纳升级反相液相色谱串联质谱法分析蜈蚣提取蛋白质
陈霞 文红梅等
摘 要 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳升级反相液相色谱串联质谱（nanoRPLCMS/MS）法系统分析了蜈蚣提取蛋白质胶内酶解和直接酶解产物，并进行数据库检索鉴定蛋白质。建立的nanoLC分析条件为：上样8 μL， 经Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm，3 μm），2%乙腈（0.1%甲酸）98%乙腈（0.1%甲酸）梯度洗脱90 min；采用ESIQTOF MS，并在IDA采集模式下分析鉴定蜈蚣提取蛋白质。胶内酶解鉴定到 72 种蛋白质，直接酶解鉴定到 97 种蛋白质，二者含26种相同的蛋白质。通过数据库比对，分析了蜈蚣提取蛋白质的生物进程、细胞组分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白质具有结合、酶催化、肌动等功能活性，其中结合活性的蛋白质占的比例较大，且多为能量代谢进程中的相关酶类。
关键词 纳升级反相液相色谱串联质谱； 蜈蚣； 蛋白质； 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1 引 言
蜈蚣为节肢动物门唇足纲整形目蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch）的干燥体 [1 ]，具有息风镇痉、通络止痛、攻毒散结等功效，已广泛用于临床疾病的治疗。蜈蚣主要含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、总脂、微量元素等 [2～4 ]，且蛋白质为其主要成分，占总成分的50%～70%。药理研究表明其具有抗肿瘤 [5，6 ]、抗凝血 [7，8 ]、抗惊厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究较少，Zhao等 [11 ]从蜈蚣中分离纯化得到一种具有抗肿瘤和免疫活性的多糖蛋白复合物，Kong等 [12 ]从蜈蚣中提取分离出一种多肽，药理实验显示具有抗血栓活性。但目前尚缺少对蜈蚣蛋白质的系统分析方法。本研究首次引入蛋白质组学研究方法，建立了高灵敏、高通量的纳升级反相液相色谱串联质谱方法，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳对蜈蚣提取蛋白质的胶内酶解和直接酶解产物进行分析，并对鉴别到的蛋白质的生物进程、细胞组分及功能活性进行分析，较系统地研究了蜈蚣提取蛋白质，为蜈蚣蛋白质的研究提供了新方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
纳升级液相色谱系统：EksigentekspertTM nanoLC液相系统，Eksigent software V.3.12液相工作站；高分辨质谱系统：TripleTOFTM5600，配有电喷雾离子源（ESI）、Analyst TF 1.6色谱工作站、Peak View 1.2质谱分析软件和ProteinPilot 4.5蛋白质分析软件（美国AB Sciex公司）。垂直凝胶电泳仪（美国Biorad公司）；离心浓缩仪（美国Labconco公司）；ZipTipC18 Pipette Tips（美国Millipore公司）。
十二烷基磺酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）、尿素（UREA）购于Biosharpp公司；碘乙酰胺（IAA，Aladdin公司）；胰蛋白酶（Trypsin，Promega质谱测序级）。乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级（德国Merck公司）。
蜈蚣购于江苏省万生中药饮片有限公司，产地湖北（批号111001），经南京中医药大学中药鉴定教研室陈建伟教授鉴定为少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch）的干燥体。
2.2 蜈蚣总蛋白的提取
蜈蚣药材粉碎后，取粗粉20 mg，加入裂解缓冲溶液（2% SDS，20 mmol/L DTT， 50 mmol/L PBS pH 7.8） 2 mL，65 ℃水浴中孵育过夜。10000 r/min离心20 min，上清液加入乙醇， 使乙醇终浓度为70%，沉淀蛋白。离心后，取沉淀用70%乙醇洗涤2次，沉淀经离心浓缩干燥，
Symbolm@@ 80 ℃保存备用。
2.3 蜈蚣蛋白质酶解
2.3.1 直接酶解
