两种重组抗CD20人源化单克隆抗体定量分析方法的比较及其在药代动力学研究中的应用
邓承莲+邹佳+欧伦+董立厚+宋海峰
摘 要 采用酶联免疫吸附分析（ELISA）与基于Wil2 S细胞的流式细胞术（FCA）两种方法对生物基质中的重组抗CD20人源化单克隆抗体（rh anti CD20zumab）进行定量分析，并对两种方法进行系统比较。方法学验证结果表明，两种方法均具有良好的特异性、精密度和准确度，但定量范围存在明显差异。ELISA法批内和批间精密度均小于19.5%，准确度为二者定量范围分别为0.04～5.0 mg/L和3.1～200 mg/L，ELISA法的灵敏度显著高于FCA法。利用两种方法测定猕猴静脉滴注rh anti CD20zumab后的血药浓度 时间变化并进行药代动力学（PK）分析。结果表明，在给定剂量下，通过两种方法获得的PK结果具有良好的一致性。FCA法是一种细胞表面抗原靶向性抗体类药物PK研究及药效动力学（PD）研究的快捷、理想的方法。
关键词 抗CD20单克隆抗体；人源化；ELISA；流式细胞术；药代动力学
1 引 言
近年来，随着抗体药物应用的迅猛发展，该类药物的药代动力学（Pharmacokinetics，PK）与毒代动力学（Toxicokinetics，TK）研究成为一大热点。目前，在抗体的PK研究中，定量分析方法主要依赖基于免疫微孔板的配体结合分析（Ligand binding assays，LBA）方法，如酶联免疫吸附分析（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）等[1，2]。此外，基于免疫相关技术的表面等离子谐振（Surface plasmon resonance，SPR）[3]，Gyros[4，5]，电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）[1，6]等定量分析方法也在快速发展。在免疫分析方法中，通常需要精制的抗原以及特异性的单克隆抗体用于生物基质中被分析物的捕获与检测。但面对各种层出不穷的新型抗体药物，商品化的特异性单抗极少。因此，制备靶抗原、特异性抗体或抗独特型（Idiotype，ID）抗体，往往成为生物分析方法建立乃至整个PK/TK研究的瓶颈。在此情况下，不依赖于精制抗原或特异性抗体的分析方法如流式细胞术（Flow cytometry assay，FCA）[7]、液相色谱 质谱联用[8]等方法有望大大加快抗体药物的研发进程。但这些方法的适用性及通用性尚有待于进一步考证。本研究建立了基于FCA的抗体药物定量分析方法，并对其方法学以及在PK研究中的应用进行了考察。同时，对FCA法与经典的ELISA法进行了系统的比较。试图对FCA法定量分析抗体药物的方法提供较全面的评估，为后续该类药物的研究提供实验依据。
本研究选用重组抗CD20人源化单克隆抗体（rh anti CD20zumab）作为目标药物。它是基于人 鼠嵌合型单克隆抗体利妥昔单抗（Rituximab）的结构进行人源化改造而成，其CDR区与利妥昔单抗一致。针对该抗体，以抗利妥昔单抗的抗ID抗体作为捕获抗体（此抗ID抗体靶点为rh anti CD20zumab的CDR段），建立了灵敏高效的夹心ELISA法；同时，建立了基于B淋巴细胞表面抗原竞争的FCA法。在对两种方法分别进行了全面验证之后，利用两种方法同时对猕猴静脉滴注rh anti CD20zumab（30 mg/kg）后的药代动力学生物样品进行了分析。试图研究和对比不同分析方法测得的药物PK行为的异同，为抗体药物PK的深入研究奠定基础。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Guava微毛细管分析仪（Easycyte HT，美国Millipore公司）；超纯水系统（美国Millipore公司）；ZW A微量振荡器（国华电器有限公司）；超净工作台（东联哈尔仪器制造有限公司）；微量加样器（德国Brand公司）；4MK2洗板机（美国Thermo公司）；MK3酶标仪（美国Thermo公司）。
