濒危药用植物金铁锁花粉活力快速测定研究
许银凤 尹子丽
摘要：目的 濒危药用植物金铁锁花粉活力检测。方法 采用I2-KI染色法、醋酸洋红染色法、过氧化物酶沉淀法和TTC染色法。结果 I2-KI法不能染不上色，不适合检测金铁锁花粉活力。醋酸洋红染色法、过氧化物酶沉淀法和TTC法可用于现采金铁锁花粉活力的测定，过氧化物酶沉淀法不能用于贮藏金铁锁花粉活力的测定。无论是现采的花粉还是贮藏花粉，最好的方法是醋酸洋红染色法。结论 为金铁锁的优良种质资源保存提供了理论依据。
关键词：金铁锁;花粉活力;快速测定
中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）07-0069-02
Study on Rapid Determination of Pollen Vitality for Endangered Psammosilene Tunicoides
XU Yin-feng YIN Zi-li2
（School of Minorities Medicament，Yunnan Unversity of Traditional Chinese Medicine Kunming 650500;
2. Yunnan Econmy Management College，Kunming 650106）
【Abstract】Objective：To measure the pollen vitality for endangered Psammosilene tunicoides. Methods：I2-KI staining，acetate carmine staining，peroxidase precipitation and TTC staining techniques were used. Results：The I2-KI staining failed to measure the pollen vitality of Psammosilene. Acetate carmine staining，peroxidase precipitation and TTC techniques can be used to determine the pollen viability of fresh Psammosilene. The peroxidase precipitation method cannot be used to determine the pollen viability of stored Psammosilene. The best method was the acetate carmine staining as it was suitable for fresh and stored pollen. Conclusion：This study provides a theoretical basis for optimal preservation of Psammosilene.
【Key words】Psammosilene tunicoides，pollen viability，rapid determination
金铁锁（Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu）系石竹科（Caryophyllaceae）单种属植物，为我国西南特有的药用植物，是“云南白药”组成药材之一，其疗效明显，具有较高的药用和经济价值，但由于成材时间较长，且完全依靠自然生长，野生资源逐渐减少，现已作为稀有濒危物种列于《中国植物红皮书》中，是国家二级保护植物[1]，因而保护和扩大金铁锁种质资源的研究工作尤为重要。花粉是种子植物的雄配子体，在有性繁殖中发挥着重要作用，利用花粉进行种质资源的贮藏保存时非常重要的手段之一。对濒危药用植物金铁锁的花粉进行生活力的测定研究，可为金铁锁种质资源的保存和迁地保护提供理论依据。本文采用I2-KI染色法、醋酸洋红染色法、过氧化物酶染色法、TTC染色法4种方法对金铁锁花粉活力进行测定，并建立和筛选出準确、简便、快速的测定方法，为金铁锁大规模制种和贮藏花粉提供可靠的依据。
1 材料与方法
1.1 供试花粉 云南白药集团中药材栽培基地金铁锁的花粉。
1.2 测定方法
1.2.1 I2-KI染色法 植物花粉成熟时积累有一定的淀粉，通常可以用I2-KI染成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，不积累淀粉，用I2-KI（0.1%）染色，不呈蓝色，而呈黄褐色。取现采的花粉，置于载波片上，加1-2滴I2-KI溶液，盖上盖波片，置于显微镜下观察，低倍镜下取5个视野统计并记录被染色的花粉数量。
1.2.2 醋酸洋红染色法 正常花粉呈圆球形，物质积累较多，对醋酸洋红的吸附作用和亲和力强，通常易被染成深红色，发育不良的花粉常呈畸形，不积累物质或积累很少，用醋酸洋红染色呈淡红色或无色。取花粉，置于载波片上，加1-2滴醋酸洋红溶液（100 mL45%的醋酸），盖上盖波片，置于显微镜下观察，低倍镜下取5个视野统计并记录被染色的花粉数量。