取蜈蚣蛋白约200 μg，加2%SDS，20 mmol/L DTT，50 mmol/L PBS溶液125 μL， 37 ℃孵育60 min， 加入IAA至终浓度为40 mmol/L，室温避光孵育60 min。加入乙醇至终浓度约为70%沉淀蛋白，10000 r/min离心20 min，弃去上清液， 用70%乙醇洗涤沉淀2次，将洗涤后的蛋白质溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中，加入3 μg的胰蛋白酶（50 ∶ 1～100 ∶ 1），37 ℃酶解过夜，得蜈蚣蛋白质直接酶解液。
2.3.2 SDSPAGE及胶内酶解
蜈蚣总提取液经考马斯亮蓝测定浓度后加入样品溶解液，煮沸5 min后上样到配好的凝胶（分离胶浓度12%，浓缩胶5%），10 mV电泳，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。硝酸银染色后，依此经过切胶、浸洗、蛋白质降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提，得蜈蚣蛋白质胶内酶解液。
2.4 NanoLCMS/MS分析
胶内及直接酶解液12000 r/min离心后取上清液，ZipTip脱盐，经离心浓缩仪干燥后，0.1%甲酸溶液复溶，高速离心后取上清液注入nanoLCMS/MS仪器分析。
液相为EksigentekspertTM NanoLC液相系统，色谱条件为：Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm， 3 μm）；流动相A：2%乙腈（0.1%甲酸），B：98%乙腈（0.1%甲酸）；流速300 nL/min，自动进样，上样8 μL。梯度洗脱条件为： 0～54 min，5%～25%B；54～75 min，25%～55%B；75～77 min，55%～80%B；77～83 min，80% B；83～90 min，80%～5%B，分析时间90 min。
摘 要 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳升级反相液相色谱串联质谱（nanoRPLCMS/MS）法系统分析了蜈蚣提取蛋白质胶内酶解和直接酶解产物，并进行数据库检索鉴定蛋白质。建立的nanoLC分析条件为：上样8 μL， 经Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm，3 μm），2%乙腈（0.1%甲酸）98%乙腈（0.1%甲酸）梯度洗脱90 min；采用ESIQTOF MS，并在IDA采集模式下分析鉴定蜈蚣提取蛋白质。胶内酶解鉴定到 72 种蛋白质，直接酶解鉴定到 97 种蛋白质，二者含26种相同的蛋白质。通过数据库比对，分析了蜈蚣提取蛋白质的生物进程、细胞组分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白质具有结合、酶催化、肌动等功能活性，其中结合活性的蛋白质占的比例较大，且多为能量代谢进程中的相关酶类。
关键词 纳升级反相液相色谱串联质谱； 蜈蚣； 蛋白质； 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1 引 言
蜈蚣为节肢动物门唇足纲整形目蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch）的干燥体 [1 ]，具有息风镇痉、通络止痛、攻毒散结等功效，已广泛用于临床疾病的治疗。蜈蚣主要含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、总脂、微量元素等 [2～4 ]，且蛋白质为其主要成分，占总成分的50%～70%。药理研究表明其具有抗肿瘤 [5，6 ]、抗凝血 [7，8 ]、抗惊厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究较少，Zhao等 [11 ]从蜈蚣中分离纯化得到一种具有抗肿瘤和免疫活性的多糖蛋白复合物，Kong等 [12 ]从蜈蚣中提取分离出一种多肽，药理实验显示具有抗血栓活性。但目前尚缺少对蜈蚣蛋白质的系统分析方法。本研究首次引入蛋白质组学研究方法，建立了高灵敏、高通量的纳升级反相液相色谱串联质谱方法，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳对蜈蚣提取蛋白质的胶内酶解和直接酶解产物进行分析，并对鉴别到的蛋白质的生物进程、细胞组分及功能活性进行分析，较系统地研究了蜈蚣提取蛋白质，为蜈蚣蛋白质的研究提供了新方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
纳升级液相色谱系统：EksigentekspertTM nanoLC液相系统，Eksigent software V.3.12液相工作站；高分辨质谱系统：TripleTOFTM5600，配有电喷雾离子源（ESI）、Analyst TF 1.6色谱工作站、Peak View 1.2质谱分析软件和ProteinPilot 4.5蛋白质分析软件（美国AB Sciex公司）。垂直凝胶电泳仪（美国Biorad公司）；离心浓缩仪（美国Labconco公司）；ZipTipC18 Pipette Tips（美国Millipore公司）。
