稳定同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法测定饲料中24种禁用兽药含量
周鹏 林钦 黄红霞等
摘 要 建立了同时定性与定量分析动物饲料种24中禁用药物的超高效液相色谱串联质谱（UHPLCMS/MS）分析方法。样品经Na2HPO4与饱和NaCl溶液共同盐析， 乙腈提取，混合阳离子交换固相萃取柱（PCX）净化，乙腈和0.3%甲酸溶液梯度洗脱，经BEH C18色谱柱分离，串联四级杆质谱动态多反应监测正离子模式监测，稳定同位素标记内标法定量。在最佳实验条件下，24种禁用兽药在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.9960，检出限为1.0 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg，加标回收率在77%～115%之间，相对标准偏差小于10%。本方法的样品前处理过程简单，净化效果好，有效解决了基质效应问题，灵敏度高，适用于各种饲料中多组分禁用兽药的快速定性与定量分析。
关键词 超高效液相色谱串联质谱； 稳定同位素内标； 动态多反应监测； 禁用兽药； 饲料
1 引 言
兽药在养殖业发展中具有举足轻重的作用，但是由于养殖环境以及养殖水平不佳，或者为了提高饲料转化率，出现滥用兽药的现象。农业部分别于2002年和2010年发布176号公告 [1 ]、193号公告 [2 ]和1519号公告 [3 ]，向社会公布了禁用药物清单，包括肾上腺素受体激动剂、β1受体阻断药、抗组胺药、抗高血压药等药物。这些药物多会通过食物链传导，给人类带来巨大危害。
近年来，科研人员针对不同种类药物，研发出多种分析方法，主要包括基因芯片法 [4 ]、毛细管电泳法 [5 ]、气相色谱质谱联用法 [6，7 ]、液相色谱质谱联用法 [8，9 ]、高效液相色谱法 [10，11 ]、酶联免疫法 [12 ]等。然而现有方法存在分析目标物种类单一、部分化合物还未发现检测方法，对预混料等复杂基质样品回收率较差等问题，不利于复杂样本的大规模筛查。本研究对样品处理方法进行改进，结合液相色谱串联质谱法建立了24种禁用药物的分析方法，为饲料中违禁药物的监管提供了一种快速、可靠的检测方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
6490三重四级杆质谱仪，配1290超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Waters BEH C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美国Waters 公司）；Avanti JE 离心机（美国贝克曼公司）； DS8510 DTH超声波清洗机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）。
标准物质以及稳定同位素内标分别购于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH和德国Witega公司。甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国Merck公司）；Na2HPO4、NaCl、氨水（分析纯，国药集团）。Cleanert PCX混合阳离子交换固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL，博纳艾杰尔科技公司）； 0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜（津腾公司）；实验样品为市售样品。
2.2 实验方法
2.2.1 标准溶液配制 分别准确称取各种标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到标准储备液，于
Symbolm@@ 18 ℃下避光保存。准确移取适量各标准储备液，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液逐级稀释成标准系列，其中4种内标浓度均为2.0 μg/L。
2.2.2 样品的提取与净化
称取粉碎并混合均匀的饲料样品（2.0±0.05） g于50 mL离心管中，分别加入100 μL内标（浓度为200 μg/L）、5 mL 1.0 mol/L Na2HPO4、5 mL饱和NaCl和5 mL乙腈溶液，振摇混匀后超声提取30 min，每隔10 min振摇一次。超声结束后离心5 min（4000 r/min），吸取上层乙腈于10 mL比色管中，下层再次加入5 mL 乙腈，摇匀后超声提取20 min， 离心5 min（4000 r/min），合并乙腈层，用乙腈定容至10.0 mL。移取乙腈提取液2.0 mL，40 ℃下氮吹至近干，加入3mL 1%甲酸水涡旋复溶后待净化。将上述溶液过柱（使用前依次用3 mL 1%甲酸甲醇、3 mL 1%甲酸水活化），依次用3 mL 1%甲酸水、3 mL 1%甲酸甲醇淋洗并抽干，最后3 mL 5%氨水甲醇洗脱。流速控制在1 mL/min以下。洗脱液在40 ℃下氮气吹至近干，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液定容至2.0 mL，过0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜后上机测试。
