留检测方法是十分必要的。
本研究建立了鸡的皮及脂肪中7种抗球虫药物（常山酮、氯苯胍、盐霉素、甲基盐霉素、莫能菌素、沙拉洛菌素、马杜霉素）的超高效液相色谱 串联质谱（UPLC MS/MS）确证检测方法，填补了该类动物组织中抗球虫类药物多残留的确证方法空白。本方法灵敏度高，选择性好，操作简便，结果准确，能够满足抗球虫药物多残留的定性与定量分析。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Acquity UPLC Premier XE 超高效液相色谱 串联质谱仪（美国Waters公司）；AM 2组织匀浆机（日本Nissei公司）；5804R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；HQ 60 II涡旋混合器（北方同正生物技术发展有限公司）；固相萃取装置（美国Waters公司）；N Evap 112氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；GHP滤膜（0.2 μm，美国Pall公司）；Sep Pak tC18固相萃取柱（500 mg/6 mL，美国Waters公司）；Milli Q超纯水系统（美国Millipore公司）。
2.2 标准溶液制备
标准储备液：分别称取适量的常山酮、氯苯胍、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马杜霉素、拉沙洛菌素对照品，用甲醇溶解，配制成1000 mg/L标准储备液，
Symbolm@@ 20 ℃保存。
混合标准储备液：分别准确量取0.1 mL标准储备液，用甲醇稀释，配制成10 mg/L的7种抗球虫药混合标准溶液，
Symbolm@@ 20 ℃保存。
混合标准工作液：取适量的10 mg/L混合标准储备液，用甲醇稀释成适宜浓度的标准工作液，
Symbolm@@ 20 ℃保存。
2.3 样品预处理
称取（2.00±0.02） g试样，加入10 mL提取液，涡动2 min；在
Symbolm@@ 5 ℃，10000 r/min 离心10 min，取出上清液，残渣重复提取一次。合并提取液，混匀。取上清液4 mL，加水2 mL涡动1 min， 5000 r/min离心10 min。上清液转移至另一离心管中，加水2 mL涡动1 min， 5000 r/min离心10 min。上清液转移至另一离心管中，加水15 mL，混匀备用。C18柱用5 mL甲醇、5 mL水活化，将备用液全部过柱。先后用3 mL水、3 mL 20%甲醇溶液淋洗，用洗脱液10 mL洗脱。洗脱液于40 ℃水浴氮气吹干，加入400 μL甲醇 水（50∶50，V/V）溶液涡动1 min复溶，14000 r/min 离心10 min，过滤膜后供液相色谱 串联质谱仪测定。
2.4 色谱 质谱条件
2.4.1 色谱条件 Acquity UPLC BEHC18色谱柱（50 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min；进样量10 μL；流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为0.1%甲酸甲醇溶液；梯度洗脱： 0～0.5 min， 90% A； 0.5～1.0 min， 90%～0% A； 1.0～2.5 min， 0% A； 2.5～2.6 min， 0%～90% A； 2.6～4.0 min， 90% A。
2.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源，正离子扫描（ESI+）；监测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：100 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量： 600 L/h；锥孔气流量：30 L/h；测试药物的母离子、子离子及对应的锥孔电压、碰撞能量见表1。
3 结果与讨论
3.1 前处理方法的选择
