激光剥蚀 电感耦合等离子体质谱法原位分析印度芥菜中Cd、P、S、Cu等7种元素
杨红霞+赵令浩+高津旭+刘崴+李冰??
摘 要 建立了茎中7种元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的LA ICP MS原位分析及二维成像方法，并研究了其在镉富集型印度芥菜茎中的分布特征。印度芥菜经50
SymbolmA@ mol/L Cd处理14 d后，利用包埋剂包埋，冷冻切片后，用Nd：YAG laser（213 nm）器扫描，激光剥蚀 电感耦合等离子体质谱法（ICP MS）测定各元素强度，同时选择13C作为内标元素，对各元素强度进行标准化处理。结果表明，在富集型印度芥菜茎部，Cd大量积聚于由韧皮部与木质部组成的维管组织中，除此以外，茎的韧皮部细胞中及表皮层也分布着大量的Cd。7种元素的分布相关性表明，Cd与Ca具有相似的分布规律，而K和Ca， P和S的分布呈显著正相关。说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收，且具有相似的运输机制。本研究建立的元素原位分析方法证明LA ICP MS在植物样品中元素空间分布的研究方面具有很大的潜力。
关键词 激光剥蚀 电感耦合等离子体质谱法； 印度芥菜； 原位分析； 镉； 磷
1 引 言
近年来，研究重金属在植物细胞中的微区分布渐渐成为探索植物耐性机理的热点，基于同步辐射微区XRF是原位分析Cd的有力工具，Isaure等[1]利用SRXRF分析生长在Cd 污染土壤的Arabidopsis thaliana叶片，发现Cd主要分布在叶片的毛状体。Fukuda等[2]在Cd超积累植物Arabidopsis halleri的叶片同样发现Cd 也分布在毛状体上，并且Zn和Mn的分布与Cd相似。但Küpper等[3]利用SEM EDX研究却发现Cd主要分布在Arabidopsis halleri的叶肉细胞。近年来也有研究将LA ICPMS应用于生物样品的测试的报道，尽管具有缺乏植物激光固体标准校准物质，而使用其它固体标样时，可能由于基体效应而影响测试结果，但当只需相对定量数据以便比较样品中不同元素分布情况时，激光剥蚀 电感耦合等离子体质谱法（LA ICP MS）被证明是一种有效的半定量分析方法[4～10]。Tian等[11]利用LA ICPMS技术结合荧光探针染色技术对超积累东南景天（HE）叶中Cd等元素的分布特征进行原位分析。结果表明，Cd在维管组织和上皮层较高，而下表皮的分布相对较低；Zn主要分布在上下表皮细胞中。
理想的样品无损处理技术应能利用最小的样品量对污染物暴露情况进行准确且有代表性评价[12]，将LA ICPMS应用于生物介质中微量元素分析具有很大潜力，目前在该领域中的应用多集中于环形生长结构， 如树环[13]、软体动物壳[14，15]和鱼耳石[16]。本研究采用LA ICPMS建立了茎中7种元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的原位微区分析及二维成像方法，并研究了其在Cd富集型印度芥菜茎中的分布特征。从细胞水平上揭示超积累植物中Cd 的转运和富集规律。
2 实验部分
2.1 仪器条件与参数
LA ICP MS分析采用Element II高分辨率质谱（ThermoFisher公司）及UP213 Nd：YAG深紫外激光烧蚀系统（New Wave），采用NIST612进行仪器调节，氧化物产率（232Th16O+/232Th+）低于0.3%，有效降低氧化物对待测元素的干扰，激光剥蚀采用线扫方式，行与行的间隔为10
SymbolmA@ m。具体工作参数见表1。
2.2 植物培养
植物材料为富集型印度芥菜，印度芥菜种子（426308）由美国农业部种子资源库提供，种子进萌发后，播种于基质中，在基质中生长20 d，转移到1/4营养液预培养8 d，再采用全营养液培养。营养液组成为：Ca（NO3）2 2.00 mmol/L，KH2PO4 0.10 mmol/L，MgSO4 0.50 mmol/L，KCl 0.10 mmol/L，K2SO4 0.70 mmol/L， H3BO3 10.00 μmol/L，MnSO4 0.50 μmol/L，ZnSO4 1.0 μmol/L，CuSO4 0.20 μmol/L，（NH4）6Mo7O24 0.01 μmol/L，Fe EDTA 100 μmol/L。每天用0.1 mol/L HCl 或者0.1 mol/L NaOH 调营养液至pH≈5.8，保持全天候通气，每3 d换一次营养液。植物在温室自然光条件下培养，日夜温度分别为26/20 oC，湿度为70%/85%。在全营养液中培养8 d后，进行Cd处理，共设2个处理水平： ①CK（完全营养液），②25
2.3 样品处理
取预培养10 d后的印度芥菜苗，添加25 μmol/L Cd处理，每个处理重复3次。Cd处理14 d后，切下植株的成熟叶片，用液氮固定，利用包埋剂包埋好后，在
Symbolm@@ 30 ℃的环境下利用冷冻切片机制成切片（60 μm厚）。 在30 ℃条件下冷冻干燥3 d。取出干燥后的样品，在显微镜下拍照。
2.4 数据处理
采用Origin 8.1软件进行数据处理及相关统计分析。
3 结果与分析
3.1 内标元素
为了补偿激光剥蚀进样量不均匀对信号强度的影响，选择13C作为内标元素，对各元素强度进行标准化处理。在生物基体样品中，不同组织结构13C含量具有一定差异，本实验对样品13C监测结果显示，信号波动RSD值仅为4.1%，其在不同组织结构中含量基本一致，不会对结论造成影响。
3.2 镉与其它元素在茎中的分布
为获得印度芥菜茎中元素分布的二维图像，整个茎样品置于激光剥蚀样品池内，激光束扫描后，信号被输送到ICP MS中检测。各元素强度经软件处理并成像。积累型印度芥菜茎中7种元素分布如图1所示，红色表示元素的含量高，而紫色则表示含量较低。
由图1可见，各元素在茎中有不同的分布特点。在植物茎组织切片中，几乎所有元素在维管组织及其周围细胞中分布较高，Cd大量积聚于由韧皮部与木质部组成的维管组织中，在表皮与皮层中Cd浓度也较高，但在由大量薄壁细胞组成的中间薄壁组织中分布较少，其它元素则与Cd分布特征相似。对比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在茎内部的薄壁细胞中也有一定程度的分布，但K的含量要远高于其它元素，这表明K有很强的木质部运输和卸载的能力，与目前普遍认为的K 是植物体移动能力很强的大量元素这一观点一致。
3.3 元素分布的相关性分析
茎中相关性结果分析表明，Cd与P， S， K， Ca强度分布呈正相关（R2>0.3，样品数n=5400， 图2），而K与Ca 呈显著正相关（r2=0.75，样品数n=5400，图2c），P和S呈显著正相关（R2=0.5323，样品数n=5400， 图3）。Cd与Ca具有相似的分布规律，可能与二者离子半径相近、化学性质相似有关。而K， Ca， P和S的分布呈显著正相关，说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
4 结 论