rh anti CD20zumab（批号：20121101，纯度>98%）和FITC标记的rh anti CD20zumab由上海医药集团有限公司提供；猴血清吸附HRP标记的山羊抗人IgG多克隆抗体（Bethyl公司，批号：A80 319P 15）；抗利妥昔单抗抗体（AbD Serotec公司，批号：110213）；人IgG（Rockland公司，批号：009 0102）；小鼠IgG（Abcam公司，批号：ab37355）；Wil2 S细胞由本实验室保存。
2.2 药代动力学实验
健康猕猴4只，雌雄各半，体重（4.0±0.2） kg；于后肢外侧静脉滴注rh anti CD20zumab，0.5 h滴注完毕。于滴注前和滴注后10，20，30 min（滴注结束）；1，2，3，4，5，6，8，10，12，24，36 h；2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，14，16，18，20，22 d在非给药侧后肢或前肢静脉取血约2 mL，分离血清，于
Symbolm@@ 80 ℃保存待测。
2.3 实验方法
2.3.1 双抗体夹心ELISA法的标准曲线及质控样品制备 用空白猕猴血清将rh anti CD20zumab标准品倍比稀释至19.5～10000 μg/L；另用同样方法单独配制浓度为3750，500和100 μg/L的质控样品；分析方法确证中，增加2个验证样品，浓度分别为5000 μg/L（ULOQ）和39.1 μg/L（LLOQ）。配制的标准标曲及质控样品分装后于
2.3.2 FCA的标准曲线及质控样品制备 用空白猕猴血清将rh anti CD20zumab标准品倍比稀释至2.0～400 mg/L；另用同样方法单独配制浓度为150，40.0和6.0 mg/L的质控样品；分析方法确证中，增加2个验证样品，浓度分别为200 mg/L（ULOQ）和3.1 mg/L（LLOQ）。配制的标准曲线及质控样品分装后于
2.3.3 双抗体夹心ELISA法测定血清中rh anti CD20zumab浓度 抗利妥昔单抗抗体每孔100 μL包被酶标板，4 ℃静置过夜。取包被板封闭后，加入经稀释液前处理（1∶100）后的标准溶液、各类质控样品溶液及待测样品，每个样品设2个复孔，室温孵育2 h。洗板3次后，加入猴血清吸附HRP标记的山羊抗人IgG多克隆抗体稀释液100 μL/孔，室温孵育1 h，洗涤液洗板6次后，每孔加入100 μL底物TMB（TMB浓缩液 TMB显色液，1∶20，V/V），室温避光反应13 min，加入1 mol/L H2SO4终止反应，50 μL/孔，立即用酶标仪在450 nm处测定吸光度，参比波长630 nm。
2.3.4 FCA测定血清中rh anti CD20zumab浓度 采用猕猴空白血清将待测样品中rh anti CD20zumab按一定稀释倍数稀释至标准曲线范围内，在未经稀释液前处理的标准溶液、各类质控样品溶液及待测样品中加入等体积100 mg/L FITC标记的rh anti CD20zumab。取对数生长期的Wil2 S细胞，1000 r/min离心8 min，用PBS洗涤一次，计数，再用PBS将细胞密度调整至1.6×106 个/mL，将细胞悬液分至EP管中。将以上方法制备的标准溶液、各类质控样品溶液及待测样品加入分好细胞悬液的一次性管中；室温振荡孵育45 min后重悬于200 μL PBS中。GUAVA测定荧光强度。
2.4 结果计算
使用MicroCal公司Origin 7.5软件对浓度对数和各管样品响应值Y绘制标准曲线，四参数Logistic拟合（其中最高浓度点与最低浓度点为锚定点，不参与拟合计算）：
其中，Emax和Emin分别为S 形曲线的最大值和最小值；EC50为50%响应值对应的浓度； Slope为斜率，即响应值随rh anti CD20zumab浓度的变化率。用同一批次设置的标准曲线，计算样品中rh anti CD20zumab浓度。
同时采用WinNonlin软件计算猕猴血清中rh anti CD20zumab的PK参数。
3 结果与讨论
3.1 方法学验证
3.1.1 特异性 按照制备标准曲线的方法制成低浓度质控样品（ELISA为0.10 mg/L， FCA为6.0 mg/L），并使其中含有高浓度（ELISA为5.0 μg/L， FCA为2000 μg/L）的小鼠IgG和人IgG，使用双抗体夹心ELISA和FCA进行交叉反应实验。由表1可见，两种抗体的回收率及测量精密度（RSD）均在