在被分析的化合物中，常山酮极性较强，而聚醚类药物极性较弱，二者性质上的差异给样品的提取和净化带来了极大的挑战，而且鸡皮和脂肪组织中非极性干扰物很多，也使得样品前处理更为困难。
采用不同的溶剂，如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，以及溶剂组合作为提取溶剂，从提取回收率及共提取杂质干扰两方面来评价提取效果，如图1所示，甲醇 乙腈的混合溶液提取回收率较高。优化了甲醇和乙腈的比例，并分别加入1%、2%、5%的甲酸和乙酸调节pH值，最终选择了甲醇 乙腈 乙酸（4∶1∶0.05；V/V）混合溶剂进行提取。用有机试剂对皮脂组织进行提取后，粗提液中有大量的脂类物质需要去除，而聚醚类药物的非极性太强，常用的正己烷液 液萃取除脂方法会严重影响聚醚类药物的回收率，因此考虑直接进行固相萃取（SPE）净化。运用不同品牌不同类型的SPE柱进行净化，发现正相柱不适合纯化常山酮，而聚醚类药物在离子交换柱上的回收率偏低，所以采用反相柱。反相SPE柱的上样液要求水相比例高，以防止分析物穿漏。将提取溶液挥发干燥后再进行复溶，结果不甚理想。一方面，提取溶液浓缩干燥的时间较长；另一方面，复溶液中有机相比例过高则不满足初衷，过低则聚醚类药物有损失。采用稀释法，但是直接加入大量的水稀释提取液，容易浑浊乳化，进而影响SPE的效果。经过多次实验，采用了逐级稀释的办法，虽然稍微繁琐，但是效果良好。比较了3种反相SPE柱Oasis HLB、Sep pak tC18和Bond Elut C18，可能是因为HLB小柱的含碳量较低，对于聚醚类药物的回收率难以让人满意，而另外两款C18小柱的回收率满足要求（图2）。因为tC18小柱的稳定性更佳，平行样品的差异较小，所以确定使用该SPE柱。优化了SPE的洗涤和洗脱条件，用20%甲醇溶液可以洗掉更多的干扰物质，不会影响回收率，而在洗脱液中高比例的乙酸乙酯有助于聚醚类药物的洗脱。
采用的BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm）对7种抗球虫药物均具有较好的保留，且容易获得良好的分离效果和对称的峰形，可满足质谱检测的要求。流动相的选择和组成对化合物的分离也至关重要，甲醇和乙腈是常见的分析抗球虫药物的流动相[5～7]，本研究分别以甲醇（含0.1%甲酸）和乙腈（含0.1%甲酸）为流动相，发现乙腈会使得拉沙洛菌素的峰形变宽，而甲醇则获得更为尖锐的色谱峰，可以提高灵敏度和分离度。摸索不同的流动相梯度洗脱比例，经过反复实验，确定了2.4节所示条件，可在4 min内完成7种抗球虫类药物的快速分离检测，大大提高了分析速度，节省有机溶剂的使用，降低了分析成本。
目前， 抗球虫药的检测多采用电喷雾离子源，本研究在串联质谱参数的优化中，以1.0 mg/L标准溶液分别进行7种抗球虫药物的正离子全扫描，确定被测物的母离子，并对电离电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂温度等参数进行了优化。在子离子扫描模式下，选择强度最高的两个子离子作为定性与定量离子，并通过系列碰撞能量的优化，确定各子离子最佳的碰撞能量。
3.3 方法学考察
3.3.1 线性范围和基质效应 在比较标准溶液和空白样品加标溶液的响应值时发现，7种抗球虫药物均存在不同程度的离子抑制现象，其中最严重的常山酮高达30%～40%。为了克服基质效应的影响，制备了基质匹配标准曲线进行线性范围的验证。取空白样品按照2.3节的步骤进行处理，并在洗脱液中加入混合标准工作液，吹干并复溶，得到浓度为5， 10， 50， 100， 250和500 μg/L的系列基质匹配标准溶液，然后按照2.4节所确定的条件进行分析，线性回归相关结果见表2。从表2可见，7种抗球虫药物的相关系数（R2）均大于0.99，表明其在5～500 μg/L浓度范围内线性关系良好。
3.3.2 灵敏度与特异性 制备一系列不同浓度的空白加标样品，按照所确定的方法进行检测，以信噪比S/N=3的样品浓度为方法检出限（LOD），以信噪比S/N=10的样品浓度为方法定量限（LOQ）。具体结果见表2，方法的检出限和定量限远低于最高残留限量。对于方法特异性的考察，分析了不同来源的20份空白样品，空白样品质量色谱图在被测化合物保留时间附近没有发现明显的杂峰，表明基质干扰小，特异性满足药物残留分析的要求。