本实验采用LA ICP MS质谱技术原位分析了富集型印度芥菜茎中7种元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情况，通过定量分析软件和二维成像软件得到Cd等元素在细胞组织中的二维分布图像，建立了LA ICP MS定量分析植物细胞中元素分布的微区二维成像方法。双聚焦高分辨ICP MS与LA联用技术具有分辨率高、可多元素且可选择不同同位素同时测定、可实现相对定量的优势，是研究植物组织中元素微区分布的强有力成像技术，在植物毒理学研究方面具有很大的潜力[17]。
要解除过量重金属对植物可能的毒害，植物需要在细胞中找到一个合适的地方将其固定下来并永久储存[18]。本研究表明，Cd优先储存在由韧皮部与木质部组成的维管组织中，维管系统中的重金属一般被认为是与木质部运输及其向叶片中的转运有关[19]。在富集型印度芥菜茎中Cd的这种分布形式表明可能有相当数量的Cd主要通过木质部导管运输。除此以外，茎的韧皮部细胞中还分布着大量的Cd，表明可能有相当量的Cd可以通过韧皮部转运重新在植物组织中分配。另外，在茎的表皮与皮层中Cd浓度也较高，由此可见，叶肉细胞、茎的表皮在应对累积的重金属过程中也同样发挥着重要作用。元素分布的相关性说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
References
1 Isaure M P， Fayard B， Sarret G， Painis S， Bourguignon J.Spectrochimica Acta Part B： Atomic Spectroscopy，2006， 61（12）： 1242-1252
2 Fukuda N， Hokura A， Kitajima N， Terada Y， Saito H， Abe T， Nakai I.J. Anal. At. Spectrom.， 2008， 23（8）： 1068-1075
3 Küpper H， Lombi E， Zhao F J， McGrath S P.Planta， 2000， 212（1）： 75-84
4 Perkins W T， Fuge R， Pearce N J G.J. Anal. At. Spectrom.， 1991， 6： 445-449
5 SUN Xiao Hong， HU Ming Yue， LIU Cheng Lin， JIAO Peng Cheng， MA Li Chun， WANG Xin， ZHAN Xiu Chun.Chinese J. Anal.Chem.， 2013， 41（2）： 235-241
孙小虹， 胡明月， 刘成林， 焦鹏程， 马黎春， 王 鑫， 詹秀春. 分析化学， 2013， 41（2）： 235-241
6 Becker J S， Matusch A， Depboylu C， Dobrowolska J， Zoriy M V.Anal. Chem.， 2007， 79（16）： 6074-6080
7 Becker J S， Zoriy M， Matusch A， Wu B， Salber D， Palm C， Becker J S.Mass Spectrom.， 2010， Rev 29： 156-175
8 Pozebon D， Dressler V L， Mesko M F， Matusch A， Becker J S.J. Anal. At. Spectrom.， 2010， 25（11）： 1739-1744
9 WANG Ying， GUO Yan Li， YUAN Hong Lin， WEI Yong Feng， YAN Hong Tao， CHEN Hui Hui.Spectroscopy and Spectral Analysis， 2012， 32（1）： 223-228
王 颖， 郭艳丽， 袁洪林， 魏永锋， 闫宏涛， 陈慧慧. 光谱学与光谱分析， 2012， 32（1）： 223-228
10 Hare D， Reedy B， Grimm R， Wilkins S， Volitakis I， George J L， Cherny R A， Bush A I， Finkelstein D I， Doble P.Metallomics， 2009， 1（1）： 53-58
11 Tian S K， Lu L L， Labavitch J， Yang X E， He Z L， Hu H， Sarangi R， Newville M， Commisso J， Brown P.Plant Physiology， 2011， 157： 1914-1925
12 Brian P J， Willim A H， Jennifer B.Environ. Sci. Technol.， 2003， 37： 2511-2515
13 Watmough S A， Hutchinson T C， Evans R. D.Environ. Sci.Technol. 1997， 31： 114-118
14 Price G D， Pearce N J G.Mar. Pollut. Bull.，1997， 34， 1025-1031
15 Toland H， Perkins B， Pearce N， Keenan F， Leng M. J.J. Anal. At. Spectrom.， 2000， 15： 1143-1148
16 Thorrold S R， Shuttleworth S.Can. J. Fish. Aquat. Sci.，2000， 57： 1232-1242
17 Siebold M， Leidich P， Bertini M， Deflorio G， Feldmann J， Krupp E M， Halmschlager E， Woodward S.Anal. Bioanal. Chem， 2012， 402： 3323-3331
18 Brooks R R.CAB International， New York. 1998： 55-94
19 McNear D H， Peltier E， Everhart J， Chaney R L， Sutton S， Newville M， rivers M， Sparks D L.Environmental Science & Technology， 2005， 39（7）： 2210-2218
由图1可见，各元素在茎中有不同的分布特点。在植物茎组织切片中，几乎所有元素在维管组织及其周围细胞中分布较高，Cd大量积聚于由韧皮部与木质部组成的维管组织中，在表皮与皮层中Cd浓度也较高，但在由大量薄壁细胞组成的中间薄壁组织中分布较少，其它元素则与Cd分布特征相似。对比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在茎内部的薄壁细胞中也有一定程度的分布，但K的含量要远高于其它元素，这表明K有很强的木质部运输和卸载的能力，与目前普遍认为的K 是植物体移动能力很强的大量元素这一观点一致。
3.3 元素分布的相关性分析