2.3 色谱质谱条件
2.3.1 色谱条件 柱温 40 ℃；进样量 2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A：0.3%甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5 min，0% B；0.5～8.0 min， 0%～65% B；8.01～10.0 min， 90% B；10.01～12.0 min， 0% B。
2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子模式；动态多反应监测（dMRM）；脱溶剂气温度200 ℃；脱溶剂气流速15 L/min；雾化气压力241.3 kPa； 鞘气温度350 ℃； 鞘气流速12 L /min；毛细管电压3.5 kV； 喷嘴电压 0 V。
3 结果与讨论
3.1 液相色谱及质谱条件的优化
各化合物分别采用约1 mg/L的标准品溶液直接进入质谱仪进行质谱参数的优化。本实验中的目标化合物多数具有胺基结构，易与质子结合，形成 [M+H ]+离子，因此采用正离子模式进行检测，并选择 [M+H ]+为母离子，响应最高的子离子作为定量离子，响应次高的离子作为定性离子。由于同时监测的离子对较多，采用动态多反应监测模式可以有效地分配扫描时间，保证每个色谱峰足够的采集点数以及灵敏度。莱克多巴胺与苯氧丙酚胺为同分异构体，具有相同质荷比的母离子及子离子，需优化液相色谱分离条件，避免两种化合物检测中的相互干扰。流动相中加入少量甲酸不仅可以改善色谱峰形，而且有利于目标化合物离子化，提高灵敏度。优化后的各种待测化合物的保留时间、定性定量离子、碰撞能量、监测时间窗口等参数见表1。
摘 要 建立了同时定性与定量分析动物饲料种24中禁用药物的超高效液相色谱串联质谱（UHPLCMS/MS）分析方法。样品经Na2HPO4与饱和NaCl溶液共同盐析， 乙腈提取，混合阳离子交换固相萃取柱（PCX）净化，乙腈和0.3%甲酸溶液梯度洗脱，经BEH C18色谱柱分离，串联四级杆质谱动态多反应监测正离子模式监测，稳定同位素标记内标法定量。在最佳实验条件下，24种禁用兽药在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.9960，检出限为1.0 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg，加标回收率在77%～115%之间，相对标准偏差小于10%。本方法的样品前处理过程简单，净化效果好，有效解决了基质效应问题，灵敏度高，适用于各种饲料中多组分禁用兽药的快速定性与定量分析。
关键词 超高效液相色谱串联质谱； 稳定同位素内标； 动态多反应监测； 禁用兽药； 饲料
1 引 言
兽药在养殖业发展中具有举足轻重的作用，但是由于养殖环境以及养殖水平不佳，或者为了提高饲料转化率，出现滥用兽药的现象。农业部分别于2002年和2010年发布176号公告 [1 ]、193号公告 [2 ]和1519号公告 [3 ]，向社会公布了禁用药物清单，包括肾上腺素受体激动剂、β1受体阻断药、抗组胺药、抗高血压药等药物。这些药物多会通过食物链传导，给人类带来巨大危害。
近年来，科研人员针对不同种类药物，研发出多种分析方法，主要包括基因芯片法 [4 ]、毛细管电泳法 [5 ]、气相色谱质谱联用法 [6，7 ]、液相色谱质谱联用法 [8，9 ]、高效液相色谱法 [10，11 ]、酶联免疫法 [12 ]等。然而现有方法存在分析目标物种类单一、部分化合物还未发现检测方法，对预混料等复杂基质样品回收率较差等问题，不利于复杂样本的大规模筛查。本研究对样品处理方法进行改进，结合液相色谱串联质谱法建立了24种禁用药物的分析方法，为饲料中违禁药物的监管提供了一种快速、可靠的检测方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
6490三重四级杆质谱仪，配1290超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Waters BEH C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美国Waters 公司）；Avanti JE 离心机（美国贝克曼公司）； DS8510 DTH超声波清洗机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）。
标准物质以及稳定同位素内标分别购于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH和德国Witega公司。甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国Merck公司）；Na2HPO4、NaCl、氨水（分析纯，国药集团）。Cleanert PCX混合阳离子交换固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL，博纳艾杰尔科技公司）； 0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜（津腾公司）；实验样品为市售样品。