3.3.3 回收率与精密度 在鸡的皮脂组织中进行3个浓度水平（LOQ、5倍LOQ、10倍LOQ）的空白样品加标回收实验，每个浓度6个平行样品，进行3个批次的样品分析，计算回收率、日内变异系数和日间变异系数，结果如表3所示。7种抗球虫药的日内平均回收率在75.7%～108.0%之间，日内相对标准偏差<12.8%；日间平均回收率在75.4%～96.3%之间，日间相对标准偏差<13.4%，表明方法的回收率高，稳定性好。空白样品和LOQ浓度水平的空白加标样品的质量色谱图见图3。
3.4 实际样品的检测
运用本方法对市场上随机购买的80份鸡皮及脂肪样品进行检测，其中2个样品呈阳性，均为莫能菌素，含量分别为51.6和87.1 μg/kg，低于最高残留限量。结果表明， 本方法具有稳定性好、简单快速、经济等特点，适用于鸡皮及脂肪组织中抗球虫药物的确证检测。
References
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10Maximum Residue Limits of Veterinary Drugs in Food producing Animals. Ministry of Agriculture of the People′s Republic of China， 2002
中华人民共和国农业部第235号公告. 动物性食品中兽药最高残留限量， 2002
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关键词 超高效液相色谱； 串联质谱； 抗球虫药； 残留
1 引 言
球虫病是由寄生于宿主肠道或胆管上皮细胞内的艾美耳科原虫引起的一种寄生虫病，是集约化养鸡业中最重要的疾病之一。聚醚类抗生素（Polyether antibiotics，PEs）、常山酮（Halofuginone，HAL）、氯苯胍（Robenidine，ROB）等是目前常用的抗球虫药物。目前， 球虫病主要以预防为主，将抗球虫药物拌入饲料定期饲喂，效果较好，因此也易产生鸡组织中抗球虫药物的残留。
动物源性组织中抗球虫药物的检测方法已有不少报道[1～5]。Mortier等建立了鸡蛋中同时检测5种抗球虫药的液相色谱 串联质谱法[6]，该方法采用乙腈作为提取液，定量限（LOQ）为0.75～6.0 μg/kg，检出限为（LOD）0.9～8.3 μg/kg。Galarini等建立了鸡蛋中11种抗球虫药的液相色谱 串联质谱的检测方法[7]，样品用乙腈提取，正己烷脱脂，硅胶柱净化。Moloney等报道了同时测定鸡蛋及肌肉组织中20种抗球虫药残留的高效液相色谱 串联质谱法[8]。Olejnik等建立了鸡肝中12种抗球虫药残留的液相色谱 串联质谱检测方法[9]，样本用乙腈进行提取，氧化铝柱脱脂，HLB固相萃取柱净化。在已有的文献中，多为检测鸡蛋、鸡肉、鸡肝等基质的方法，而鸡皮和脂肪的确证方法几乎没有。我国农业部235号公告明确规定了多种抗球虫药在皮脂中的最大残留限量（MRL）[10]，因此建立鸡皮及脂肪组织中抗球虫药物的多残留检测方法是十分必要的。
本研究建立了鸡的皮及脂肪中7种抗球虫药物（常山酮、氯苯胍、盐霉素、甲基盐霉素、莫能菌素、沙拉洛菌素、马杜霉素）的超高效液相色谱 串联质谱（UPLC MS/MS）确证检测方法，填补了该类动物组织中抗球虫类药物多残留的确证方法空白。本方法灵敏度高，选择性好，操作简便，结果准确，能够满足抗球虫药物多残留的定性与定量分析。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Acquity UPLC Premier XE 超高效液相色谱 串联质谱仪（美国Waters公司）；AM 2组织匀浆机（日本Nissei公司）；5804R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；HQ 60 II涡旋混合器（北方同正生物技术发展有限公司）；固相萃取装置（美国Waters公司）；N Evap 112氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；GHP滤膜（0.2 μm，美国Pall公司）；Sep Pak tC18固相萃取柱（500 mg/6 mL，美国Waters公司）；Milli Q超纯水系统（美国Millipore公司）。