十二烷基磺酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）、尿素（UREA）购于Biosharpp公司；碘乙酰胺（IAA，Aladdin公司）；胰蛋白酶（Trypsin，Promega质谱测序级）。乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级（德国Merck公司）。
蜈蚣购于江苏省万生中药饮片有限公司，产地湖北（批号111001），经南京中医药大学中药鉴定教研室陈建伟教授鉴定为少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch）的干燥体。
2.2 蜈蚣总蛋白的提取
蜈蚣药材粉碎后，取粗粉20 mg，加入裂解缓冲溶液（2% SDS，20 mmol/L DTT， 50 mmol/L PBS pH 7.8） 2 mL，65 ℃水浴中孵育过夜。10000 r/min离心20 min，上清液加入乙醇， 使乙醇终浓度为70%，沉淀蛋白。离心后，取沉淀用70%乙醇洗涤2次，沉淀经离心浓缩干燥，
Symbolm@@ 80 ℃保存备用。
2.3 蜈蚣蛋白质酶解
2.3.1 直接酶解
取蜈蚣蛋白约200 μg，加2%SDS，20 mmol/L DTT，50 mmol/L PBS溶液125 μL， 37 ℃孵育60 min， 加入IAA至终浓度为40 mmol/L，室温避光孵育60 min。加入乙醇至终浓度约为70%沉淀蛋白，10000 r/min离心20 min，弃去上清液， 用70%乙醇洗涤沉淀2次，将洗涤后的蛋白质溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中，加入3 μg的胰蛋白酶（50 ∶ 1～100 ∶ 1），37 ℃酶解过夜，得蜈蚣蛋白质直接酶解液。
2.3.2 SDSPAGE及胶内酶解
蜈蚣总提取液经考马斯亮蓝测定浓度后加入样品溶解液，煮沸5 min后上样到配好的凝胶（分离胶浓度12%，浓缩胶5%），10 mV电泳，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。硝酸银染色后，依此经过切胶、浸洗、蛋白质降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提，得蜈蚣蛋白质胶内酶解液。
2.4 NanoLCMS/MS分析
胶内及直接酶解液12000 r/min离心后取上清液，ZipTip脱盐，经离心浓缩仪干燥后，0.1%甲酸溶液复溶，高速离心后取上清液注入nanoLCMS/MS仪器分析。
液相为EksigentekspertTM NanoLC液相系统，色谱条件为：Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm， 3 μm）；流动相A：2%乙腈（0.1%甲酸），B：98%乙腈（0.1%甲酸）；流速300 nL/min，自动进样，上样8 μL。梯度洗脱条件为： 0～54 min，5%～25%B；54～75 min，25%～55%B；75～77 min，55%～80%B；77～83 min，80% B；83～90 min，80%～5%B，分析时间90 min。
摘 要 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳升级反相液相色谱串联质谱（nanoRPLCMS/MS）法系统分析了蜈蚣提取蛋白质胶内酶解和直接酶解产物，并进行数据库检索鉴定蛋白质。建立的nanoLC分析条件为：上样8 μL， 经Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm，3 μm），2%乙腈（0.1%甲酸）98%乙腈（0.1%甲酸）梯度洗脱90 min；采用ESIQTOF MS，并在IDA采集模式下分析鉴定蜈蚣提取蛋白质。胶内酶解鉴定到 72 种蛋白质，直接酶解鉴定到 97 种蛋白质，二者含26种相同的蛋白质。通过数据库比对，分析了蜈蚣提取蛋白质的生物进程、细胞组分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白质具有结合、酶催化、肌动等功能活性，其中结合活性的蛋白质占的比例较大，且多为能量代谢进程中的相关酶类。
关键词 纳升级反相液相色谱串联质谱； 蜈蚣； 蛋白质； 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1 引 言