2.2 实验方法
2.2.1 标准溶液配制 分别准确称取各种标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到标准储备液，于
Symbolm@@ 18 ℃下避光保存。准确移取适量各标准储备液，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液逐级稀释成标准系列，其中4种内标浓度均为2.0 μg/L。
2.2.2 样品的提取与净化
称取粉碎并混合均匀的饲料样品（2.0±0.05） g于50 mL离心管中，分别加入100 μL内标（浓度为200 μg/L）、5 mL 1.0 mol/L Na2HPO4、5 mL饱和NaCl和5 mL乙腈溶液，振摇混匀后超声提取30 min，每隔10 min振摇一次。超声结束后离心5 min（4000 r/min），吸取上层乙腈于10 mL比色管中，下层再次加入5 mL 乙腈，摇匀后超声提取20 min， 离心5 min（4000 r/min），合并乙腈层，用乙腈定容至10.0 mL。移取乙腈提取液2.0 mL，40 ℃下氮吹至近干，加入3mL 1%甲酸水涡旋复溶后待净化。将上述溶液过柱（使用前依次用3 mL 1%甲酸甲醇、3 mL 1%甲酸水活化），依次用3 mL 1%甲酸水、3 mL 1%甲酸甲醇淋洗并抽干，最后3 mL 5%氨水甲醇洗脱。流速控制在1 mL/min以下。洗脱液在40 ℃下氮气吹至近干，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液定容至2.0 mL，过0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜后上机测试。
2.3 色谱质谱条件
2.3.1 色谱条件 柱温 40 ℃；进样量 2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A：0.3%甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5 min，0% B；0.5～8.0 min， 0%～65% B；8.01～10.0 min， 90% B；10.01～12.0 min， 0% B。
2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子模式；动态多反应监测（dMRM）；脱溶剂气温度200 ℃；脱溶剂气流速15 L/min；雾化气压力241.3 kPa； 鞘气温度350 ℃； 鞘气流速12 L /min；毛细管电压3.5 kV； 喷嘴电压 0 V。
3 结果与讨论
3.1 液相色谱及质谱条件的优化
各化合物分别采用约1 mg/L的标准品溶液直接进入质谱仪进行质谱参数的优化。本实验中的目标化合物多数具有胺基结构，易与质子结合，形成 [M+H ]+离子，因此采用正离子模式进行检测，并选择 [M+H ]+为母离子，响应最高的子离子作为定量离子，响应次高的离子作为定性离子。由于同时监测的离子对较多，采用动态多反应监测模式可以有效地分配扫描时间，保证每个色谱峰足够的采集点数以及灵敏度。莱克多巴胺与苯氧丙酚胺为同分异构体，具有相同质荷比的母离子及子离子，需优化液相色谱分离条件，避免两种化合物检测中的相互干扰。流动相中加入少量甲酸不仅可以改善色谱峰形，而且有利于目标化合物离子化，提高灵敏度。优化后的各种待测化合物的保留时间、定性定量离子、碰撞能量、监测时间窗口等参数见表1。
摘 要 建立了同时定性与定量分析动物饲料种24中禁用药物的超高效液相色谱串联质谱（UHPLCMS/MS）分析方法。样品经Na2HPO4与饱和NaCl溶液共同盐析， 乙腈提取，混合阳离子交换固相萃取柱（PCX）净化，乙腈和0.3%甲酸溶液梯度洗脱，经BEH C18色谱柱分离，串联四级杆质谱动态多反应监测正离子模式监测，稳定同位素标记内标法定量。在最佳实验条件下，24种禁用兽药在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.9960，检出限为1.0 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg，加标回收率在77%～115%之间，相对标准偏差小于10%。本方法的样品前处理过程简单，净化效果好，有效解决了基质效应问题，灵敏度高，适用于各种饲料中多组分禁用兽药的快速定性与定量分析。
关键词 超高效液相色谱串联质谱； 稳定同位素内标； 动态多反应监测； 禁用兽药； 饲料
1 引 言
兽药在养殖业发展中具有举足轻重的作用，但是由于养殖环境以及养殖水平不佳，或者为了提高饲料转化率，出现滥用兽药的现象。农业部分别于2002年和2010年发布176号公告 [1 ]、193号公告 [2 ]和1519号公告 [3 ]，向社会公布了禁用药物清单，包括肾上腺素受体激动剂、β1受体阻断药、抗组胺药、抗高血压药等药物。这些药物多会通过食物链传导，给人类带来巨大危害。