药代动力学研究可接受范围内，显示rh anti CD20zumab与小鼠IgG和人IgG抗体未发生交叉反应，这表明在猕猴血清中存在50和2000 mg/L 的小鼠IgG或人IgG时，均不会影响待测抗体的准确性，但FCA优于ELISA。
3.1.2 定量范围和灵敏度 猕猴血清制备标准曲线，批间重复5次。由图1可见，两种方法的标准曲线都具有良好的线性和重现性。ELISA法测得的OD值直接反映rh anti CD20zumab的浓度，其定量范围为0.04～5.0 mg/L；FCA测得的荧光强度间接反映rh anti CD20zumab的浓度，其定量范围为3.1～200 mg/L。由此可知，FCA的灵敏度与ELISA相比， 灵敏度相差约两个数量级，但以往研究表明，治疗性抗体类药物的给药剂量往往可达到mg/kg级[9～11]，因此FCA的灵敏度已足以满足绝大多数该类药物PK研究的要求。
图1 ELISA法（A）和FCA法（B）测定的标准曲线（n=5）
Fig.1 Calibration curve using ELISA（A）and flow cytometry assay （FCA）（B）（n=5）
3.1.3 方法的精密度和准确度 选取两种方法的定量上限（ELISA为5.0 mg/L，FCA为200 mg/L）和定量下限（ELISA为39 μg/L，FCA为3.1 mg/L）以及标准曲线的高、中、低（ELISA为3750，500和100 μg/L，FCA为150，40和6.0 mg/L）3个质控浓度评价2种方法的批内和批间精密度以及准确度。其中，精密度和准确度分别用RSD和RE值评价。从表2可见，ELISA的批内和批间RSD值分别小于19.5%和12.7%，FCA的批内和批间RSD值分别小于19.0%和15.4%； ELISA的RE在
之间。两种方法精密度和准确度非常接近，且均满足生物技术药物PK研究要求。
3.1.4 稀释线性 rh anti CD20zumab以30 mg/kg静脉滴注于猕猴体内，给药后一定时间内血清中的实际药物浓度高于标准曲线的最高浓度，测定时需要进行稀释后才能落入定量范围内。因此需要考察稀释方法。如表3所示，将已知浓度（ ELISA为60.0， 30.0， 6.00和1.00 mg/L， FCA为800， 500， 500和300 mg/L）的rh anti CD20zumab标准品进行不同倍数（ELISA为500， 50， 5和2倍， FCA为50， 20， 5和2倍）稀释后，其准确度均小于15%，满足生物分析方法学要求。因此，对血浆样品进行一定倍数（ELISA 为2～500倍，FCA 为2～50倍）稀释后测定，两种方法得到的结果仍准确可信。
3.2 ELISA和FCA测定猕猴给药后血清中rh anti CD20zumab的浓度
猕猴经静脉滴注30 mg/kg rh anti CD20zumab后，于不同时间点取血，采用ELISA和FCA分别测定血药浓度。结果表明，给药后血药物浓度迅速上升，给药30 min后（滴注完毕）血药浓度达到最大值，其后逐渐下降，两种方法都能检测到给药后22 d（大于4个半衰期）血液中的药物。同时，两种不同方法测定结果显示出良好的一致性，如图2所示。
3.3 ELISA和FCA测定猕猴给药后血清中rh anti CD20zumab的PK参数
猕猴静脉滴注30 mg/kg rh anti CD20zumab后，用ELISA和FCA测定经计算得到的主要PK参数如表4所示，两种方法测定得到的猕猴体内PK参数高度吻合；统计学t检验结果表明，两种不同方法测得的rh anti CD20zumab参数没有统计学差异（p>0.05）。
4 结 论
以往研究中，在缺乏高亲和力特异性抗体时，ELISA法进行定量分析常用多抗作为替代，但在纯生物基质中，此类方法极易出现交叉反应， 从而影响其特异性[12]；而FCA法在血清基质中受到的干扰更少，且样品不需进行前处理，因此在样品制备时更为方便，并且在数小时内即可完成一个分析批的样品分析，大大缩短了分析周期。因此，FCA法是一种较为快捷、简便、稳定且特异性高的检测方法。对于大多数治疗性抗体而言，在短期内难以获得理想捕获抗体，可以用FCA法代替ELISA法进行分析。但值得注意的是，采用FCA法进行PK研究时，尽量保证细胞活率>90%，同时每次使用的细胞密度应保持一致，减少批间误差。