蜈蚣为节肢动物门唇足纲整形目蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch）的干燥体 [1 ]，具有息风镇痉、通络止痛、攻毒散结等功效，已广泛用于临床疾病的治疗。蜈蚣主要含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、总脂、微量元素等 [2～4 ]，且蛋白质为其主要成分，占总成分的50%～70%。药理研究表明其具有抗肿瘤 [5，6 ]、抗凝血 [7，8 ]、抗惊厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究较少，Zhao等 [11 ]从蜈蚣中分离纯化得到一种具有抗肿瘤和免疫活性的多糖蛋白复合物，Kong等 [12 ]从蜈蚣中提取分离出一种多肽，药理实验显示具有抗血栓活性。但目前尚缺少对蜈蚣蛋白质的系统分析方法。本研究首次引入蛋白质组学研究方法，建立了高灵敏、高通量的纳升级反相液相色谱串联质谱方法，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳对蜈蚣提取蛋白质的胶内酶解和直接酶解产物进行分析，并对鉴别到的蛋白质的生物进程、细胞组分及功能活性进行分析，较系统地研究了蜈蚣提取蛋白质，为蜈蚣蛋白质的研究提供了新方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
纳升级液相色谱系统：EksigentekspertTM nanoLC液相系统，Eksigent software V.3.12液相工作站；高分辨质谱系统：TripleTOFTM5600，配有电喷雾离子源（ESI）、Analyst TF 1.6色谱工作站、Peak View 1.2质谱分析软件和ProteinPilot 4.5蛋白质分析软件（美国AB Sciex公司）。垂直凝胶电泳仪（美国Biorad公司）；离心浓缩仪（美国Labconco公司）；ZipTipC18 Pipette Tips（美国Millipore公司）。
十二烷基磺酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）、尿素（UREA）购于Biosharpp公司；碘乙酰胺（IAA，Aladdin公司）；胰蛋白酶（Trypsin，Promega质谱测序级）。乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级（德国Merck公司）。
蜈蚣购于江苏省万生中药饮片有限公司，产地湖北（批号111001），经南京中医药大学中药鉴定教研室陈建伟教授鉴定为少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch）的干燥体。
2.2 蜈蚣总蛋白的提取
蜈蚣药材粉碎后，取粗粉20 mg，加入裂解缓冲溶液（2% SDS，20 mmol/L DTT， 50 mmol/L PBS pH 7.8） 2 mL，65 ℃水浴中孵育过夜。10000 r/min离心20 min，上清液加入乙醇， 使乙醇终浓度为70%，沉淀蛋白。离心后，取沉淀用70%乙醇洗涤2次，沉淀经离心浓缩干燥，
Symbolm@@ 80 ℃保存备用。
2.3 蜈蚣蛋白质酶解
2.3.1 直接酶解
取蜈蚣蛋白约200 μg，加2%SDS，20 mmol/L DTT，50 mmol/L PBS溶液125 μL， 37 ℃孵育60 min， 加入IAA至终浓度为40 mmol/L，室温避光孵育60 min。加入乙醇至终浓度约为70%沉淀蛋白，10000 r/min离心20 min，弃去上清液， 用70%乙醇洗涤沉淀2次，将洗涤后的蛋白质溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中，加入3 μg的胰蛋白酶（50 ∶ 1～100 ∶ 1），37 ℃酶解过夜，得蜈蚣蛋白质直接酶解液。
2.3.2 SDSPAGE及胶内酶解
蜈蚣总提取液经考马斯亮蓝测定浓度后加入样品溶解液，煮沸5 min后上样到配好的凝胶（分离胶浓度12%，浓缩胶5%），10 mV电泳，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。硝酸银染色后，依此经过切胶、浸洗、蛋白质降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提，得蜈蚣蛋白质胶内酶解液。
2.4 NanoLCMS/MS分析
胶内及直接酶解液12000 r/min离心后取上清液，ZipTip脱盐，经离心浓缩仪干燥后，0.1%甲酸溶液复溶，高速离心后取上清液注入nanoLCMS/MS仪器分析。
液相为EksigentekspertTM NanoLC液相系统，色谱条件为：Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm， 3 μm）；流动相A：2%乙腈（0.1%甲酸），B：98%乙腈（0.1%甲酸）；流速300 nL/min，自动进样，上样8 μL。梯度洗脱条件为： 0～54 min，5%～25%B；54～75 min，25%～55%B；75～77 min，55%～80%B；77～83 min，80% B；83～90 min，80%～5%B，分析时间90 min。