近年来，科研人员针对不同种类药物，研发出多种分析方法，主要包括基因芯片法 [4 ]、毛细管电泳法 [5 ]、气相色谱质谱联用法 [6，7 ]、液相色谱质谱联用法 [8，9 ]、高效液相色谱法 [10，11 ]、酶联免疫法 [12 ]等。然而现有方法存在分析目标物种类单一、部分化合物还未发现检测方法，对预混料等复杂基质样品回收率较差等问题，不利于复杂样本的大规模筛查。本研究对样品处理方法进行改进，结合液相色谱串联质谱法建立了24种禁用药物的分析方法，为饲料中违禁药物的监管提供了一种快速、可靠的检测方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
6490三重四级杆质谱仪，配1290超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Waters BEH C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美国Waters 公司）；Avanti JE 离心机（美国贝克曼公司）； DS8510 DTH超声波清洗机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）。
标准物质以及稳定同位素内标分别购于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH和德国Witega公司。甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国Merck公司）；Na2HPO4、NaCl、氨水（分析纯，国药集团）。Cleanert PCX混合阳离子交换固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL，博纳艾杰尔科技公司）； 0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜（津腾公司）；实验样品为市售样品。
2.2 实验方法
2.2.1 标准溶液配制 分别准确称取各种标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到标准储备液，于
Symbolm@@ 18 ℃下避光保存。准确移取适量各标准储备液，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液逐级稀释成标准系列，其中4种内标浓度均为2.0 μg/L。
2.2.2 样品的提取与净化
称取粉碎并混合均匀的饲料样品（2.0±0.05） g于50 mL离心管中，分别加入100 μL内标（浓度为200 μg/L）、5 mL 1.0 mol/L Na2HPO4、5 mL饱和NaCl和5 mL乙腈溶液，振摇混匀后超声提取30 min，每隔10 min振摇一次。超声结束后离心5 min（4000 r/min），吸取上层乙腈于10 mL比色管中，下层再次加入5 mL 乙腈，摇匀后超声提取20 min， 离心5 min（4000 r/min），合并乙腈层，用乙腈定容至10.0 mL。移取乙腈提取液2.0 mL，40 ℃下氮吹至近干，加入3mL 1%甲酸水涡旋复溶后待净化。将上述溶液过柱（使用前依次用3 mL 1%甲酸甲醇、3 mL 1%甲酸水活化），依次用3 mL 1%甲酸水、3 mL 1%甲酸甲醇淋洗并抽干，最后3 mL 5%氨水甲醇洗脱。流速控制在1 mL/min以下。洗脱液在40 ℃下氮气吹至近干，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液定容至2.0 mL，过0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜后上机测试。
2.3 色谱质谱条件
2.3.1 色谱条件 柱温 40 ℃；进样量 2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A：0.3%甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5 min，0% B；0.5～8.0 min， 0%～65% B；8.01～10.0 min， 90% B；10.01～12.0 min， 0% B。
2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子模式；动态多反应监测（dMRM）；脱溶剂气温度200 ℃；脱溶剂气流速15 L/min；雾化气压力241.3 kPa； 鞘气温度350 ℃； 鞘气流速12 L /min；毛细管电压3.5 kV； 喷嘴电压 0 V。
3 结果与讨论
3.1 液相色谱及质谱条件的优化
各化合物分别采用约1 mg/L的标准品溶液直接进入质谱仪进行质谱参数的优化。本实验中的目标化合物多数具有胺基结构，易与质子结合，形成 [M+H ]+离子，因此采用正离子模式进行检测，并选择 [M+H ]+为母离子，响应最高的子离子作为定量离子，响应次高的离子作为定性离子。由于同时监测的离子对较多，采用动态多反应监测模式可以有效地分配扫描时间，保证每个色谱峰足够的采集点数以及灵敏度。莱克多巴胺与苯氧丙酚胺为同分异构体，具有相同质荷比的母离子及子离子，需优化液相色谱分离条件，避免两种化合物检测中的相互干扰。流动相中加入少量甲酸不仅可以改善色谱峰形，而且有利于目标化合物离子化，提高灵敏度。优化后的各种待测化合物的保留时间、定性定量离子、碰撞能量、监测时间窗口等参数见表1。