1.2.3 过氧化物酶沉淀法 具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利用过氧化氢使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉的活性强弱。具体过程为：0.5%联苯胺（将0.5 g联苯胺溶于100 mL50%乙醇中），0.5%α-萘酚（将0.5 gα-萘酚溶于100 mL50%乙醇中），0.25%碳酸钠（将0.25 g碳酸钠溶于100 mL蒸馏水中），实验前将上述三种溶液各取10 mL混合均匀成试剂Ⅰ。在干净载波片上放少量花粉，然后加试剂Ⅰ和0.3%过氧化氢各1滴，搅匀后盖上盖波片，将制片放置30℃恒温箱中15 min，置于显微镜下观察，低倍镜下取5个视野统计并记录被染色的花粉数量。
1.2.4 TTC染色法 花粉中呼吸酶的活跃情况能较正确地反映其生活力的强弱，同时氧化还原染料能在呼吸酶的作用下着色。因此可根据着色情况来判断花粉的生活力 。在干净载波片上放少量花粉，然后加1-2滴的TTC溶液（0.5%），盖上盖波片，将制片放置35℃恒温箱中15min，置于显微镜下观察，低倍镜下取5个视野统计并记录被染色的花粉数量。
2 结果
2.1 对现采花粉生活力的测定结果 由表1的实验数据表明：本研究所采用的4种金铁锁花粉活力检测方法中，过氧化物酶沉淀法测得的数值最高为89.8%，其次为醋酸洋红染色法为86.7%，I2-KI染色法对金铁锁花粉不能染不上色，因此I2-KI染色法不适合检测金铁锁花粉活力，I2-KI、醋酸洋红染色法和过氧化物酶沉淀法均可用于现采花粉生活力的检测。不同方法内观察值之间分散程度也有所不同，其中过氧化物酶沉淀法测定时各重复之间的差异很大，标准差为2.8368，TTC染色法次之，醋酸洋红染色法所得的结果分散程度最小，标准差为1.8536，同时醋酸洋红染色法所测得的有活力花粉比率平均数为86.7%，最接近三种方法的平均值（86.87%），所以为获得准确的测定结果，对现采金铁锁花粉的生活力检测，最好选用醋酸洋红染色法。
表1 现采金铁锁花粉活力测定结果
2.2 对自然风干不同时间的花粉活力的测定结果 由表2的实验数据表明：醋酸洋红染色法和TTC染色法对自然风干的金铁锁花粉活力测定均为随着时间的延长呈下降趋势，TTC染色法下降趋势明显，第1天和第2天差异较大，而在第6 d检测到有活力的花粉比率值较低;过氧化物酶沉淀法显示随着时间的延长有活力花粉比率呈上升趋势，与实际不相符合不能用于金铁锁花粉活力的测定。醋酸洋红染色法所得到的数据结果符合自然干燥贮藏花粉生活力的变化规律，所以醋酸洋红染色法可以用来测定贮藏花粉的生活力。
表2 对自然风干不同时间的花粉活力的测定结果
2.3 低温（4℃）贮藏条件下的花粉活力的测定结果 由表3的实验数据表明：醋酸洋红染色法和TTC染色法对低温贮藏的金铁锁花粉活力测定均为随着时间的延长呈下降趋势，TTC染色法在第四天下降趋势明显仅为20.3%;过氧化物酶沉淀法显示随着时间的延长有活力花粉比率规律不明显，在1天后呈下降趋势，其余均随着时间的延长呈上升趋势，与实际不相符合，不能用于金铁锁低温贮藏条件下的花粉生活力检测。醋酸洋红染色法所得到的数据结果符合花粉生活力的变化规律，所以醋酸洋红染色法可以用来测定低温贮藏金铁锁的花粉生活力。
表3 低温（4℃）贮藏条件下的花粉活力的测定结果
3 结论与讨论
3.1 结论 4种方法除I2-KI染色法外，其余3种方法可以用于现采金铁锁花粉活力的测定，醋酸洋红染色法的测定结果较精准。醋酸洋红染色法和TTC染色法均可用于不同贮藏时间的花粉生活力测定，而过氧化物酶沉淀法不适用于贮藏金铁锁花粉活力的测定，为获得准确的测定结果，无论是现采的花粉还是贮藏花粉，最好的方法是醋酸洋红染色法。
3.2 讨论 花粉生活力長短的保持，一方面是由遗传因素所决定，另一方面也受环境因素的影响[2]。I2-KI染色法测定花粉生活力，正常花粉积累淀粉较多，发育不良的花粉往往不含淀粉或积累淀粉较少，其着色程度由花粉壁的厚薄和花粉内支链淀粉和直链淀粉比例高低决定[3]，可能由于金铁锁花粉壁较厚且支链淀粉含量较少或无而使I2-KI不能成功对其花粉染色。过氧化物酶沉淀法主要是靠有活力的花粉含有活跃的过氧化物酶，试剂与此发生氧化而染色，过氧化物酶沉淀法检测金铁锁花粉生活力显示随着时间的延长有活力花粉比率呈上升趋势，可能因金铁锁花粉活力丧失而其过氧化物酶活性没有消失，所以仍然能染色，也有可能与染色机理有关。
参考文献：
[1]吕小梨，王华磊，赵致.金铁锁种子发芽试验研究[J].种子，2010，29（6）：84-86.
[2]HC Liu，WQ Jia，XH Du，et al.Study on pollen viability determination and storage of honeysuckle[J].Medicinal Plant，2010，3：31-33，36.
[3]胡晋.花粉的保存和生活力的测定[J].种子，1990，6：33-35.