摘 要 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳升级反相液相色谱串联质谱（nanoRPLCMS/MS）法系统分析了蜈蚣提取蛋白质胶内酶解和直接酶解产物，并进行数据库检索鉴定蛋白质。建立的nanoLC分析条件为：上样8 μL， 经Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm，3 μm），2%乙腈（0.1%甲酸）98%乙腈（0.1%甲酸）梯度洗脱90 min；采用ESIQTOF MS，并在IDA采集模式下分析鉴定蜈蚣提取蛋白质。胶内酶解鉴定到 72 种蛋白质，直接酶解鉴定到 97 种蛋白质，二者含26种相同的蛋白质。通过数据库比对，分析了蜈蚣提取蛋白质的生物进程、细胞组分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白质具有结合、酶催化、肌动等功能活性，其中结合活性的蛋白质占的比例较大，且多为能量代谢进程中的相关酶类。
关键词 纳升级反相液相色谱串联质谱； 蜈蚣； 蛋白质； 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1 引 言
蜈蚣为节肢动物门唇足纲整形目蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch）的干燥体 [1 ]，具有息风镇痉、通络止痛、攻毒散结等功效，已广泛用于临床疾病的治疗。蜈蚣主要含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、总脂、微量元素等 [2～4 ]，且蛋白质为其主要成分，占总成分的50%～70%。药理研究表明其具有抗肿瘤 [5，6 ]、抗凝血 [7，8 ]、抗惊厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究较少，Zhao等 [11 ]从蜈蚣中分离纯化得到一种具有抗肿瘤和免疫活性的多糖蛋白复合物，Kong等 [12 ]从蜈蚣中提取分离出一种多肽，药理实验显示具有抗血栓活性。但目前尚缺少对蜈蚣蛋白质的系统分析方法。本研究首次引入蛋白质组学研究方法，建立了高灵敏、高通量的纳升级反相液相色谱串联质谱方法，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳对蜈蚣提取蛋白质的胶内酶解和直接酶解产物进行分析，并对鉴别到的蛋白质的生物进程、细胞组分及功能活性进行分析，较系统地研究了蜈蚣提取蛋白质，为蜈蚣蛋白质的研究提供了新方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
纳升级液相色谱系统：EksigentekspertTM nanoLC液相系统，Eksigent software V.3.12液相工作站；高分辨质谱系统：TripleTOFTM5600，配有电喷雾离子源（ESI）、Analyst TF 1.6色谱工作站、Peak View 1.2质谱分析软件和ProteinPilot 4.5蛋白质分析软件（美国AB Sciex公司）。垂直凝胶电泳仪（美国Biorad公司）；离心浓缩仪（美国Labconco公司）；ZipTipC18 Pipette Tips（美国Millipore公司）。
十二烷基磺酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）、尿素（UREA）购于Biosharpp公司；碘乙酰胺（IAA，Aladdin公司）；胰蛋白酶（Trypsin，Promega质谱测序级）。乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级（德国Merck公司）。
蜈蚣购于江苏省万生中药饮片有限公司，产地湖北（批号111001），经南京中医药大学中药鉴定教研室陈建伟教授鉴定为少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch）的干燥体。
2.2 蜈蚣总蛋白的提取
蜈蚣药材粉碎后，取粗粉20 mg，加入裂解缓冲溶液（2% SDS，20 mmol/L DTT， 50 mmol/L PBS pH 7.8） 2 mL，65 ℃水浴中孵育过夜。10000 r/min离心20 min，上清液加入乙醇， 使乙醇终浓度为70%，沉淀蛋白。离心后，取沉淀用70%乙醇洗涤2次，沉淀经离心浓缩干燥，
Symbolm@@ 80 ℃保存备用。
2.3 蜈蚣蛋白质酶解
2.3.1 直接酶解