摘 要 建立了同时定性与定量分析动物饲料种24中禁用药物的超高效液相色谱串联质谱（UHPLCMS/MS）分析方法。样品经Na2HPO4与饱和NaCl溶液共同盐析， 乙腈提取，混合阳离子交换固相萃取柱（PCX）净化，乙腈和0.3%甲酸溶液梯度洗脱，经BEH C18色谱柱分离，串联四级杆质谱动态多反应监测正离子模式监测，稳定同位素标记内标法定量。在最佳实验条件下，24种禁用兽药在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.9960，检出限为1.0 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg，加标回收率在77%～115%之间，相对标准偏差小于10%。本方法的样品前处理过程简单，净化效果好，有效解决了基质效应问题，灵敏度高，适用于各种饲料中多组分禁用兽药的快速定性与定量分析。
关键词 超高效液相色谱串联质谱； 稳定同位素内标； 动态多反应监测； 禁用兽药； 饲料
1 引 言
兽药在养殖业发展中具有举足轻重的作用，但是由于养殖环境以及养殖水平不佳，或者为了提高饲料转化率，出现滥用兽药的现象。农业部分别于2002年和2010年发布176号公告 [1 ]、193号公告 [2 ]和1519号公告 [3 ]，向社会公布了禁用药物清单，包括肾上腺素受体激动剂、β1受体阻断药、抗组胺药、抗高血压药等药物。这些药物多会通过食物链传导，给人类带来巨大危害。
近年来，科研人员针对不同种类药物，研发出多种分析方法，主要包括基因芯片法 [4 ]、毛细管电泳法 [5 ]、气相色谱质谱联用法 [6，7 ]、液相色谱质谱联用法 [8，9 ]、高效液相色谱法 [10，11 ]、酶联免疫法 [12 ]等。然而现有方法存在分析目标物种类单一、部分化合物还未发现检测方法，对预混料等复杂基质样品回收率较差等问题，不利于复杂样本的大规模筛查。本研究对样品处理方法进行改进，结合液相色谱串联质谱法建立了24种禁用药物的分析方法，为饲料中违禁药物的监管提供了一种快速、可靠的检测方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
6490三重四级杆质谱仪，配1290超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Waters BEH C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美国Waters 公司）；Avanti JE 离心机（美国贝克曼公司）； DS8510 DTH超声波清洗机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）。
标准物质以及稳定同位素内标分别购于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH和德国Witega公司。甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国Merck公司）；Na2HPO4、NaCl、氨水（分析纯，国药集团）。Cleanert PCX混合阳离子交换固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL，博纳艾杰尔科技公司）； 0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜（津腾公司）；实验样品为市售样品。
2.2 实验方法
2.2.1 标准溶液配制 分别准确称取各种标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到标准储备液，于
Symbolm@@ 18 ℃下避光保存。准确移取适量各标准储备液，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液逐级稀释成标准系列，其中4种内标浓度均为2.0 μg/L。
2.2.2 样品的提取与净化
称取粉碎并混合均匀的饲料样品（2.0±0.05） g于50 mL离心管中，分别加入100 μL内标（浓度为200 μg/L）、5 mL 1.0 mol/L Na2HPO4、5 mL饱和NaCl和5 mL乙腈溶液，振摇混匀后超声提取30 min，每隔10 min振摇一次。超声结束后离心5 min（4000 r/min），吸取上层乙腈于10 mL比色管中，下层再次加入5 mL 乙腈，摇匀后超声提取20 min， 离心5 min（4000 r/min），合并乙腈层，用乙腈定容至10.0 mL。移取乙腈提取液2.0 mL，40 ℃下氮吹至近干，加入3mL 1%甲酸水涡旋复溶后待净化。将上述溶液过柱（使用前依次用3 mL 1%甲酸甲醇、3 mL 1%甲酸水活化），依次用3 mL 1%甲酸水、3 mL 1%甲酸甲醇淋洗并抽干，最后3 mL 5%氨水甲醇洗脱。流速控制在1 mL/min以下。洗脱液在40 ℃下氮气吹至近干，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液定容至2.0 mL，过0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜后上机测试。