茎中相关性结果分析表明，Cd与P， S， K， Ca强度分布呈正相关（R2>0.3，样品数n=5400， 图2），而K与Ca 呈显著正相关（r2=0.75，样品数n=5400，图2c），P和S呈显著正相关（R2=0.5323，样品数n=5400， 图3）。Cd与Ca具有相似的分布规律，可能与二者离子半径相近、化学性质相似有关。而K， Ca， P和S的分布呈显著正相关，说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
4 结 论
本实验采用LA ICP MS质谱技术原位分析了富集型印度芥菜茎中7种元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情况，通过定量分析软件和二维成像软件得到Cd等元素在细胞组织中的二维分布图像，建立了LA ICP MS定量分析植物细胞中元素分布的微区二维成像方法。双聚焦高分辨ICP MS与LA联用技术具有分辨率高、可多元素且可选择不同同位素同时测定、可实现相对定量的优势，是研究植物组织中元素微区分布的强有力成像技术，在植物毒理学研究方面具有很大的潜力[17]。
要解除过量重金属对植物可能的毒害，植物需要在细胞中找到一个合适的地方将其固定下来并永久储存[18]。本研究表明，Cd优先储存在由韧皮部与木质部组成的维管组织中，维管系统中的重金属一般被认为是与木质部运输及其向叶片中的转运有关[19]。在富集型印度芥菜茎中Cd的这种分布形式表明可能有相当数量的Cd主要通过木质部导管运输。除此以外，茎的韧皮部细胞中还分布着大量的Cd，表明可能有相当量的Cd可以通过韧皮部转运重新在植物组织中分配。另外，在茎的表皮与皮层中Cd浓度也较高，由此可见，叶肉细胞、茎的表皮在应对累积的重金属过程中也同样发挥着重要作用。元素分布的相关性说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
References
1 Isaure M P， Fayard B， Sarret G， Painis S， Bourguignon J.Spectrochimica Acta Part B： Atomic Spectroscopy，2006， 61（12）： 1242-1252
2 Fukuda N， Hokura A， Kitajima N， Terada Y， Saito H， Abe T， Nakai I.J. Anal. At. Spectrom.， 2008， 23（8）： 1068-1075
3 Küpper H， Lombi E， Zhao F J， McGrath S P.Planta， 2000， 212（1）： 75-84
4 Perkins W T， Fuge R， Pearce N J G.J. Anal. At. Spectrom.， 1991， 6： 445-449
5 SUN Xiao Hong， HU Ming Yue， LIU Cheng Lin， JIAO Peng Cheng， MA Li Chun， WANG Xin， ZHAN Xiu Chun.Chinese J. Anal.Chem.， 2013， 41（2）： 235-241
孙小虹， 胡明月， 刘成林， 焦鹏程， 马黎春， 王 鑫， 詹秀春. 分析化学， 2013， 41（2）： 235-241
6 Becker J S， Matusch A， Depboylu C， Dobrowolska J， Zoriy M V.Anal. Chem.， 2007， 79（16）： 6074-6080
7 Becker J S， Zoriy M， Matusch A， Wu B， Salber D， Palm C， Becker J S.Mass Spectrom.， 2010， Rev 29： 156-175
8 Pozebon D， Dressler V L， Mesko M F， Matusch A， Becker J S.J. Anal. At. Spectrom.， 2010， 25（11）： 1739-1744
9 WANG Ying， GUO Yan Li， YUAN Hong Lin， WEI Yong Feng， YAN Hong Tao， CHEN Hui Hui.Spectroscopy and Spectral Analysis， 2012， 32（1）： 223-228
王 颖， 郭艳丽， 袁洪林， 魏永锋， 闫宏涛， 陈慧慧. 光谱学与光谱分析， 2012， 32（1）： 223-228
10 Hare D， Reedy B， Grimm R， Wilkins S， Volitakis I， George J L， Cherny R A， Bush A I， Finkelstein D I， Doble P.Metallomics， 2009， 1（1）： 53-58
11 Tian S K， Lu L L， Labavitch J， Yang X E， He Z L， Hu H， Sarangi R， Newville M， Commisso J， Brown P.Plant Physiology， 2011， 157： 1914-1925
12 Brian P J， Willim A H， Jennifer B.Environ. Sci. Technol.， 2003， 37： 2511-2515
13 Watmough S A， Hutchinson T C， Evans R. D.Environ. Sci.Technol. 1997， 31： 114-118
14 Price G D， Pearce N J G.Mar. Pollut. Bull.，1997， 34， 1025-1031
15 Toland H， Perkins B， Pearce N， Keenan F， Leng M. J.J. Anal. At. Spectrom.， 2000， 15： 1143-1148
16 Thorrold S R， Shuttleworth S.Can. J. Fish. Aquat. Sci.，2000， 57： 1232-1242
17 Siebold M， Leidich P， Bertini M， Deflorio G， Feldmann J， Krupp E M， Halmschlager E， Woodward S.Anal. Bioanal. Chem， 2012， 402： 3323-3331
18 Brooks R R.CAB International， New York. 1998： 55-94
19 McNear D H， Peltier E， Everhart J， Chaney R L， Sutton S， Newville M， rivers M， Sparks D L.Environmental Science & Technology， 2005， 39（7）： 2210-2218
由图1可见，各元素在茎中有不同的分布特点。在植物茎组织切片中，几乎所有元素在维管组织及其周围细胞中分布较高，Cd大量积聚于由韧皮部与木质部组成的维管组织中，在表皮与皮层中Cd浓度也较高，但在由大量薄壁细胞组成的中间薄壁组织中分布较少，其它元素则与Cd分布特征相似。对比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在茎内部的薄壁细胞中也有一定程度的分布，但K的含量要远高于其它元素，这表明K有很强的木质部运输和卸载的能力，与目前普遍认为的K 是植物体移动能力很强的大量元素这一观点一致。