取蜈蚣蛋白约200 μg，加2%SDS，20 mmol/L DTT，50 mmol/L PBS溶液125 μL， 37 ℃孵育60 min， 加入IAA至终浓度为40 mmol/L，室温避光孵育60 min。加入乙醇至终浓度约为70%沉淀蛋白，10000 r/min离心20 min，弃去上清液， 用70%乙醇洗涤沉淀2次，将洗涤后的蛋白质溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中，加入3 μg的胰蛋白酶（50 ∶ 1～100 ∶ 1），37 ℃酶解过夜，得蜈蚣蛋白质直接酶解液。
2.3.2 SDSPAGE及胶内酶解
蜈蚣总提取液经考马斯亮蓝测定浓度后加入样品溶解液，煮沸5 min后上样到配好的凝胶（分离胶浓度12%，浓缩胶5%），10 mV电泳，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。硝酸银染色后，依此经过切胶、浸洗、蛋白质降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提，得蜈蚣蛋白质胶内酶解液。
2.4 NanoLCMS/MS分析
胶内及直接酶解液12000 r/min离心后取上清液，ZipTip脱盐，经离心浓缩仪干燥后，0.1%甲酸溶液复溶，高速离心后取上清液注入nanoLCMS/MS仪器分析。
液相为EksigentekspertTM NanoLC液相系统，色谱条件为：Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm， 3 μm）；流动相A：2%乙腈（0.1%甲酸），B：98%乙腈（0.1%甲酸）；流速300 nL/min，自动进样，上样8 μL。梯度洗脱条件为： 0～54 min，5%～25%B；54～75 min，25%～55%B；75～77 min，55%～80%B；77～83 min，80% B；83～90 min，80%～5%B，分析时间90 min。
摘 要 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳升级反相液相色谱串联质谱（nanoRPLCMS/MS）法系统分析了蜈蚣提取蛋白质胶内酶解和直接酶解产物，并进行数据库检索鉴定蛋白质。建立的nanoLC分析条件为：上样8 μL， 经Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm，3 μm），2%乙腈（0.1%甲酸）98%乙腈（0.1%甲酸）梯度洗脱90 min；采用ESIQTOF MS，并在IDA采集模式下分析鉴定蜈蚣提取蛋白质。胶内酶解鉴定到 72 种蛋白质，直接酶解鉴定到 97 种蛋白质，二者含26种相同的蛋白质。通过数据库比对，分析了蜈蚣提取蛋白质的生物进程、细胞组分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白质具有结合、酶催化、肌动等功能活性，其中结合活性的蛋白质占的比例较大，且多为能量代谢进程中的相关酶类。
关键词 纳升级反相液相色谱串联质谱； 蜈蚣； 蛋白质； 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1 引 言
蜈蚣为节肢动物门唇足纲整形目蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch）的干燥体 [1 ]，具有息风镇痉、通络止痛、攻毒散结等功效，已广泛用于临床疾病的治疗。蜈蚣主要含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、总脂、微量元素等 [2～4 ]，且蛋白质为其主要成分，占总成分的50%～70%。药理研究表明其具有抗肿瘤 [5，6 ]、抗凝血 [7，8 ]、抗惊厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究较少，Zhao等 [11 ]从蜈蚣中分离纯化得到一种具有抗肿瘤和免疫活性的多糖蛋白复合物，Kong等 [12 ]从蜈蚣中提取分离出一种多肽，药理实验显示具有抗血栓活性。但目前尚缺少对蜈蚣蛋白质的系统分析方法。本研究首次引入蛋白质组学研究方法，建立了高灵敏、高通量的纳升级反相液相色谱串联质谱方法，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳对蜈蚣提取蛋白质的胶内酶解和直接酶解产物进行分析，并对鉴别到的蛋白质的生物进程、细胞组分及功能活性进行分析，较系统地研究了蜈蚣提取蛋白质，为蜈蚣蛋白质的研究提供了新方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
纳升级液相色谱系统：EksigentekspertTM nanoLC液相系统，Eksigent software V.3.12液相工作站；高分辨质谱系统：TripleTOFTM5600，配有电喷雾离子源（ESI）、Analyst TF 1.6色谱工作站、Peak View 1.2质谱分析软件和ProteinPilot 4.5蛋白质分析软件（美国AB Sciex公司）。垂直凝胶电泳仪（美国Biorad公司）；离心浓缩仪（美国Labconco公司）；ZipTipC18 Pipette Tips（美国Millipore公司）。