2.3 色谱质谱条件
2.3.1 色谱条件 柱温 40 ℃；进样量 2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A：0.3%甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5 min，0% B；0.5～8.0 min， 0%～65% B；8.01～10.0 min， 90% B；10.01～12.0 min， 0% B。
2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子模式；动态多反应监测（dMRM）；脱溶剂气温度200 ℃；脱溶剂气流速15 L/min；雾化气压力241.3 kPa； 鞘气温度350 ℃； 鞘气流速12 L /min；毛细管电压3.5 kV； 喷嘴电压 0 V。
3 结果与讨论
3.1 液相色谱及质谱条件的优化
各化合物分别采用约1 mg/L的标准品溶液直接进入质谱仪进行质谱参数的优化。本实验中的目标化合物多数具有胺基结构，易与质子结合，形成 [M+H ]+离子，因此采用正离子模式进行检测，并选择 [M+H ]+为母离子，响应最高的子离子作为定量离子，响应次高的离子作为定性离子。由于同时监测的离子对较多，采用动态多反应监测模式可以有效地分配扫描时间，保证每个色谱峰足够的采集点数以及灵敏度。莱克多巴胺与苯氧丙酚胺为同分异构体，具有相同质荷比的母离子及子离子，需优化液相色谱分离条件，避免两种化合物检测中的相互干扰。流动相中加入少量甲酸不仅可以改善色谱峰形，而且有利于目标化合物离子化，提高灵敏度。优化后的各种待测化合物的保留时间、定性定量离子、碰撞能量、监测时间窗口等参数见表1。
摘 要 建立了同时定性与定量分析动物饲料种24中禁用药物的超高效液相色谱串联质谱（UHPLCMS/MS）分析方法。样品经Na2HPO4与饱和NaCl溶液共同盐析， 乙腈提取，混合阳离子交换固相萃取柱（PCX）净化，乙腈和0.3%甲酸溶液梯度洗脱，经BEH C18色谱柱分离，串联四级杆质谱动态多反应监测正离子模式监测，稳定同位素标记内标法定量。在最佳实验条件下，24种禁用兽药在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.9960，检出限为1.0 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg，加标回收率在77%～115%之间，相对标准偏差小于10%。本方法的样品前处理过程简单，净化效果好，有效解决了基质效应问题，灵敏度高，适用于各种饲料中多组分禁用兽药的快速定性与定量分析。
关键词 超高效液相色谱串联质谱； 稳定同位素内标； 动态多反应监测； 禁用兽药； 饲料
1 引 言
兽药在养殖业发展中具有举足轻重的作用，但是由于养殖环境以及养殖水平不佳，或者为了提高饲料转化率，出现滥用兽药的现象。农业部分别于2002年和2010年发布176号公告 [1 ]、193号公告 [2 ]和1519号公告 [3 ]，向社会公布了禁用药物清单，包括肾上腺素受体激动剂、β1受体阻断药、抗组胺药、抗高血压药等药物。这些药物多会通过食物链传导，给人类带来巨大危害。
近年来，科研人员针对不同种类药物，研发出多种分析方法，主要包括基因芯片法 [4 ]、毛细管电泳法 [5 ]、气相色谱质谱联用法 [6，7 ]、液相色谱质谱联用法 [8，9 ]、高效液相色谱法 [10，11 ]、酶联免疫法 [12 ]等。然而现有方法存在分析目标物种类单一、部分化合物还未发现检测方法，对预混料等复杂基质样品回收率较差等问题，不利于复杂样本的大规模筛查。本研究对样品处理方法进行改进，结合液相色谱串联质谱法建立了24种禁用药物的分析方法，为饲料中违禁药物的监管提供了一种快速、可靠的检测方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
6490三重四级杆质谱仪，配1290超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Waters BEH C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美国Waters 公司）；Avanti JE 离心机（美国贝克曼公司）； DS8510 DTH超声波清洗机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）。
标准物质以及稳定同位素内标分别购于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH和德国Witega公司。甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国Merck公司）；Na2HPO4、NaCl、氨水（分析纯，国药集团）。Cleanert PCX混合阳离子交换固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL，博纳艾杰尔科技公司）； 0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜（津腾公司）；实验样品为市售样品。