（收稿日期：2018-04-17）
摘要：目的 濒危药用植物金铁锁花粉活力检测。方法 采用I2-KI染色法、醋酸洋红染色法、过氧化物酶沉淀法和TTC染色法。结果 I2-KI法不能染不上色，不适合检测金铁锁花粉活力。醋酸洋红染色法、过氧化物酶沉淀法和TTC法可用于现采金铁锁花粉活力的测定，过氧化物酶沉淀法不能用于贮藏金铁锁花粉活力的测定。无论是现采的花粉还是贮藏花粉，最好的方法是醋酸洋红染色法。结论 为金铁锁的优良种质资源保存提供了理论依据。
关键词：金铁锁;花粉活力;快速测定
中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）07-0069-02
Study on Rapid Determination of Pollen Vitality for Endangered Psammosilene Tunicoides
XU Yin-feng YIN Zi-li2
（School of Minorities Medicament，Yunnan Unversity of Traditional Chinese Medicine Kunming 650500;
2. Yunnan Econmy Management College，Kunming 650106）
【Abstract】Objective：To measure the pollen vitality for endangered Psammosilene tunicoides. Methods：I2-KI staining，acetate carmine staining，peroxidase precipitation and TTC staining techniques were used. Results：The I2-KI staining failed to measure the pollen vitality of Psammosilene. Acetate carmine staining，peroxidase precipitation and TTC techniques can be used to determine the pollen viability of fresh Psammosilene. The peroxidase precipitation method cannot be used to determine the pollen viability of stored Psammosilene. The best method was the acetate carmine staining as it was suitable for fresh and stored pollen. Conclusion：This study provides a theoretical basis for optimal preservation of Psammosilene.
【Key words】Psammosilene tunicoides，pollen viability，rapid determination
金铁锁（Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu）系石竹科（Caryophyllaceae）单种属植物，为我国西南特有的药用植物，是“云南白药”组成药材之一，其疗效明显，具有较高的药用和经济价值，但由于成材时间较长，且完全依靠自然生长，野生资源逐渐减少，现已作为稀有濒危物种列于《中国植物红皮书》中，是国家二级保护植物[1]，因而保护和扩大金铁锁种质资源的研究工作尤为重要。花粉是种子植物的雄配子体，在有性繁殖中发挥着重要作用，利用花粉进行种质资源的贮藏保存时非常重要的手段之一。对濒危药用植物金铁锁的花粉进行生活力的测定研究，可为金铁锁种质资源的保存和迁地保护提供理论依据。本文采用I2-KI染色法、醋酸洋红染色法、过氧化物酶染色法、TTC染色法4种方法对金铁锁花粉活力进行测定，并建立和筛选出準确、简便、快速的测定方法，为金铁锁大规模制种和贮藏花粉提供可靠的依据。
1 材料与方法
1.1 供试花粉 云南白药集团中药材栽培基地金铁锁的花粉。
1.2 测定方法
1.2.1 I2-KI染色法 植物花粉成熟时积累有一定的淀粉，通常可以用I2-KI染成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，不积累淀粉，用I2-KI（0.1%）染色，不呈蓝色，而呈黄褐色。取现采的花粉，置于载波片上，加1-2滴I2-KI溶液，盖上盖波片，置于显微镜下观察，低倍镜下取5个视野统计并记录被染色的花粉数量。
1.2.2 醋酸洋红染色法 正常花粉呈圆球形，物质积累较多，对醋酸洋红的吸附作用和亲和力强，通常易被染成深红色，发育不良的花粉常呈畸形，不积累物质或积累很少，用醋酸洋红染色呈淡红色或无色。取花粉，置于载波片上，加1-2滴醋酸洋红溶液（100 mL45%的醋酸），盖上盖波片，置于显微镜下观察，低倍镜下取5个视野统计并记录被染色的花粉数量。