十二烷基磺酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）、尿素（UREA）购于Biosharpp公司；碘乙酰胺（IAA，Aladdin公司）；胰蛋白酶（Trypsin，Promega质谱测序级）。乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级（德国Merck公司）。
蜈蚣购于江苏省万生中药饮片有限公司，产地湖北（批号111001），经南京中医药大学中药鉴定教研室陈建伟教授鉴定为少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch）的干燥体。
2.2 蜈蚣总蛋白的提取
蜈蚣药材粉碎后，取粗粉20 mg，加入裂解缓冲溶液（2% SDS，20 mmol/L DTT， 50 mmol/L PBS pH 7.8） 2 mL，65 ℃水浴中孵育过夜。10000 r/min离心20 min，上清液加入乙醇， 使乙醇终浓度为70%，沉淀蛋白。离心后，取沉淀用70%乙醇洗涤2次，沉淀经离心浓缩干燥，
Symbolm@@ 80 ℃保存备用。
2.3 蜈蚣蛋白质酶解
2.3.1 直接酶解
取蜈蚣蛋白约200 μg，加2%SDS，20 mmol/L DTT，50 mmol/L PBS溶液125 μL， 37 ℃孵育60 min， 加入IAA至终浓度为40 mmol/L，室温避光孵育60 min。加入乙醇至终浓度约为70%沉淀蛋白，10000 r/min离心20 min，弃去上清液， 用70%乙醇洗涤沉淀2次，将洗涤后的蛋白质溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中，加入3 μg的胰蛋白酶（50 ∶ 1～100 ∶ 1），37 ℃酶解过夜，得蜈蚣蛋白质直接酶解液。
2.3.2 SDSPAGE及胶内酶解
蜈蚣总提取液经考马斯亮蓝测定浓度后加入样品溶解液，煮沸5 min后上样到配好的凝胶（分离胶浓度12%，浓缩胶5%），10 mV电泳，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。硝酸银染色后，依此经过切胶、浸洗、蛋白质降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提，得蜈蚣蛋白质胶内酶解液。
2.4 NanoLCMS/MS分析
胶内及直接酶解液12000 r/min离心后取上清液，ZipTip脱盐，经离心浓缩仪干燥后，0.1%甲酸溶液复溶，高速离心后取上清液注入nanoLCMS/MS仪器分析。
液相为EksigentekspertTM NanoLC液相系统，色谱条件为：Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm， 3 μm）；流动相A：2%乙腈（0.1%甲酸），B：98%乙腈（0.1%甲酸）；流速300 nL/min，自动进样，上样8 μL。梯度洗脱条件为： 0～54 min，5%～25%B；54～75 min，25%～55%B；75～77 min，55%～80%B；77～83 min，80% B；83～90 min，80%～5%B，分析时间90 min。
摘 要 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳升级反相液相色谱串联质谱（nanoRPLCMS/MS）法系统分析了蜈蚣提取蛋白质胶内酶解和直接酶解产物，并进行数据库检索鉴定蛋白质。建立的nanoLC分析条件为：上样8 μL， 经Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm，3 μm），2%乙腈（0.1%甲酸）98%乙腈（0.1%甲酸）梯度洗脱90 min；采用ESIQTOF MS，并在IDA采集模式下分析鉴定蜈蚣提取蛋白质。胶内酶解鉴定到 72 种蛋白质，直接酶解鉴定到 97 种蛋白质，二者含26种相同的蛋白质。通过数据库比对，分析了蜈蚣提取蛋白质的生物进程、细胞组分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白质具有结合、酶催化、肌动等功能活性，其中结合活性的蛋白质占的比例较大，且多为能量代谢进程中的相关酶类。
关键词 纳升级反相液相色谱串联质谱； 蜈蚣； 蛋白质； 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1 引 言