2.2 标准溶液制备
标准储备液：分别称取适量的常山酮、氯苯胍、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马杜霉素、拉沙洛菌素对照品，用甲醇溶解，配制成1000 mg/L标准储备液，
Symbolm@@ 20 ℃保存。
混合标准储备液：分别准确量取0.1 mL标准储备液，用甲醇稀释，配制成10 mg/L的7种抗球虫药混合标准溶液，
Symbolm@@ 20 ℃保存。
混合标准工作液：取适量的10 mg/L混合标准储备液，用甲醇稀释成适宜浓度的标准工作液，
Symbolm@@ 20 ℃保存。
2.3 样品预处理
称取（2.00±0.02） g试样，加入10 mL提取液，涡动2 min；在
Symbolm@@ 5 ℃，10000 r/min 离心10 min，取出上清液，残渣重复提取一次。合并提取液，混匀。取上清液4 mL，加水2 mL涡动1 min， 5000 r/min离心10 min。上清液转移至另一离心管中，加水2 mL涡动1 min， 5000 r/min离心10 min。上清液转移至另一离心管中，加水15 mL，混匀备用。C18柱用5 mL甲醇、5 mL水活化，将备用液全部过柱。先后用3 mL水、3 mL 20%甲醇溶液淋洗，用洗脱液10 mL洗脱。洗脱液于40 ℃水浴氮气吹干，加入400 μL甲醇 水（50∶50，V/V）溶液涡动1 min复溶，14000 r/min 离心10 min，过滤膜后供液相色谱 串联质谱仪测定。
2.4 色谱 质谱条件
2.4.1 色谱条件 Acquity UPLC BEHC18色谱柱（50 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min；进样量10 μL；流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为0.1%甲酸甲醇溶液；梯度洗脱： 0～0.5 min， 90% A； 0.5～1.0 min， 90%～0% A； 1.0～2.5 min， 0% A； 2.5～2.6 min， 0%～90% A； 2.6～4.0 min， 90% A。
2.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源，正离子扫描（ESI+）；监测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：100 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量： 600 L/h；锥孔气流量：30 L/h；测试药物的母离子、子离子及对应的锥孔电压、碰撞能量见表1。
3 结果与讨论
3.1 前处理方法的选择
在被分析的化合物中，常山酮极性较强，而聚醚类药物极性较弱，二者性质上的差异给样品的提取和净化带来了极大的挑战，而且鸡皮和脂肪组织中非极性干扰物很多，也使得样品前处理更为困难。
采用不同的溶剂，如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，以及溶剂组合作为提取溶剂，从提取回收率及共提取杂质干扰两方面来评价提取效果，如图1所示，甲醇 乙腈的混合溶液提取回收率较高。优化了甲醇和乙腈的比例，并分别加入1%、2%、5%的甲酸和乙酸调节pH值，最终选择了甲醇 乙腈 乙酸（4∶1∶0.05；V/V）混合溶剂进行提取。用有机试剂对皮脂组织进行提取后，粗提液中有大量的脂类物质需要去除，而聚醚类药物的非极性太强，常用的正己烷液 液萃取除脂方法会严重影响聚醚类药物的回收率，因此考虑直接进行固相萃取（SPE）净化。运用不同品牌不同类型的SPE柱进行净化，发现正相柱不适合纯化常山酮，而聚醚类药物在离子交换柱上的回收率偏低，所以采用反相柱。反相SPE柱的上样液要求水相比例高，以防止分析物穿漏。将提取溶液挥发干燥后再进行复溶，结果不甚理想。