3.3 元素分布的相关性分析
茎中相关性结果分析表明，Cd与P， S， K， Ca强度分布呈正相关（R2>0.3，样品数n=5400， 图2），而K与Ca 呈显著正相关（r2=0.75，样品数n=5400，图2c），P和S呈显著正相关（R2=0.5323，样品数n=5400， 图3）。Cd与Ca具有相似的分布规律，可能与二者离子半径相近、化学性质相似有关。而K， Ca， P和S的分布呈显著正相关，说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
4 结 论
本实验采用LA ICP MS质谱技术原位分析了富集型印度芥菜茎中7种元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情况，通过定量分析软件和二维成像软件得到Cd等元素在细胞组织中的二维分布图像，建立了LA ICP MS定量分析植物细胞中元素分布的微区二维成像方法。双聚焦高分辨ICP MS与LA联用技术具有分辨率高、可多元素且可选择不同同位素同时测定、可实现相对定量的优势，是研究植物组织中元素微区分布的强有力成像技术，在植物毒理学研究方面具有很大的潜力[17]。
要解除过量重金属对植物可能的毒害，植物需要在细胞中找到一个合适的地方将其固定下来并永久储存[18]。本研究表明，Cd优先储存在由韧皮部与木质部组成的维管组织中，维管系统中的重金属一般被认为是与木质部运输及其向叶片中的转运有关[19]。在富集型印度芥菜茎中Cd的这种分布形式表明可能有相当数量的Cd主要通过木质部导管运输。除此以外，茎的韧皮部细胞中还分布着大量的Cd，表明可能有相当量的Cd可以通过韧皮部转运重新在植物组织中分配。另外，在茎的表皮与皮层中Cd浓度也较高，由此可见，叶肉细胞、茎的表皮在应对累积的重金属过程中也同样发挥着重要作用。元素分布的相关性说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
References
1 Isaure M P， Fayard B， Sarret G， Painis S， Bourguignon J.Spectrochimica Acta Part B： Atomic Spectroscopy，2006， 61（12）： 1242-1252
2 Fukuda N， Hokura A， Kitajima N， Terada Y， Saito H， Abe T， Nakai I.J. Anal. At. Spectrom.， 2008， 23（8）： 1068-1075
3 Küpper H， Lombi E， Zhao F J， McGrath S P.Planta， 2000， 212（1）： 75-84
4 Perkins W T， Fuge R， Pearce N J G.J. Anal. At. Spectrom.， 1991， 6： 445-449
5 SUN Xiao Hong， HU Ming Yue， LIU Cheng Lin， JIAO Peng Cheng， MA Li Chun， WANG Xin， ZHAN Xiu Chun.Chinese J. Anal.Chem.， 2013， 41（2）： 235-241
孙小虹， 胡明月， 刘成林， 焦鹏程， 马黎春， 王 鑫， 詹秀春. 分析化学， 2013， 41（2）： 235-241
6 Becker J S， Matusch A， Depboylu C， Dobrowolska J， Zoriy M V.Anal. Chem.， 2007， 79（16）： 6074-6080
7 Becker J S， Zoriy M， Matusch A， Wu B， Salber D， Palm C， Becker J S.Mass Spectrom.， 2010， Rev 29： 156-175
8 Pozebon D， Dressler V L， Mesko M F， Matusch A， Becker J S.J. Anal. At. Spectrom.， 2010， 25（11）： 1739-1744
9 WANG Ying， GUO Yan Li， YUAN Hong Lin， WEI Yong Feng， YAN Hong Tao， CHEN Hui Hui.Spectroscopy and Spectral Analysis， 2012， 32（1）： 223-228
王 颖， 郭艳丽， 袁洪林， 魏永锋， 闫宏涛， 陈慧慧. 光谱学与光谱分析， 2012， 32（1）： 223-228
10 Hare D， Reedy B， Grimm R， Wilkins S， Volitakis I， George J L， Cherny R A， Bush A I， Finkelstein D I， Doble P.Metallomics， 2009， 1（1）： 53-58
11 Tian S K， Lu L L， Labavitch J， Yang X E， He Z L， Hu H， Sarangi R， Newville M， Commisso J， Brown P.Plant Physiology， 2011， 157： 1914-1925
12 Brian P J， Willim A H， Jennifer B.Environ. Sci. Technol.， 2003， 37： 2511-2515
13 Watmough S A， Hutchinson T C， Evans R. D.Environ. Sci.Technol. 1997， 31： 114-118
14 Price G D， Pearce N J G.Mar. Pollut. Bull.，1997， 34， 1025-1031
15 Toland H， Perkins B， Pearce N， Keenan F， Leng M. J.J. Anal. At. Spectrom.， 2000， 15： 1143-1148
16 Thorrold S R， Shuttleworth S.Can. J. Fish. Aquat. Sci.，2000， 57： 1232-1242
17 Siebold M， Leidich P， Bertini M， Deflorio G， Feldmann J， Krupp E M， Halmschlager E， Woodward S.Anal. Bioanal. Chem， 2012， 402： 3323-3331
18 Brooks R R.CAB International， New York. 1998： 55-94
19 McNear D H， Peltier E， Everhart J， Chaney R L， Sutton S， Newville M， rivers M， Sparks D L.Environmental Science & Technology， 2005， 39（7）： 2210-2218