蜈蚣为节肢动物门唇足纲整形目蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch）的干燥体 [1 ]，具有息风镇痉、通络止痛、攻毒散结等功效，已广泛用于临床疾病的治疗。蜈蚣主要含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、总脂、微量元素等 [2～4 ]，且蛋白质为其主要成分，占总成分的50%～70%。药理研究表明其具有抗肿瘤 [5，6 ]、抗凝血 [7，8 ]、抗惊厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究较少，Zhao等 [11 ]从蜈蚣中分离纯化得到一种具有抗肿瘤和免疫活性的多糖蛋白复合物，Kong等 [12 ]从蜈蚣中提取分离出一种多肽，药理实验显示具有抗血栓活性。但目前尚缺少对蜈蚣蛋白质的系统分析方法。本研究首次引入蛋白质组学研究方法，建立了高灵敏、高通量的纳升级反相液相色谱串联质谱方法，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳对蜈蚣提取蛋白质的胶内酶解和直接酶解产物进行分析，并对鉴别到的蛋白质的生物进程、细胞组分及功能活性进行分析，较系统地研究了蜈蚣提取蛋白质，为蜈蚣蛋白质的研究提供了新方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
纳升级液相色谱系统：EksigentekspertTM nanoLC液相系统，Eksigent software V.3.12液相工作站；高分辨质谱系统：TripleTOFTM5600，配有电喷雾离子源（ESI）、Analyst TF 1.6色谱工作站、Peak View 1.2质谱分析软件和ProteinPilot 4.5蛋白质分析软件（美国AB Sciex公司）。垂直凝胶电泳仪（美国Biorad公司）；离心浓缩仪（美国Labconco公司）；ZipTipC18 Pipette Tips（美国Millipore公司）。
十二烷基磺酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）、尿素（UREA）购于Biosharpp公司；碘乙酰胺（IAA，Aladdin公司）；胰蛋白酶（Trypsin，Promega质谱测序级）。乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级（德国Merck公司）。
蜈蚣购于江苏省万生中药饮片有限公司，产地湖北（批号111001），经南京中医药大学中药鉴定教研室陈建伟教授鉴定为少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch）的干燥体。
2.2 蜈蚣总蛋白的提取
蜈蚣药材粉碎后，取粗粉20 mg，加入裂解缓冲溶液（2% SDS，20 mmol/L DTT， 50 mmol/L PBS pH 7.8） 2 mL，65 ℃水浴中孵育过夜。10000 r/min离心20 min，上清液加入乙醇， 使乙醇终浓度为70%，沉淀蛋白。离心后，取沉淀用70%乙醇洗涤2次，沉淀经离心浓缩干燥，
Symbolm@@ 80 ℃保存备用。
2.3 蜈蚣蛋白质酶解
2.3.1 直接酶解
取蜈蚣蛋白约200 μg，加2%SDS，20 mmol/L DTT，50 mmol/L PBS溶液125 μL， 37 ℃孵育60 min， 加入IAA至终浓度为40 mmol/L，室温避光孵育60 min。加入乙醇至终浓度约为70%沉淀蛋白，10000 r/min离心20 min，弃去上清液， 用70%乙醇洗涤沉淀2次，将洗涤后的蛋白质溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中，加入3 μg的胰蛋白酶（50 ∶ 1～100 ∶ 1），37 ℃酶解过夜，得蜈蚣蛋白质直接酶解液。
2.3.2 SDSPAGE及胶内酶解
蜈蚣总提取液经考马斯亮蓝测定浓度后加入样品溶解液，煮沸5 min后上样到配好的凝胶（分离胶浓度12%，浓缩胶5%），10 mV电泳，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。硝酸银染色后，依此经过切胶、浸洗、蛋白质降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提，得蜈蚣蛋白质胶内酶解液。
2.4 NanoLCMS/MS分析
胶内及直接酶解液12000 r/min离心后取上清液，ZipTip脱盐，经离心浓缩仪干燥后，0.1%甲酸溶液复溶，高速离心后取上清液注入nanoLCMS/MS仪器分析。
液相为EksigentekspertTM NanoLC液相系统，色谱条件为：Chrom XPC18毛细管柱（350 μm×0.5 mm， 3 μm）；流动相A：2%乙腈（0.1%甲酸），B：98%乙腈（0.1%甲酸）；流速300 nL/min，自动进样，上样8 μL。梯度洗脱条件为： 0～54 min，5%～25%B；54～75 min，25%～55%B；75～77 min，55%～80%B；77～83 min，80% B；83～90 min，80%～5%B，分析时间90 min。