一方面，提取溶液浓缩干燥的时间较长；另一方面，复溶液中有机相比例过高则不满足初衷，过低则聚醚类药物有损失。采用稀释法，但是直接加入大量的水稀释提取液，容易浑浊乳化，进而影响SPE的效果。经过多次实验，采用了逐级稀释的办法，虽然稍微繁琐，但是效果良好。比较了3种反相SPE柱Oasis HLB、Sep pak tC18和Bond Elut C18，可能是因为HLB小柱的含碳量较低，对于聚醚类药物的回收率难以让人满意，而另外两款C18小柱的回收率满足要求（图2）。因为tC18小柱的稳定性更佳，平行样品的差异较小，所以确定使用该SPE柱。优化了SPE的洗涤和洗脱条件，用20%甲醇溶液可以洗掉更多的干扰物质，不会影响回收率，而在洗脱液中高比例的乙酸乙酯有助于聚醚类药物的洗脱。
采用的BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm）对7种抗球虫药物均具有较好的保留，且容易获得良好的分离效果和对称的峰形，可满足质谱检测的要求。流动相的选择和组成对化合物的分离也至关重要，甲醇和乙腈是常见的分析抗球虫药物的流动相[5～7]，本研究分别以甲醇（含0.1%甲酸）和乙腈（含0.1%甲酸）为流动相，发现乙腈会使得拉沙洛菌素的峰形变宽，而甲醇则获得更为尖锐的色谱峰，可以提高灵敏度和分离度。摸索不同的流动相梯度洗脱比例，经过反复实验，确定了2.4节所示条件，可在4 min内完成7种抗球虫类药物的快速分离检测，大大提高了分析速度，节省有机溶剂的使用，降低了分析成本。
目前， 抗球虫药的检测多采用电喷雾离子源，本研究在串联质谱参数的优化中，以1.0 mg/L标准溶液分别进行7种抗球虫药物的正离子全扫描，确定被测物的母离子，并对电离电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂温度等参数进行了优化。在子离子扫描模式下，选择强度最高的两个子离子作为定性与定量离子，并通过系列碰撞能量的优化，确定各子离子最佳的碰撞能量。
3.3 方法学考察
3.3.1 线性范围和基质效应 在比较标准溶液和空白样品加标溶液的响应值时发现，7种抗球虫药物均存在不同程度的离子抑制现象，其中最严重的常山酮高达30%～40%。为了克服基质效应的影响，制备了基质匹配标准曲线进行线性范围的验证。取空白样品按照2.3节的步骤进行处理，并在洗脱液中加入混合标准工作液，吹干并复溶，得到浓度为5， 10， 50， 100， 250和500 μg/L的系列基质匹配标准溶液，然后按照2.4节所确定的条件进行分析，线性回归相关结果见表2。从表2可见，7种抗球虫药物的相关系数（R2）均大于0.99，表明其在5～500 μg/L浓度范围内线性关系良好。
3.3.2 灵敏度与特异性 制备一系列不同浓度的空白加标样品，按照所确定的方法进行检测，以信噪比S/N=3的样品浓度为方法检出限（LOD），以信噪比S/N=10的样品浓度为方法定量限（LOQ）。具体结果见表2，方法的检出限和定量限远低于最高残留限量。对于方法特异性的考察，分析了不同来源的20份空白样品，空白样品质量色谱图在被测化合物保留时间附近没有发现明显的杂峰，表明基质干扰小，特异性满足药物残留分析的要求。
3.3.3 回收率与精密度 在鸡的皮脂组织中进行3个浓度水平（LOQ、5倍LOQ、10倍LOQ）的空白样品加标回收实验，每个浓度6个平行样品，进行3个批次的样品分析，计算回收率、日内变异系数和日间变异系数，结果如表3所示。7种抗球虫药的日内平均回收率在75.7%～108.0%之间，日内相对标准偏差<12.8%；日间平均回收率在75.4%～96.3%之间，日间相对标准偏差<13.4%，表明方法的回收率高，稳定性好。空白样品和LOQ浓度水平的空白加标样品的质量色谱图见图3。
3.4 实际样品的检测
运用本方法对市场上随机购买的80份鸡皮及脂肪样品进行检测，其中2个样品呈阳性，均为莫能菌素，含量分别为51.6和87.1 μg/kg，低于最高残留限量。结果表明， 本方法具有稳定性好、简单快速、经济等特点，适用于鸡皮及脂肪组织中抗球虫药物的确证检测。
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