摘 要 建立了茎中7种元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的LA ICP MS原位分析及二维成像方法，并研究了其在镉富集型印度芥菜茎中的分布特征。印度芥菜经50
SymbolmA@ mol/L Cd处理14 d后，利用包埋剂包埋，冷冻切片后，用Nd：YAG laser（213 nm）器扫描，激光剥蚀 电感耦合等离子体质谱法（ICP MS）测定各元素强度，同时选择13C作为内标元素，对各元素强度进行标准化处理。结果表明，在富集型印度芥菜茎部，Cd大量积聚于由韧皮部与木质部组成的维管组织中，除此以外，茎的韧皮部细胞中及表皮层也分布着大量的Cd。7种元素的分布相关性表明，Cd与Ca具有相似的分布规律，而K和Ca， P和S的分布呈显著正相关。说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收，且具有相似的运输机制。本研究建立的元素原位分析方法证明LA ICP MS在植物样品中元素空间分布的研究方面具有很大的潜力。
关键词 激光剥蚀 电感耦合等离子体质谱法； 印度芥菜； 原位分析； 镉； 磷
1 引 言
近年来，研究重金属在植物细胞中的微区分布渐渐成为探索植物耐性机理的热点，基于同步辐射微区XRF是原位分析Cd的有力工具，Isaure等[1]利用SRXRF分析生长在Cd 污染土壤的Arabidopsis thaliana叶片，发现Cd主要分布在叶片的毛状体。Fukuda等[2]在Cd超积累植物Arabidopsis halleri的叶片同样发现Cd 也分布在毛状体上，并且Zn和Mn的分布与Cd相似。但Küpper等[3]利用SEM EDX研究却发现Cd主要分布在Arabidopsis halleri的叶肉细胞。近年来也有研究将LA ICPMS应用于生物样品的测试的报道，尽管具有缺乏植物激光固体标准校准物质，而使用其它固体标样时，可能由于基体效应而影响测试结果，但当只需相对定量数据以便比较样品中不同元素分布情况时，激光剥蚀 电感耦合等离子体质谱法（LA ICP MS）被证明是一种有效的半定量分析方法[4～10]。Tian等[11]利用LA ICPMS技术结合荧光探针染色技术对超积累东南景天（HE）叶中Cd等元素的分布特征进行原位分析。结果表明，Cd在维管组织和上皮层较高，而下表皮的分布相对较低；Zn主要分布在上下表皮细胞中。
理想的样品无损处理技术应能利用最小的样品量对污染物暴露情况进行准确且有代表性评价[12]，将LA ICPMS应用于生物介质中微量元素分析具有很大潜力，目前在该领域中的应用多集中于环形生长结构， 如树环[13]、软体动物壳[14，15]和鱼耳石[16]。本研究采用LA ICPMS建立了茎中7种元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的原位微区分析及二维成像方法，并研究了其在Cd富集型印度芥菜茎中的分布特征。从细胞水平上揭示超积累植物中Cd 的转运和富集规律。
2 实验部分
2.1 仪器条件与参数
LA ICP MS分析采用Element II高分辨率质谱（ThermoFisher公司）及UP213 Nd：YAG深紫外激光烧蚀系统（New Wave），采用NIST612进行仪器调节，氧化物产率（232Th16O+/232Th+）低于0.3%，有效降低氧化物对待测元素的干扰，激光剥蚀采用线扫方式，行与行的间隔为10
SymbolmA@ m。具体工作参数见表1。
2.2 植物培养
植物材料为富集型印度芥菜，印度芥菜种子（426308）由美国农业部种子资源库提供，种子进萌发后，播种于基质中，在基质中生长20 d，转移到1/4营养液预培养8 d，再采用全营养液培养。营养液组成为：Ca（NO3）2 2.00 mmol/L，KH2PO4 0.10 mmol/L，MgSO4 0.50 mmol/L，KCl 0.10 mmol/L，K2SO4 0.70 mmol/L， H3BO3 10.00 μmol/L，MnSO4 0.50 μmol/L，ZnSO4 1.0 μmol/L，CuSO4 0.20 μmol/L，（NH4）6Mo7O24 0.01 μmol/L，Fe EDTA 100 μmol/L。每天用0.1 mol/L HCl 或者0.1 mol/L NaOH 调营养液至pH≈5.8，保持全天候通气，每3 d换一次营养液。植物在温室自然光条件下培养，日夜温度分别为26/20 oC，湿度为70%/85%。在全营养液中培养8 d后，进行Cd处理，共设2个处理水平： ①CK（完全营养液），②25
2.3 样品处理
取预培养10 d后的印度芥菜苗，添加25 μmol/L Cd处理，每个处理重复3次。Cd处理14 d后，切下植株的成熟叶片，用液氮固定，利用包埋剂包埋好后，在
Symbolm@@ 30 ℃的环境下利用冷冻切片机制成切片（60 μm厚）。 在30 ℃条件下冷冻干燥3 d。取出干燥后的样品，在显微镜下拍照。
2.4 数据处理
采用Origin 8.1软件进行数据处理及相关统计分析。
3 结果与分析
3.1 内标元素
为了补偿激光剥蚀进样量不均匀对信号强度的影响，选择13C作为内标元素，对各元素强度进行标准化处理。在生物基体样品中，不同组织结构13C含量具有一定差异，本实验对样品13C监测结果显示，信号波动RSD值仅为4.1%，其在不同组织结构中含量基本一致，不会对结论造成影响。
3.2 镉与其它元素在茎中的分布
为获得印度芥菜茎中元素分布的二维图像，整个茎样品置于激光剥蚀样品池内，激光束扫描后，信号被输送到ICP MS中检测。各元素强度经软件处理并成像。积累型印度芥菜茎中7种元素分布如图1所示，红色表示元素的含量高，而紫色则表示含量较低。
由图1可见，各元素在茎中有不同的分布特点。在植物茎组织切片中，几乎所有元素在维管组织及其周围细胞中分布较高，Cd大量积聚于由韧皮部与木质部组成的维管组织中，在表皮与皮层中Cd浓度也较高，但在由大量薄壁细胞组成的中间薄壁组织中分布较少，其它元素则与Cd分布特征相似。对比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在茎内部的薄壁细胞中也有一定程度的分布，但K的含量要远高于其它元素，这表明K有很强的木质部运输和卸载的能力，与目前普遍认为的K 是植物体移动能力很强的大量元素这一观点一致。
3.3 元素分布的相关性分析
茎中相关性结果分析表明，Cd与P， S， K， Ca强度分布呈正相关（R2>0.3，样品数n=5400， 图2），而K与Ca 呈显著正相关（r2=0.75，样品数n=5400，图2c），P和S呈显著正相关（R2=0.5323，样品数n=5400， 图3）。Cd与Ca具有相似的分布规律，可能与二者离子半径相近、化学性质相似有关。而K， Ca， P和S的分布呈显著正相关，说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
4 结 论