1.2.3 过氧化物酶沉淀法 具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利用过氧化氢使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉的活性强弱。具体过程为：0.5%联苯胺（将0.5 g联苯胺溶于100 mL50%乙醇中），0.5%α-萘酚（将0.5 gα-萘酚溶于100 mL50%乙醇中），0.25%碳酸钠（将0.25 g碳酸钠溶于100 mL蒸馏水中），实验前将上述三种溶液各取10 mL混合均匀成试剂Ⅰ。在干净载波片上放少量花粉，然后加试剂Ⅰ和0.3%过氧化氢各1滴，搅匀后盖上盖波片，将制片放置30℃恒温箱中15 min，置于显微镜下观察，低倍镜下取5个视野统计并记录被染色的花粉数量。
1.2.4 TTC染色法 花粉中呼吸酶的活跃情况能较正确地反映其生活力的强弱，同时氧化还原染料能在呼吸酶的作用下着色。因此可根据着色情况来判断花粉的生活力 。在干净载波片上放少量花粉，然后加1-2滴的TTC溶液（0.5%），盖上盖波片，将制片放置35℃恒温箱中15min，置于显微镜下观察，低倍镜下取5个视野统计并记录被染色的花粉数量。
2 结果
2.1 对现采花粉生活力的测定结果 由表1的实验数据表明：本研究所采用的4种金铁锁花粉活力检测方法中，过氧化物酶沉淀法测得的数值最高为89.8%，其次为醋酸洋红染色法为86.7%，I2-KI染色法对金铁锁花粉不能染不上色，因此I2-KI染色法不适合检测金铁锁花粉活力，I2-KI、醋酸洋红染色法和过氧化物酶沉淀法均可用于现采花粉生活力的检测。不同方法内观察值之间分散程度也有所不同，其中过氧化物酶沉淀法测定时各重复之间的差异很大，标准差为2.8368，TTC染色法次之，醋酸洋红染色法所得的结果分散程度最小，标准差为1.8536，同时醋酸洋红染色法所测得的有活力花粉比率平均数为86.7%，最接近三种方法的平均值（86.87%），所以为获得准确的测定结果，对现采金铁锁花粉的生活力检测，最好选用醋酸洋红染色法。
表1 现采金铁锁花粉活力测定结果
2.2 对自然风干不同时间的花粉活力的测定结果 由表2的实验数据表明：醋酸洋红染色法和TTC染色法对自然风干的金铁锁花粉活力测定均为随着时间的延长呈下降趋势，TTC染色法下降趋势明显，第1天和第2天差异较大，而在第6 d检测到有活力的花粉比率值较低;过氧化物酶沉淀法显示随着时间的延长有活力花粉比率呈上升趋势，与实际不相符合不能用于金铁锁花粉活力的测定。醋酸洋红染色法所得到的数据结果符合自然干燥贮藏花粉生活力的变化规律，所以醋酸洋红染色法可以用来测定贮藏花粉的生活力。
表2 对自然风干不同时间的花粉活力的测定结果
2.3 低温（4℃）贮藏条件下的花粉活力的测定结果 由表3的实验数据表明：醋酸洋红染色法和TTC染色法对低温贮藏的金铁锁花粉活力测定均为随着时间的延长呈下降趋势，TTC染色法在第四天下降趋势明显仅为20.3%;过氧化物酶沉淀法显示随着时间的延长有活力花粉比率规律不明显，在1天后呈下降趋势，其余均随着时间的延长呈上升趋势，与实际不相符合，不能用于金铁锁低温贮藏条件下的花粉生活力检测。醋酸洋红染色法所得到的数据结果符合花粉生活力的变化规律，所以醋酸洋红染色法可以用来测定低温贮藏金铁锁的花粉生活力。
表3 低温（4℃）贮藏条件下的花粉活力的测定结果
3 结论与讨论
3.1 结论 4种方法除I2-KI染色法外，其余3种方法可以用于现采金铁锁花粉活力的测定，醋酸洋红染色法的测定结果较精准。醋酸洋红染色法和TTC染色法均可用于不同贮藏时间的花粉生活力测定，而过氧化物酶沉淀法不适用于贮藏金铁锁花粉活力的测定，为获得准确的测定结果，无论是现采的花粉还是贮藏花粉，最好的方法是醋酸洋红染色法。
3.2 讨论 花粉生活力長短的保持，一方面是由遗传因素所决定，另一方面也受环境因素的影响[2]。I2-KI染色法测定花粉生活力，正常花粉积累淀粉较多，发育不良的花粉往往不含淀粉或积累淀粉较少，其着色程度由花粉壁的厚薄和花粉内支链淀粉和直链淀粉比例高低决定[3]，可能由于金铁锁花粉壁较厚且支链淀粉含量较少或无而使I2-KI不能成功对其花粉染色。过氧化物酶沉淀法主要是靠有活力的花粉含有活跃的过氧化物酶，试剂与此发生氧化而染色，过氧化物酶沉淀法检测金铁锁花粉生活力显示随着时间的延长有活力花粉比率呈上升趋势，可能因金铁锁花粉活力丧失而其过氧化物酶活性没有消失，所以仍然能染色，也有可能与染色机理有关。
参考文献：
[1]吕小梨，王华磊，赵致.金铁锁种子发芽试验研究[J].种子，2010，29（6）：84-86.
[2]HC Liu，WQ Jia，XH Du，et al.Study on pollen viability determination and storage of honeysuckle[J].Medicinal Plant，2010，3：31-33，36.
[3]胡晋.花粉的保存和生活力的测定[J].种子，1990，6：33-35.
（收稿日期：2018-04-17）