本研究结果表明，FCA法的LLOQ明显高于ELISA法，即灵敏度相对较低。对给药剂量相对较高（mg/kg水平）的治疗性单克隆抗体类药物，FCA法虽然具有明显的优点和特点，但在面对给药剂量相对较低的药物（如细胞因子类药物，给药剂量通常在μg/kg水平）时，FCA较高的LLOQ可能会影响PK整体轮廓，尤其是浓度极低的末端消除相的描述。
同时，本研究中部分动物在末端消除期观察到一个快速“椅状”清除相（未显示），这提示在动物体内可能存在抗原介导的抗体清除机制。如能结合药物的药效、抗药抗体产生和组织分布的结果，将进一步阐述其PK/PD的相关性，并得到该抗体在体内吸收、分布、代谢和排泄的完整流程。这将为类似治疗性抗体在体内PK行为的深入研究奠定基础。
References
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12 LIU Ruo Rui， CHEN Zhi Hang， XU Xian Xing， SUN Li Li， LIU Yun Long， CHENG Yuan Guo.Letters in Biotechnology， 2011， 22（2）： 220-224
刘若瑞， 陈知航， 许先兴， 孙丽丽， 刘运龙，程远国. 生物技术通讯， 2011， 22（2）： 220-224
3.3 ELISA和FCA测定猕猴给药后血清中rh anti CD20zumab的PK参数
猕猴静脉滴注30 mg/kg rh anti CD20zumab后，用ELISA和FCA测定经计算得到的主要PK参数如表4所示，两种方法测定得到的猕猴体内PK参数高度吻合；统计学t检验结果表明，两种不同方法测得的rh anti CD20zumab参数没有统计学差异（p>0.05）。
4 结 论
以往研究中，在缺乏高亲和力特异性抗体时，ELISA法进行定量分析常用多抗作为替代，但在纯生物基质中，此类方法极易出现交叉反应， 从而影响其特异性[12]；而FCA法在血清基质中受到的干扰更少，且样品不需进行前处理，因此在样品制备时更为方便，并且在数小时内即可完成一个分析批的样品分析，大大缩短了分析周期。因此，FCA法是一种较为快捷、简便、稳定且特异性高的检测方法。对于大多数治疗性抗体而言，在短期内难以获得理想捕获抗体，可以用FCA法代替ELISA法进行分析。但值得注意的是，采用FCA法进行PK研究时，尽量保证细胞活率>90%，同时每次使用的细胞密度应保持一致，减少批间误差。
本研究结果表明，FCA法的LLOQ明显高于ELISA法，即灵敏度相对较低。对给药剂量相对较高（mg/kg水平）的治疗性单克隆抗体类药物，FCA法虽然具有明显的优点和特点，但在面对给药剂量相对较低的药物（如细胞因子类药物，给药剂量通常在μg/kg水平）时，FCA较高的LLOQ可能会影响PK整体轮廓，尤其是浓度极低的末端消除相的描述。
同时，本研究中部分动物在末端消除期观察到一个快速“椅状”清除相（未显示），这提示在动物体内可能存在抗原介导的抗体清除机制。如能结合药物的药效、抗药抗体产生和组织分布的结果，将进一步阐述其PK/PD的相关性，并得到该抗体在体内吸收、分布、代谢和排泄的完整流程。这将为类似治疗性抗体在体内PK行为的深入研究奠定基础。
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3.3 ELISA和FCA测定猕猴给药后血清中rh anti CD20zumab的PK参数
猕猴静脉滴注30 mg/kg rh anti CD20zumab后，用ELISA和FCA测定经计算得到的主要PK参数如表4所示，两种方法测定得到的猕猴体内PK参数高度吻合；统计学t检验结果表明，两种不同方法测得的rh anti CD20zumab参数没有统计学差异（p>0.05）。
4 结 论