本实验采用LA ICP MS质谱技术原位分析了富集型印度芥菜茎中7种元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情况，通过定量分析软件和二维成像软件得到Cd等元素在细胞组织中的二维分布图像，建立了LA ICP MS定量分析植物细胞中元素分布的微区二维成像方法。双聚焦高分辨ICP MS与LA联用技术具有分辨率高、可多元素且可选择不同同位素同时测定、可实现相对定量的优势，是研究植物组织中元素微区分布的强有力成像技术，在植物毒理学研究方面具有很大的潜力[17]。
要解除过量重金属对植物可能的毒害，植物需要在细胞中找到一个合适的地方将其固定下来并永久储存[18]。本研究表明，Cd优先储存在由韧皮部与木质部组成的维管组织中，维管系统中的重金属一般被认为是与木质部运输及其向叶片中的转运有关[19]。在富集型印度芥菜茎中Cd的这种分布形式表明可能有相当数量的Cd主要通过木质部导管运输。除此以外，茎的韧皮部细胞中还分布着大量的Cd，表明可能有相当量的Cd可以通过韧皮部转运重新在植物组织中分配。另外，在茎的表皮与皮层中Cd浓度也较高，由此可见，叶肉细胞、茎的表皮在应对累积的重金属过程中也同样发挥着重要作用。元素分布的相关性说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
References
1 Isaure M P， Fayard B， Sarret G， Painis S， Bourguignon J.Spectrochimica Acta Part B： Atomic Spectroscopy，2006， 61（12）： 1242-1252
2 Fukuda N， Hokura A， Kitajima N， Terada Y， Saito H， Abe T， Nakai I.J. Anal. At. Spectrom.， 2008， 23（8）： 1068-1075
3 Küpper H， Lombi E， Zhao F J， McGrath S P.Planta， 2000， 212（1）： 75-84
4 Perkins W T， Fuge R， Pearce N J G.J. Anal. At. Spectrom.， 1991， 6： 445-449
5 SUN Xiao Hong， HU Ming Yue， LIU Cheng Lin， JIAO Peng Cheng， MA Li Chun， WANG Xin， ZHAN Xiu Chun.Chinese J. Anal.Chem.， 2013， 41（2）： 235-241
孙小虹， 胡明月， 刘成林， 焦鹏程， 马黎春， 王 鑫， 詹秀春. 分析化学， 2013， 41（2）： 235-241
6 Becker J S， Matusch A， Depboylu C， Dobrowolska J， Zoriy M V.Anal. Chem.， 2007， 79（16）： 6074-6080
7 Becker J S， Zoriy M， Matusch A， Wu B， Salber D， Palm C， Becker J S.Mass Spectrom.， 2010， Rev 29： 156-175
8 Pozebon D， Dressler V L， Mesko M F， Matusch A， Becker J S.J. Anal. At. Spectrom.， 2010， 25（11）： 1739-1744
9 WANG Ying， GUO Yan Li， YUAN Hong Lin， WEI Yong Feng， YAN Hong Tao， CHEN Hui Hui.Spectroscopy and Spectral Analysis， 2012， 32（1）： 223-228
王 颖， 郭艳丽， 袁洪林， 魏永锋， 闫宏涛， 陈慧慧. 光谱学与光谱分析， 2012， 32（1）： 223-228
10 Hare D， Reedy B， Grimm R， Wilkins S， Volitakis I， George J L， Cherny R A， Bush A I， Finkelstein D I， Doble P.Metallomics， 2009， 1（1）： 53-58
11 Tian S K， Lu L L， Labavitch J， Yang X E， He Z L， Hu H， Sarangi R， Newville M， Commisso J， Brown P.Plant Physiology， 2011， 157： 1914-1925
12 Brian P J， Willim A H， Jennifer B.Environ. Sci. Technol.， 2003， 37： 2511-2515
13 Watmough S A， Hutchinson T C， Evans R. D.Environ. Sci.Technol. 1997， 31： 114-118
14 Price G D， Pearce N J G.Mar. Pollut. Bull.，1997， 34， 1025-1031
15 Toland H， Perkins B， Pearce N， Keenan F， Leng M. J.J. Anal. At. Spectrom.， 2000， 15： 1143-1148
16 Thorrold S R， Shuttleworth S.Can. J. Fish. Aquat. Sci.，2000， 57： 1232-1242
17 Siebold M， Leidich P， Bertini M， Deflorio G， Feldmann J， Krupp E M， Halmschlager E， Woodward S.Anal. Bioanal. Chem， 2012， 402： 3323-3331
18 Brooks R R.CAB International， New York. 1998： 55-94
19 McNear D H， Peltier E， Everhart J， Chaney R L， Sutton S， Newville M， rivers M， Sparks D L.Environmental Science & Technology， 2005， 39（7）： 2210-2218
由图1可见，各元素在茎中有不同的分布特点。在植物茎组织切片中，几乎所有元素在维管组织及其周围细胞中分布较高，Cd大量积聚于由韧皮部与木质部组成的维管组织中，在表皮与皮层中Cd浓度也较高，但在由大量薄壁细胞组成的中间薄壁组织中分布较少，其它元素则与Cd分布特征相似。对比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在茎内部的薄壁细胞中也有一定程度的分布，但K的含量要远高于其它元素，这表明K有很强的木质部运输和卸载的能力，与目前普遍认为的K 是植物体移动能力很强的大量元素这一观点一致。
3.3 元素分布的相关性分析