2.2 实验方法
2.2.1 标准溶液配制 分别准确称取各种标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到标准储备液，于
Symbolm@@ 18 ℃下避光保存。准确移取适量各标准储备液，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液逐级稀释成标准系列，其中4种内标浓度均为2.0 μg/L。
2.2.2 样品的提取与净化
称取粉碎并混合均匀的饲料样品（2.0±0.05） g于50 mL离心管中，分别加入100 μL内标（浓度为200 μg/L）、5 mL 1.0 mol/L Na2HPO4、5 mL饱和NaCl和5 mL乙腈溶液，振摇混匀后超声提取30 min，每隔10 min振摇一次。超声结束后离心5 min（4000 r/min），吸取上层乙腈于10 mL比色管中，下层再次加入5 mL 乙腈，摇匀后超声提取20 min， 离心5 min（4000 r/min），合并乙腈层，用乙腈定容至10.0 mL。移取乙腈提取液2.0 mL，40 ℃下氮吹至近干，加入3mL 1%甲酸水涡旋复溶后待净化。将上述溶液过柱（使用前依次用3 mL 1%甲酸甲醇、3 mL 1%甲酸水活化），依次用3 mL 1%甲酸水、3 mL 1%甲酸甲醇淋洗并抽干，最后3 mL 5%氨水甲醇洗脱。流速控制在1 mL/min以下。洗脱液在40 ℃下氮气吹至近干，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液定容至2.0 mL，过0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜后上机测试。
2.3 色谱质谱条件
2.3.1 色谱条件 柱温 40 ℃；进样量 2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A：0.3%甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5 min，0% B；0.5～8.0 min， 0%～65% B；8.01～10.0 min， 90% B；10.01～12.0 min， 0% B。
2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子模式；动态多反应监测（dMRM）；脱溶剂气温度200 ℃；脱溶剂气流速15 L/min；雾化气压力241.3 kPa； 鞘气温度350 ℃； 鞘气流速12 L /min；毛细管电压3.5 kV； 喷嘴电压 0 V。
3 结果与讨论
3.1 液相色谱及质谱条件的优化
各化合物分别采用约1 mg/L的标准品溶液直接进入质谱仪进行质谱参数的优化。本实验中的目标化合物多数具有胺基结构，易与质子结合，形成 [M+H ]+离子，因此采用正离子模式进行检测，并选择 [M+H ]+为母离子，响应最高的子离子作为定量离子，响应次高的离子作为定性离子。由于同时监测的离子对较多，采用动态多反应监测模式可以有效地分配扫描时间，保证每个色谱峰足够的采集点数以及灵敏度。莱克多巴胺与苯氧丙酚胺为同分异构体，具有相同质荷比的母离子及子离子，需优化液相色谱分离条件，避免两种化合物检测中的相互干扰。流动相中加入少量甲酸不仅可以改善色谱峰形，而且有利于目标化合物离子化，提高灵敏度。优化后的各种待测化合物的保留时间、定性定量离子、碰撞能量、监测时间窗口等参数见表1。
摘 要 建立了同时定性与定量分析动物饲料种24中禁用药物的超高效液相色谱串联质谱（UHPLCMS/MS）分析方法。样品经Na2HPO4与饱和NaCl溶液共同盐析， 乙腈提取，混合阳离子交换固相萃取柱（PCX）净化，乙腈和0.3%甲酸溶液梯度洗脱，经BEH C18色谱柱分离，串联四级杆质谱动态多反应监测正离子模式监测，稳定同位素标记内标法定量。在最佳实验条件下，24种禁用兽药在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.9960，检出限为1.0 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg，加标回收率在77%～115%之间，相对标准偏差小于10%。本方法的样品前处理过程简单，净化效果好，有效解决了基质效应问题，灵敏度高，适用于各种饲料中多组分禁用兽药的快速定性与定量分析。
关键词 超高效液相色谱串联质谱； 稳定同位素内标； 动态多反应监测； 禁用兽药； 饲料
1 引 言
兽药在养殖业发展中具有举足轻重的作用，但是由于养殖环境以及养殖水平不佳，或者为了提高饲料转化率，出现滥用兽药的现象。农业部分别于2002年和2010年发布176号公告 [1 ]、193号公告 [2 ]和1519号公告 [3 ]，向社会公布了禁用药物清单，包括肾上腺素受体激动剂、β1受体阻断药、抗组胺药、抗高血压药等药物。这些药物多会通过食物链传导，给人类带来巨大危害。