以往研究中，在缺乏高亲和力特异性抗体时，ELISA法进行定量分析常用多抗作为替代，但在纯生物基质中，此类方法极易出现交叉反应， 从而影响其特异性[12]；而FCA法在血清基质中受到的干扰更少，且样品不需进行前处理，因此在样品制备时更为方便，并且在数小时内即可完成一个分析批的样品分析，大大缩短了分析周期。因此，FCA法是一种较为快捷、简便、稳定且特异性高的检测方法。对于大多数治疗性抗体而言，在短期内难以获得理想捕获抗体，可以用FCA法代替ELISA法进行分析。但值得注意的是，采用FCA法进行PK研究时，尽量保证细胞活率>90%，同时每次使用的细胞密度应保持一致，减少批间误差。
本研究结果表明，FCA法的LLOQ明显高于ELISA法，即灵敏度相对较低。对给药剂量相对较高（mg/kg水平）的治疗性单克隆抗体类药物，FCA法虽然具有明显的优点和特点，但在面对给药剂量相对较低的药物（如细胞因子类药物，给药剂量通常在μg/kg水平）时，FCA较高的LLOQ可能会影响PK整体轮廓，尤其是浓度极低的末端消除相的描述。
同时，本研究中部分动物在末端消除期观察到一个快速“椅状”清除相（未显示），这提示在动物体内可能存在抗原介导的抗体清除机制。如能结合药物的药效、抗药抗体产生和组织分布的结果，将进一步阐述其PK/PD的相关性，并得到该抗体在体内吸收、分布、代谢和排泄的完整流程。这将为类似治疗性抗体在体内PK行为的深入研究奠定基础。
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摘 要 采用酶联免疫吸附分析（ELISA）与基于Wil2 S细胞的流式细胞术（FCA）两种方法对生物基质中的重组抗CD20人源化单克隆抗体（rh anti CD20zumab）进行定量分析，并对两种方法进行系统比较。方法学验证结果表明，两种方法均具有良好的特异性、精密度和准确度，但定量范围存在明显差异。ELISA法批内和批间精密度均小于19.5%，准确度为二者定量范围分别为0.04～5.0 mg/L和3.1～200 mg/L，ELISA法的灵敏度显著高于FCA法。利用两种方法测定猕猴静脉滴注rh anti CD20zumab后的血药浓度 时间变化并进行药代动力学（PK）分析。结果表明，在给定剂量下，通过两种方法获得的PK结果具有良好的一致性。FCA法是一种细胞表面抗原靶向性抗体类药物PK研究及药效动力学（PD）研究的快捷、理想的方法。
关键词 抗CD20单克隆抗体；人源化；ELISA；流式细胞术；药代动力学
1 引 言
近年来，随着抗体药物应用的迅猛发展，该类药物的药代动力学（Pharmacokinetics，PK）与毒代动力学（Toxicokinetics，TK）研究成为一大热点。目前，在抗体的PK研究中，定量分析方法主要依赖基于免疫微孔板的配体结合分析（Ligand binding assays，LBA）方法，如酶联免疫吸附分析（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）等[1，2]。此外，基于免疫相关技术的表面等离子谐振（Surface plasmon resonance，SPR）[3]，Gyros[4，5]，电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）[1，6]等定量分析方法也在快速发展。在免疫分析方法中，通常需要精制的抗原以及特异性的单克隆抗体用于生物基质中被分析物的捕获与检测。但面对各种层出不穷的新型抗体药物，商品化的特异性单抗极少。因此，制备靶抗原、特异性抗体或抗独特型（Idiotype，ID）抗体，往往成为生物分析方法建立乃至整个PK/TK研究的瓶颈。在此情况下，不依赖于精制抗原或特异性抗体的分析方法如流式细胞术（Flow cytometry assay，FCA）[7]、液相色谱 质谱联用[8]等方法有望大大加快抗体药物的研发进程。但这些方法的适用性及通用性尚有待于进一步考证。本研究建立了基于FCA的抗体药物定量分析方法，并对其方法学以及在PK研究中的应用进行了考察。同时，对FCA法与经典的ELISA法进行了系统的比较。试图对FCA法定量分析抗体药物的方法提供较全面的评估，为后续该类药物的研究提供实验依据。