茎中相关性结果分析表明，Cd与P， S， K， Ca强度分布呈正相关（R2>0.3，样品数n=5400， 图2），而K与Ca 呈显著正相关（r2=0.75，样品数n=5400，图2c），P和S呈显著正相关（R2=0.5323，样品数n=5400， 图3）。Cd与Ca具有相似的分布规律，可能与二者离子半径相近、化学性质相似有关。而K， Ca， P和S的分布呈显著正相关，说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
4 结 论
本实验采用LA ICP MS质谱技术原位分析了富集型印度芥菜茎中7种元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情况，通过定量分析软件和二维成像软件得到Cd等元素在细胞组织中的二维分布图像，建立了LA ICP MS定量分析植物细胞中元素分布的微区二维成像方法。双聚焦高分辨ICP MS与LA联用技术具有分辨率高、可多元素且可选择不同同位素同时测定、可实现相对定量的优势，是研究植物组织中元素微区分布的强有力成像技术，在植物毒理学研究方面具有很大的潜力[17]。
要解除过量重金属对植物可能的毒害，植物需要在细胞中找到一个合适的地方将其固定下来并永久储存[18]。本研究表明，Cd优先储存在由韧皮部与木质部组成的维管组织中，维管系统中的重金属一般被认为是与木质部运输及其向叶片中的转运有关[19]。在富集型印度芥菜茎中Cd的这种分布形式表明可能有相当数量的Cd主要通过木质部导管运输。除此以外，茎的韧皮部细胞中还分布着大量的Cd，表明可能有相当量的Cd可以通过韧皮部转运重新在植物组织中分配。另外，在茎的表皮与皮层中Cd浓度也较高，由此可见，叶肉细胞、茎的表皮在应对累积的重金属过程中也同样发挥着重要作用。元素分布的相关性说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
References
1 Isaure M P， Fayard B， Sarret G， Painis S， Bourguignon J.Spectrochimica Acta Part B： Atomic Spectroscopy，2006， 61（12）： 1242-1252
2 Fukuda N， Hokura A， Kitajima N， Terada Y， Saito H， Abe T， Nakai I.J. Anal. At. Spectrom.， 2008， 23（8）： 1068-1075
3 Küpper H， Lombi E， Zhao F J， McGrath S P.Planta， 2000， 212（1）： 75-84
4 Perkins W T， Fuge R， Pearce N J G.J. Anal. At. Spectrom.， 1991， 6： 445-449
5 SUN Xiao Hong， HU Ming Yue， LIU Cheng Lin， JIAO Peng Cheng， MA Li Chun， WANG Xin， ZHAN Xiu Chun.Chinese J. Anal.Chem.， 2013， 41（2）： 235-241
孙小虹， 胡明月， 刘成林， 焦鹏程， 马黎春， 王 鑫， 詹秀春. 分析化学， 2013， 41（2）： 235-241
6 Becker J S， Matusch A， Depboylu C， Dobrowolska J， Zoriy M V.Anal. Chem.， 2007， 79（16）： 6074-6080
7 Becker J S， Zoriy M， Matusch A， Wu B， Salber D， Palm C， Becker J S.Mass Spectrom.， 2010， Rev 29： 156-175
8 Pozebon D， Dressler V L， Mesko M F， Matusch A， Becker J S.J. Anal. At. Spectrom.， 2010， 25（11）： 1739-1744
9 WANG Ying， GUO Yan Li， YUAN Hong Lin， WEI Yong Feng， YAN Hong Tao， CHEN Hui Hui.Spectroscopy and Spectral Analysis， 2012， 32（1）： 223-228
王 颖， 郭艳丽， 袁洪林， 魏永锋， 闫宏涛， 陈慧慧. 光谱学与光谱分析， 2012， 32（1）： 223-228
10 Hare D， Reedy B， Grimm R， Wilkins S， Volitakis I， George J L， Cherny R A， Bush A I， Finkelstein D I， Doble P.Metallomics， 2009， 1（1）： 53-58
11 Tian S K， Lu L L， Labavitch J， Yang X E， He Z L， Hu H， Sarangi R， Newville M， Commisso J， Brown P.Plant Physiology， 2011， 157： 1914-1925
12 Brian P J， Willim A H， Jennifer B.Environ. Sci. Technol.， 2003， 37： 2511-2515
13 Watmough S A， Hutchinson T C， Evans R. D.Environ. Sci.Technol. 1997， 31： 114-118
14 Price G D， Pearce N J G.Mar. Pollut. Bull.，1997， 34， 1025-1031
15 Toland H， Perkins B， Pearce N， Keenan F， Leng M. J.J. Anal. At. Spectrom.， 2000， 15： 1143-1148
16 Thorrold S R， Shuttleworth S.Can. J. Fish. Aquat. Sci.，2000， 57： 1232-1242
17 Siebold M， Leidich P， Bertini M， Deflorio G， Feldmann J， Krupp E M， Halmschlager E， Woodward S.Anal. Bioanal. Chem， 2012， 402： 3323-3331
18 Brooks R R.CAB International， New York. 1998： 55-94
19 McNear D H， Peltier E， Everhart J， Chaney R L， Sutton S， Newville M， rivers M， Sparks D L.Environmental Science & Technology， 2005， 39（7）： 2210-2218
由图1可见，各元素在茎中有不同的分布特点。在植物茎组织切片中，几乎所有元素在维管组织及其周围细胞中分布较高，Cd大量积聚于由韧皮部与木质部组成的维管组织中，在表皮与皮层中Cd浓度也较高，但在由大量薄壁细胞组成的中间薄壁组织中分布较少，其它元素则与Cd分布特征相似。对比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在茎内部的薄壁细胞中也有一定程度的分布，但K的含量要远高于其它元素，这表明K有很强的木质部运输和卸载的能力，与目前普遍认为的K 是植物体移动能力很强的大量元素这一观点一致。