近年来，科研人员针对不同种类药物，研发出多种分析方法，主要包括基因芯片法 [4 ]、毛细管电泳法 [5 ]、气相色谱质谱联用法 [6，7 ]、液相色谱质谱联用法 [8，9 ]、高效液相色谱法 [10，11 ]、酶联免疫法 [12 ]等。然而现有方法存在分析目标物种类单一、部分化合物还未发现检测方法，对预混料等复杂基质样品回收率较差等问题，不利于复杂样本的大规模筛查。本研究对样品处理方法进行改进，结合液相色谱串联质谱法建立了24种禁用药物的分析方法，为饲料中违禁药物的监管提供了一种快速、可靠的检测方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
6490三重四级杆质谱仪，配1290超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Waters BEH C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美国Waters 公司）；Avanti JE 离心机（美国贝克曼公司）； DS8510 DTH超声波清洗机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）。
标准物质以及稳定同位素内标分别购于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH和德国Witega公司。甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国Merck公司）；Na2HPO4、NaCl、氨水（分析纯，国药集团）。Cleanert PCX混合阳离子交换固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL，博纳艾杰尔科技公司）； 0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜（津腾公司）；实验样品为市售样品。
2.2 实验方法
2.2.1 标准溶液配制 分别准确称取各种标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到标准储备液，于
Symbolm@@ 18 ℃下避光保存。准确移取适量各标准储备液，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液逐级稀释成标准系列，其中4种内标浓度均为2.0 μg/L。
2.2.2 样品的提取与净化
称取粉碎并混合均匀的饲料样品（2.0±0.05） g于50 mL离心管中，分别加入100 μL内标（浓度为200 μg/L）、5 mL 1.0 mol/L Na2HPO4、5 mL饱和NaCl和5 mL乙腈溶液，振摇混匀后超声提取30 min，每隔10 min振摇一次。超声结束后离心5 min（4000 r/min），吸取上层乙腈于10 mL比色管中，下层再次加入5 mL 乙腈，摇匀后超声提取20 min， 离心5 min（4000 r/min），合并乙腈层，用乙腈定容至10.0 mL。移取乙腈提取液2.0 mL，40 ℃下氮吹至近干，加入3mL 1%甲酸水涡旋复溶后待净化。将上述溶液过柱（使用前依次用3 mL 1%甲酸甲醇、3 mL 1%甲酸水活化），依次用3 mL 1%甲酸水、3 mL 1%甲酸甲醇淋洗并抽干，最后3 mL 5%氨水甲醇洗脱。流速控制在1 mL/min以下。洗脱液在40 ℃下氮气吹至近干，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液定容至2.0 mL，过0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜后上机测试。
2.3 色谱质谱条件
2.3.1 色谱条件 柱温 40 ℃；进样量 2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A：0.3%甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5 min，0% B；0.5～8.0 min， 0%～65% B；8.01～10.0 min， 90% B；10.01～12.0 min， 0% B。
2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子模式；动态多反应监测（dMRM）；脱溶剂气温度200 ℃；脱溶剂气流速15 L/min；雾化气压力241.3 kPa； 鞘气温度350 ℃； 鞘气流速12 L /min；毛细管电压3.5 kV； 喷嘴电压 0 V。
3 结果与讨论
3.1 液相色谱及质谱条件的优化
各化合物分别采用约1 mg/L的标准品溶液直接进入质谱仪进行质谱参数的优化。本实验中的目标化合物多数具有胺基结构，易与质子结合，形成 [M+H ]+离子，因此采用正离子模式进行检测，并选择 [M+H ]+为母离子，响应最高的子离子作为定量离子，响应次高的离子作为定性离子。由于同时监测的离子对较多，采用动态多反应监测模式可以有效地分配扫描时间，保证每个色谱峰足够的采集点数以及灵敏度。莱克多巴胺与苯氧丙酚胺为同分异构体，具有相同质荷比的母离子及子离子，需优化液相色谱分离条件，避免两种化合物检测中的相互干扰。流动相中加入少量甲酸不仅可以改善色谱峰形，而且有利于目标化合物离子化，提高灵敏度。优化后的各种待测化合物的保留时间、定性定量离子、碰撞能量、监测时间窗口等参数见表1。