本研究选用重组抗CD20人源化单克隆抗体（rh anti CD20zumab）作为目标药物。它是基于人 鼠嵌合型单克隆抗体利妥昔单抗（Rituximab）的结构进行人源化改造而成，其CDR区与利妥昔单抗一致。针对该抗体，以抗利妥昔单抗的抗ID抗体作为捕获抗体（此抗ID抗体靶点为rh anti CD20zumab的CDR段），建立了灵敏高效的夹心ELISA法；同时，建立了基于B淋巴细胞表面抗原竞争的FCA法。在对两种方法分别进行了全面验证之后，利用两种方法同时对猕猴静脉滴注rh anti CD20zumab（30 mg/kg）后的药代动力学生物样品进行了分析。试图研究和对比不同分析方法测得的药物PK行为的异同，为抗体药物PK的深入研究奠定基础。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Guava微毛细管分析仪（Easycyte HT，美国Millipore公司）；超纯水系统（美国Millipore公司）；ZW A微量振荡器（国华电器有限公司）；超净工作台（东联哈尔仪器制造有限公司）；微量加样器（德国Brand公司）；4MK2洗板机（美国Thermo公司）；MK3酶标仪（美国Thermo公司）。
rh anti CD20zumab（批号：20121101，纯度>98%）和FITC标记的rh anti CD20zumab由上海医药集团有限公司提供；猴血清吸附HRP标记的山羊抗人IgG多克隆抗体（Bethyl公司，批号：A80 319P 15）；抗利妥昔单抗抗体（AbD Serotec公司，批号：110213）；人IgG（Rockland公司，批号：009 0102）；小鼠IgG（Abcam公司，批号：ab37355）；Wil2 S细胞由本实验室保存。
2.2 药代动力学实验
健康猕猴4只，雌雄各半，体重（4.0±0.2） kg；于后肢外侧静脉滴注rh anti CD20zumab，0.5 h滴注完毕。于滴注前和滴注后10，20，30 min（滴注结束）；1，2，3，4，5，6，8，10，12，24，36 h；2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，14，16，18，20，22 d在非给药侧后肢或前肢静脉取血约2 mL，分离血清，于
Symbolm@@ 80 ℃保存待测。
2.3 实验方法
2.3.1 双抗体夹心ELISA法的标准曲线及质控样品制备 用空白猕猴血清将rh anti CD20zumab标准品倍比稀释至19.5～10000 μg/L；另用同样方法单独配制浓度为3750，500和100 μg/L的质控样品；分析方法确证中，增加2个验证样品，浓度分别为5000 μg/L（ULOQ）和39.1 μg/L（LLOQ）。配制的标准标曲及质控样品分装后于
2.3.2 FCA的标准曲线及质控样品制备 用空白猕猴血清将rh anti CD20zumab标准品倍比稀释至2.0～400 mg/L；另用同样方法单独配制浓度为150，40.0和6.0 mg/L的质控样品；分析方法确证中，增加2个验证样品，浓度分别为200 mg/L（ULOQ）和3.1 mg/L（LLOQ）。配制的标准曲线及质控样品分装后于
2.3.3 双抗体夹心ELISA法测定血清中rh anti CD20zumab浓度 抗利妥昔单抗抗体每孔100 μL包被酶标板，4 ℃静置过夜。取包被板封闭后，加入经稀释液前处理（1∶100）后的标准溶液、各类质控样品溶液及待测样品，每个样品设2个复孔，室温孵育2 h。洗板3次后，加入猴血清吸附HRP标记的山羊抗人IgG多克隆抗体稀释液100 μL/孔，室温孵育1 h，洗涤液洗板6次后，每孔加入100 μL底物TMB（TMB浓缩液 TMB显色液，1∶20，V/V），室温避光反应13 min，加入1 mol/L H2SO4终止反应，50 μL/孔，立即用酶标仪在450 nm处测定吸光度，参比波长630 nm。
2.3.4 FCA测定血清中rh anti CD20zumab浓度 采用猕猴空白血清将待测样品中rh anti CD20zumab按一定稀释倍数稀释至标准曲线范围内，在未经稀释液前处理的标准溶液、各类质控样品溶液及待测样品中加入等体积100 mg/L FITC标记的rh anti CD20zumab。取对数生长期的Wil2 S细胞，1000 r/min离心8 min，用PBS洗涤一次，计数，再用PBS将细胞密度调整至1.6×106 个/mL，将细胞悬液分至EP管中。将以上方法制备的标准溶液、各类质控样品溶液及待测样品加入分好细胞悬液的一次性管中；室温振荡孵育45 min后重悬于200 μL PBS中。GUAVA测定荧光强度。