3.3 元素分布的相关性分析
茎中相关性结果分析表明，Cd与P， S， K， Ca强度分布呈正相关（R2>0.3，样品数n=5400， 图2），而K与Ca 呈显著正相关（r2=0.75，样品数n=5400，图2c），P和S呈显著正相关（R2=0.5323，样品数n=5400， 图3）。Cd与Ca具有相似的分布规律，可能与二者离子半径相近、化学性质相似有关。而K， Ca， P和S的分布呈显著正相关，说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
4 结 论
本实验采用LA ICP MS质谱技术原位分析了富集型印度芥菜茎中7种元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情况，通过定量分析软件和二维成像软件得到Cd等元素在细胞组织中的二维分布图像，建立了LA ICP MS定量分析植物细胞中元素分布的微区二维成像方法。双聚焦高分辨ICP MS与LA联用技术具有分辨率高、可多元素且可选择不同同位素同时测定、可实现相对定量的优势，是研究植物组织中元素微区分布的强有力成像技术，在植物毒理学研究方面具有很大的潜力[17]。
要解除过量重金属对植物可能的毒害，植物需要在细胞中找到一个合适的地方将其固定下来并永久储存[18]。本研究表明，Cd优先储存在由韧皮部与木质部组成的维管组织中，维管系统中的重金属一般被认为是与木质部运输及其向叶片中的转运有关[19]。在富集型印度芥菜茎中Cd的这种分布形式表明可能有相当数量的Cd主要通过木质部导管运输。除此以外，茎的韧皮部细胞中还分布着大量的Cd，表明可能有相当量的Cd可以通过韧皮部转运重新在植物组织中分配。另外，在茎的表皮与皮层中Cd浓度也较高，由此可见，叶肉细胞、茎的表皮在应对累积的重金属过程中也同样发挥着重要作用。元素分布的相关性说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其它元素的吸收。
References
1 Isaure M P， Fayard B， Sarret G， Painis S， Bourguignon J.Spectrochimica Acta Part B： Atomic Spectroscopy，2006， 61（12）： 1242-1252
2 Fukuda N， Hokura A， Kitajima N， Terada Y， Saito H， Abe T， Nakai I.J. Anal. At. Spectrom.， 2008， 23（8）： 1068-1075
3 Küpper H， Lombi E， Zhao F J， McGrath S P.Planta， 2000， 212（1）： 75-84
4 Perkins W T， Fuge R， Pearce N J G.J. Anal. At. Spectrom.， 1991， 6： 445-449
5 SUN Xiao Hong， HU Ming Yue， LIU Cheng Lin， JIAO Peng Cheng， MA Li Chun， WANG Xin， ZHAN Xiu Chun.Chinese J. Anal.Chem.， 2013， 41（2）： 235-241
孙小虹， 胡明月， 刘成林， 焦鹏程， 马黎春， 王 鑫， 詹秀春. 分析化学， 2013， 41（2）： 235-241
6 Becker J S， Matusch A， Depboylu C， Dobrowolska J， Zoriy M V.Anal. Chem.， 2007， 79（16）： 6074-6080
7 Becker J S， Zoriy M， Matusch A， Wu B， Salber D， Palm C， Becker J S.Mass Spectrom.， 2010， Rev 29： 156-175
8 Pozebon D， Dressler V L， Mesko M F， Matusch A， Becker J S.J. Anal. At. Spectrom.， 2010， 25（11）： 1739-1744
9 WANG Ying， GUO Yan Li， YUAN Hong Lin， WEI Yong Feng， YAN Hong Tao， CHEN Hui Hui.Spectroscopy and Spectral Analysis， 2012， 32（1）： 223-228
王 颖， 郭艳丽， 袁洪林， 魏永锋， 闫宏涛， 陈慧慧. 光谱学与光谱分析， 2012， 32（1）： 223-228
10 Hare D， Reedy B， Grimm R， Wilkins S， Volitakis I， George J L， Cherny R A， Bush A I， Finkelstein D I， Doble P.Metallomics， 2009， 1（1）： 53-58
11 Tian S K， Lu L L， Labavitch J， Yang X E， He Z L， Hu H， Sarangi R， Newville M， Commisso J， Brown P.Plant Physiology， 2011， 157： 1914-1925
12 Brian P J， Willim A H， Jennifer B.Environ. Sci. Technol.， 2003， 37： 2511-2515
13 Watmough S A， Hutchinson T C， Evans R. D.Environ. Sci.Technol. 1997， 31： 114-118
14 Price G D， Pearce N J G.Mar. Pollut. Bull.，1997， 34， 1025-1031
15 Toland H， Perkins B， Pearce N， Keenan F， Leng M. J.J. Anal. At. Spectrom.， 2000， 15： 1143-1148
16 Thorrold S R， Shuttleworth S.Can. J. Fish. Aquat. Sci.，2000， 57： 1232-1242
17 Siebold M， Leidich P， Bertini M， Deflorio G， Feldmann J， Krupp E M， Halmschlager E， Woodward S.Anal. Bioanal. Chem， 2012， 402： 3323-3331
18 Brooks R R.CAB International， New York. 1998： 55-94
19 McNear D H， Peltier E， Everhart J， Chaney R L， Sutton S， Newville M， rivers M， Sparks D L.Environmental Science & Technology， 2005， 39（7）： 2210-2218