2.4 结果计算
使用MicroCal公司Origin 7.5软件对浓度对数和各管样品响应值Y绘制标准曲线，四参数Logistic拟合（其中最高浓度点与最低浓度点为锚定点，不参与拟合计算）：
其中，Emax和Emin分别为S 形曲线的最大值和最小值；EC50为50%响应值对应的浓度； Slope为斜率，即响应值随rh anti CD20zumab浓度的变化率。用同一批次设置的标准曲线，计算样品中rh anti CD20zumab浓度。
同时采用WinNonlin软件计算猕猴血清中rh anti CD20zumab的PK参数。
3 结果与讨论
3.1 方法学验证
3.1.1 特异性 按照制备标准曲线的方法制成低浓度质控样品（ELISA为0.10 mg/L， FCA为6.0 mg/L），并使其中含有高浓度（ELISA为5.0 μg/L， FCA为2000 μg/L）的小鼠IgG和人IgG，使用双抗体夹心ELISA和FCA进行交叉反应实验。由表1可见，两种抗体的回收率及测量精密度（RSD）均在
药代动力学研究可接受范围内，显示rh anti CD20zumab与小鼠IgG和人IgG抗体未发生交叉反应，这表明在猕猴血清中存在50和2000 mg/L 的小鼠IgG或人IgG时，均不会影响待测抗体的准确性，但FCA优于ELISA。
3.1.2 定量范围和灵敏度 猕猴血清制备标准曲线，批间重复5次。由图1可见，两种方法的标准曲线都具有良好的线性和重现性。ELISA法测得的OD值直接反映rh anti CD20zumab的浓度，其定量范围为0.04～5.0 mg/L；FCA测得的荧光强度间接反映rh anti CD20zumab的浓度，其定量范围为3.1～200 mg/L。由此可知，FCA的灵敏度与ELISA相比， 灵敏度相差约两个数量级，但以往研究表明，治疗性抗体类药物的给药剂量往往可达到mg/kg级[9～11]，因此FCA的灵敏度已足以满足绝大多数该类药物PK研究的要求。
图1 ELISA法（A）和FCA法（B）测定的标准曲线（n=5）
Fig.1 Calibration curve using ELISA（A）and flow cytometry assay （FCA）（B）（n=5）
3.1.3 方法的精密度和准确度 选取两种方法的定量上限（ELISA为5.0 mg/L，FCA为200 mg/L）和定量下限（ELISA为39 μg/L，FCA为3.1 mg/L）以及标准曲线的高、中、低（ELISA为3750，500和100 μg/L，FCA为150，40和6.0 mg/L）3个质控浓度评价2种方法的批内和批间精密度以及准确度。其中，精密度和准确度分别用RSD和RE值评价。从表2可见，ELISA的批内和批间RSD值分别小于19.5%和12.7%，FCA的批内和批间RSD值分别小于19.0%和15.4%； ELISA的RE在
之间。两种方法精密度和准确度非常接近，且均满足生物技术药物PK研究要求。
3.1.4 稀释线性 rh anti CD20zumab以30 mg/kg静脉滴注于猕猴体内，给药后一定时间内血清中的实际药物浓度高于标准曲线的最高浓度，测定时需要进行稀释后才能落入定量范围内。因此需要考察稀释方法。如表3所示，将已知浓度（ ELISA为60.0， 30.0， 6.00和1.00 mg/L， FCA为800， 500， 500和300 mg/L）的rh anti CD20zumab标准品进行不同倍数（ELISA为500， 50， 5和2倍， FCA为50， 20， 5和2倍）稀释后，其准确度均小于15%，满足生物分析方法学要求。因此，对血浆样品进行一定倍数（ELISA 为2～500倍，FCA 为2～50倍）稀释后测定，两种方法得到的结果仍准确可信。
3.2 ELISA和FCA测定猕猴给药后血清中rh anti CD20zumab的浓度
猕猴经静脉滴注30 mg/kg rh anti CD20zumab后，于不同时间点取血，采用ELISA和FCA分别测定血药浓度。结果表明，给药后血药物浓度迅速上升，给药30 min后（滴注完毕）血药浓度达到最大值，其后逐渐下降，两种方法都能检测到给药后22 d（大于4个半衰期）血液中的药物。同时，两种不同方法测定结果显示出良好的一致性，如图2所示。
3.3 ELISA和FCA测定猕猴给药后血清中rh anti CD20zumab的PK参数
猕猴静脉滴注30 mg/kg rh anti CD20zumab后，用ELISA和FCA测定经计算得到的主要PK参数如表4所示，两种方法测定得到的猕猴体内PK参数高度吻合；统计学t检验结果表明，两种不同方法测得的rh anti CD20zumab参数没有统计学差异（p>0.05）。
4 结 论
以往研究中，在缺乏高亲和力特异性抗体时，ELISA法进行定量分析常用多抗作为替代，但在纯生物基质中，此类方法极易出现交叉反应， 从而影响其特异性[12]；而FCA法在血清基质中受到的干扰更少，且样品不需进行前处理，因此在样品制备时更为方便，并且在数小时内即可完成一个分析批的样品分析，大大缩短了分析周期。因此，FCA法是一种较为快捷、简便、稳定且特异性高的检测方法。对于大多数治疗性抗体而言，在短期内难以获得理想捕获抗体，可以用FCA法代替ELISA法进行分析。但值得注意的是，采用FCA法进行PK研究时，尽量保证细胞活率>90%，同时每次使用的细胞密度应保持一致，减少批间误差。
本研究结果表明，FCA法的LLOQ明显高于ELISA法，即灵敏度相对较低。对给药剂量相对较高（mg/kg水平）的治疗性单克隆抗体类药物，FCA法虽然具有明显的优点和特点，但在面对给药剂量相对较低的药物（如细胞因子类药物，给药剂量通常在μg/kg水平）时，FCA较高的LLOQ可能会影响PK整体轮廓，尤其是浓度极低的末端消除相的描述。
同时，本研究中部分动物在末端消除期观察到一个快速“椅状”清除相（未显示），这提示在动物体内可能存在抗原介导的抗体清除机制。如能结合药物的药效、抗药抗体产生和组织分布的结果，将进一步阐述其PK/PD的相关性，并得到该抗体在体内吸收、分布、代谢和排泄的完整流程。这将为类似治疗性抗体在体内PK行为的深入研究奠定基础。
References
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刘若瑞， 陈知航， 许先兴， 孙丽丽， 刘运龙，程远国. 生物技术通讯， 2011， 22（2）： 220-224
3.3 ELISA和FCA测定猕猴给药后血清中rh anti CD20zumab的PK参数
猕猴静脉滴注30 mg/kg rh anti CD20zumab后，用ELISA和FCA测定经计算得到的主要PK参数如表4所示，两种方法测定得到的猕猴体内PK参数高度吻合；统计学t检验结果表明，两种不同方法测得的rh anti CD20zumab参数没有统计学差异（p>0.05）。
4 结 论
以往研究中，在缺乏高亲和力特异性抗体时，ELISA法进行定量分析常用多抗作为替代，但在纯生物基质中，此类方法极易出现交叉反应， 从而影响其特异性[12]；而FCA法在血清基质中受到的干扰更少，且样品不需进行前处理，因此在样品制备时更为方便，并且在数小时内即可完成一个分析批的样品分析，大大缩短了分析周期。因此，FCA法是一种较为快捷、简便、稳定且特异性高的检测方法。对于大多数治疗性抗体而言，在短期内难以获得理想捕获抗体，可以用FCA法代替ELISA法进行分析。但值得注意的是，采用FCA法进行PK研究时，尽量保证细胞活率>90%，同时每次使用的细胞密度应保持一致，减少批间误差。
本研究结果表明，FCA法的LLOQ明显高于ELISA法，即灵敏度相对较低。对给药剂量相对较高（mg/kg水平）的治疗性单克隆抗体类药物，FCA法虽然具有明显的优点和特点，但在面对给药剂量相对较低的药物（如细胞因子类药物，给药剂量通常在μg/kg水平）时，FCA较高的LLOQ可能会影响PK整体轮廓，尤其是浓度极低的末端消除相的描述。
同时，本研究中部分动物在末端消除期观察到一个快速“椅状”清除相（未显示），这提示在动物体内可能存在抗原介导的抗体清除机制。如能结合药物的药效、抗药抗体产生和组织分布的结果，将进一步阐述其PK/PD的相关性，并得到该抗体在体内吸收、分布、代谢和排泄的完整流程。这将为类似治疗性抗体在体内PK行为的深入研究奠定基础。
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